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Artículo de método

Asimétrica Pasarela: Un Ensayo Novela conductual para Estudiar asimétrica Locomoción

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DOI:

10.3791/52921

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15 de enero de 2016

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1Neural Engineering Laboratory, Biomedical Research Center, West Virginia University School of Medicine

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para cuantificar el paso preciso en roedores. Las señales corticales y del generador de patrones centrales espinales son necesarias para la colocación precisa de los pies durante la locomoción obstruida. Informamos aquí sobre la novedosa tarea de caminar restringido que examina directamente el comportamiento preciso de los pasos.

Resumen

Ensayos de comportamiento se utilizan comúnmente para la evaluación de deterioro sensoriomotor en el sistema nervioso central (SNC). Los métodos más sofisticados para cuantificar los déficits locomotores en roedores es medir las perturbaciones hora de marcha sobre el suelo sin restricciones (por ejemplo., La puntuación de la acreditación manual o automatizado CatWalk). Sin embargo, las entradas corticales no son necesarios para la generación de locomoción básica producida por el generador de patrón central de la médula (CPG). Por lo tanto, las tareas para caminar sin restricciones prueba déficits locomotores por deterioro cortical motor sólo indirectamente. En este estudio, proponemos una novela, tarea locomotora pies colocación precisa que evalúa entradas corticales a la médula CPG. Una clavija vías instrumentado se utilizó para imponer tareas locomotores simétricas y asimétricas que imitan los déficits de movimiento lateralizado. Se demuestra que los cambios de equidistantes longitudes entre zancada de 20% producen cambios en las características de fase postura extremidad anterior durante la locomoción con preferrado longitud de zancada. Además, se propone que la pasarela asimétrica permite mediciones de los resultados conductuales producidas por señales de control cortical. Estas medidas son pertinentes para la evaluación de deterioro después de un daño cortical.

Introducción

Publicar tiempos morbilidad en la población sobreviviente incluye deficiencias motoras gruesas que representan un desafío para la evaluación cuantitativa de los seres humanos publican modelos de accidente cerebrovascular y animales de deterioro neurológico 1. En el ámbito clínico, estas deficiencias motoras se miden utilizando criterios subjetivos que son más sensibles a grave en lugar de moderado deterioro que presenta la mayoría de los pacientes. Del mismo modo, estas evaluaciones subjetivas de la conducta motora después de la lesión en los animales son comunes, por ejemplo., El Basso, Beattie y Bresnahan (BBB) ​​escala locomotora método de 2,3. Si bien estos métodos de evaluación subjetiva están ayudando traducción entre los estudios rehabilitación de la marcha en modelos animales cuadrúpedos y los seres humanos, los detalles de los déficits motores asociados con la actividad de los grupos musculares separadas no se evalúan. Por otra parte, la evaluación de la contribución cortical motor a la locomoción, como el culpable putativa de déficit motor en accidente cerebrovascular,sólo puede ser obtenido indirectamente incluso utilizando los más novedosos métodos cuantitativos automatizados 4,5, ya que se basan en la cancha abierta o tareas para caminar lineales. Estas tareas no requieren contribución cortical y pueden ser realizadas por los mecanismos neurales de la médula espinal, animales es decir, el generador de patrón central (CPG) de red que se ahorra en la mayoría de modelos animales de daño neuronal, por ejemplo, espinalizada 6 -.. 8 . Cortical contribución esencial a estos mecanismos espinales se ha implicado experimentalmente en tareas que requieren anticiparon ajustes posturales 9 y 10 alcanzan, así como precisa paso a paso 10.

Además, la mayoría el daño neurológico es asimétrica; por ejemplo, accidente cerebrovascular causa hemiparesia, es decir, debilidad en un lado del cuerpo, lo que resulta en una marcha asimétrica 11 -. 14. La asimetría de la marcha hemipléjica es producido por spatiotempor asimétricaactivación muscular al manifiesta más significativamente en el acortamiento de la fase de apoyo extensor asociada y el alargamiento de la fase de oscilación flexor asociada del ciclo de paso en el lado paretic 15,16. Esta tendencia aún no se ha explorado a través de una gama de velocidades del aparato locomotor en animales sanos o paréticos. En el estudio actual, se empleó el análisis de la fase de duración características 17 que describe la relación entre la duración de oscilación o postura de fases como una función de la duración del ciclo en cada paso. A continuación, el modelo de regresión lineal obtenida se describirá adicionalmente con un análisis de asimetría en todas las extremidades.

Se presenta un método de bajo costo novedoso para evaluar la actividad de descender entradas corticales en el sistema motor de animales cuadrúpedos basado en una tarea precisa locomotora paso a paso. Esta tarea está diseñado para desafiar la corteza motora mediante la imposición de exigencias sobre la colocación del pie sobre un rango natural de velocidades de marcha. en adición, Requisitos pies de colocación son manipulados para desafiar preferentemente el lado izquierdo o derecho del sistema motor. En una tarea locomotora similares, Metz y Whishaw (2009) examinaron las tasas de fracaso, el número de pasos perdidos en pasarela peldaño irregular, en ratas. Nuestro método es complementario a este estudio previo, y se detalla la calidad del control de la fase de "exitosa" 18 pasos.

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Protocolo

La siguiente paradigma de entrenamiento emplea el análisis de los ajustes de fase de la media de adultos rata Sprague-Dawley. Por favor, asegúrese de que el protocolo descrito en el presente documento está en conformidad con las directrices de su cuidado de los animales institucionales. Todos los procedimientos de este estudio se llevaron a cabo de acuerdo con el Cuidado y Uso Comité Animal Institucional (IACUC) y la Oficina para el Laboratorio de Bienestar Animal (OLAW) en West Virginia University School de Medicina y se rige por los Institutos Nacionales de Salud directrices para el uso de experimentación animales.

1. Equipo de instalación

  1. Construir la pasarela asimétrica como una caja de plástico con techo abierto arriostrados con aluminio apoya en cada esquina que mide 155 cm x 104 cm (Figura 1). Apoye los bordes superiores de la caja con barras de aluminio ranurados en ambos lados para permitir la colocación clavija alternativo, a lo largo del perímetro de la caja, de modo que cada clavija consecutiva en el mismo lado define la longitud de la zancada.
  2. Coloque una de 20 cm x 20 cm plataforma en cada esquina (cuatro en total) que separa las condiciones representadas en cada lado. Esta distancia debe ser suficiente para la inclusión de la distancia recorrida por un solo ciclo de paso rata.
    1. Usar las clavijas de aluminio con unas dimensiones de 20 cm x 1 cm x 0,5 cm. Doble la parte superior de cada clavija de 2,5 cm desde la punta para producir una plataforma de colocación de los pies.
    2. Asegure las clavijas a las barras estriadas utilizando soportes de deslizamiento interior a través de los agujeros mecanizados a la misma distancia para asegurar el nivel de colocación horizontal. Ajuste las posiciones con un destornillador y una regla. Utilice una anchura PEG 1 cm que corresponde aproximadamente al tamaño medio pata de la rata; clavijas más delgadas o más amplias son ya sea incómodo o aumentan la variabilidad colocación de los pies.
  3. Manipular la colocación clavija en cada lado para producir una de las tres condiciones de desafío escalonamiento precisas.
    1. Producir una tarea locomotor simétrica con una longitud de zancada 15 cm (SL15) mediante el establecimiento de la izquierda inter-zancada longitud (l ISL) y la longitud entre zancada derecha (r ISL) a la mitad de la longitud de zancada (7,5 cm).
    2. Imponer una condición simétrica adicional (SL12) cambiando l ISL yr ISL longitudes de 6,0 cm.
    3. Producir las tareas asimétricos cambiando la distancia entre las clavijas en los lados izquierdo y derecho, denominada la longitud inter-zancada. Para desafiar el sistema motor asimétrica, cambie el l ISL yr ISL en un 20% para imponer cortas longitudes entre zancada ya sea en la (condición L6R9) hacia la izquierda o de la derecha laterales (L9R6). Los 1,5 cm perturbaciones imponen una ISL l de 6 cm y r ISL de 9 cm para la condición L6R9, o un l ISL de 9 cm y una ISL r de 6 cm para la condición L9R6
  4. Para las ratas, mantener la longitud de la zancada para todas las condiciones excepto SL12 en una preferidas 15 cm.
  5. Para mayor comodidad, asignar a cada lado largo de la pasarela una condición asimétrica a favor de la izquierda o la rlado de vuelo del sujeto, mientras que la reserva de los dos lados cortos de la condición de control simétrico.
  6. Configuración de una cámara de alta definición con una frecuencia de muestreo de al menos 60 Hz por lo que la colocación de las extremidades en los soportes no esté obstruido con la cámara apuntando perpendicularmente a la calzada con el campo de visión que abarca alrededor de 7 pasos. Los primeros y últimos pasos en la proximidad a las plataformas son ignorados.

2. Capacitación sobre Aparato

  1. Utilice los recursos de formación estándar, por ejemplo., NIH Formación Básica Biomethodology para ratas de laboratorio, para familiarizarse con la formación del comportamiento general de los roedores.
  2. En el inicio de la formación, aclimatarse sujetos colocando y recompensarlos en la plataforma de 20 cm x 20 durante al menos 5 minutos. Entonces, guiar a los animales a través de un acuerdo de paridad con un 1 cm de longitud inter-paso a la siguiente plataforma por la presentación de un premio de comida. Recompensa animales verbalmente y con las caricias para llegar a la plataforma.
  3. After 5 carreras de entrenamiento, espacio las clavijas un extra de 1 - 2 cm de distancia y realizar los siguientes 5 carreras de entrenamiento. El número de repeticiones que aparece en este documento es suficiente para producir el tamaño de muestra estadísticamente apropiado (20 - 35 pasos).
    1. Si el animal adquiere la tarea más lentamente a juzgar por la coherencia de escalonamiento (sin parar) y la postura (espalda arqueada), a continuación, centrarse capacitación sobre el fortalecimiento de estas habilidades en las longitudes de zancada corta (S12) antes de reanudar el entrenamiento en las largas zancadas ( S15) con el tiempo acercándose a la longitud de la zancada deseado.
    2. Si el nuevo espaciado induce ansiedad o malestar con la tarea, vuelva a ajustar las clavijas a la configuración anterior y repetir el paradigma de la formación.
    3. Continúe con esta formación hasta que se alcancen las longitudes entre zancada apropiadas para que se cumplan las cuatro condiciones y normas del aparato locomotor. En nuestra experiencia, las ratas responden bien al estímulo vocal como señales para iniciar un juicio. La prueba se puede realizar en el mismo día como la formación proporcionadolos sujetos están motivados para realizar la tarea.
      Nota: Las normas del aparato locomotor son las siguientes: a pie es consistente y no implica paradas o pasos en falso; cabeza-meneo es mínima; la parte posterior es arqueado y la cola se eleva durante la locomoción; cada extremidad es claramente visible desde una vista ortogonal de la pasarela en el inicio y el desplazamiento de la fase de apoyo. Este proceso de selección es esencial, ya que el presente estudio se centra sólo en caminar en lugar de otro comportamiento Gaiting.

3. Pruebas y Análisis de Datos

  1. Animales de ensayo en tareas S12, S15, L9R6 y L6R9 (descritos en la sección 1.3) con diseño aleatorizado sesión. Utilice descansos para evitar la adaptación dentro de una tarea.
  2. Sesiones de grabación con cámara de alta definición con una frecuencia de muestreo de al menos 60 Hz. Grabaciones de vídeo de importación sin re-muestreo en el software de edición de vídeo y seleccionar sólo los combates a pie para su posterior análisis.
  3. Marcos inicios y finales de las fases cinemáticasen grabaciones de vídeo de cada sujeto.
  4. Aquí, utilizar el software personalizado llamado Vídeoa escrito en Matlab para identificar manualmente el tiempo de aparición posición y el desplazamiento para cada extremidad sobre una base de trama a trama, donde la aparición posición está indicada por la pérdida de desenfoque de movimiento asociado con la colocación del miembro en un tipo de cambio, y la postura de desplazamiento, que se producen al comienzo de la extremidad del despegue, es indicado por la primera evidencia de la falta de definición de movimiento.
  5. Calcular la duración de la fase de impulsión como el tiempo que queda entre dos inicios postura cinemáticas consecutivos. Excluir cualquier comportamiento no es consistente con la marcha cuadrúpeda de superficie, por ejemplo., Cuando la marcha contiene una fase de doble hoja (ambas extremidades anteriores o extremidades posteriores de la tierra), de procedimiento de análisis.
  6. Trazar la duración de cada fase como una función de la duración del ciclo paso correspondiente. Captura de la relación con el modelo de regresión lineal (tphase = B1 + B2 * Tc) obtenida para cada extremidad, donde Tc es la duración del ciclo, tphase es either Te postura relacionada extensor o Tf, que es el swing relacionados flexor-y B1 y B2 son constantes empíricas (offset y pendiente) del modelo de regresión.
    Nota: La pendiente (B2) representa la cantidad de cambio en la duración de la fase con el cambio en la velocidad de locomoción.
  7. Usar ecuaciones 1 y 2 (Figura 2C) para cada extremidad para calcular el índice de asimetría (AI). Ambas ecuaciones tienen la misma forma de una relación simple que normaliza la diferencia de dos valores para su suma.
    1. Utilizando la ecuación 1, calcular la diferencia horizontal (AI h) que utiliza la diferencia entre las pendientes de modulación de posición izquierda (L) y derecho (R) extremidades. Del mismo modo, el cálculo de la asimetría vertical (AI v) el uso de las pistas de adelante / anterior (a) y de vuelta / posteriores (p) extremidades. El resultado de la aplicación de estas dos ecuaciones es el conjunto de datos de 4 puntos xy correspondientes a 1) la asimetría de la extremidad anterior, AAI h; 2) la asimetría de las extremidades posteriores, PAI h; 3) dada la asimetría-extremidad anterior de las extremidades posteriores, Lai v; 4) asimetría extremidad anterior miembro posterior derecho, la RAI v.
    2. Trazar estos valores como un parche (Figura 2B) para la representación visual de la asimetría a través de todas las extremidades.
  8. Cálculo de los índices diagonalidad (DI) para evaluar acoplamiento diagonal entre parámetros de una extremidad anterior y su extremidad posterior contralateral (Ecuación 3, Figura 2C).
  9. Prueba de la DI, así como la diferencia de cuatro IA entre las condiciones de asimetría de oposición (ΔAI = | AIL9R6 - AIL6R9 |) para la significación estadística mediante un ANOVA de una vía con la comparación post-hoc de análisis de medios 19

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Resultados

La Figura 2 muestra el análisis de la asimetría durante las tareas locomotor en un solo sujeto representativo. Se calcularon los valores para todas las condiciones utilizando la Ecuación 1 y 2 de todos los sujetos individualmente (Figura 2) y de los datos de material compuesto de 8 ratas hembra Sprague-Dawley (250 - 400 g, Figura 3). Generalmente, la modulación de la fase de apoyo de la extremidad anterior era menor para el lado al que s...

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Discusión

La razón de ser de este estudio fue desarrollar una tarea conductual que evalúe cuantitativamente los cambios en el control preciso de las conductas locomotoras asimétricas. La existencia de la GPC espinal ha sido demostrada funcionalmente desde hace algún tiempo20, pero las características anatómicas y funcionales que describen su mecanismo, así como sus entradas moduladoras de vías descendentes o de retroalimentación sensorial, no se han caracterizado hasta la última década6,21,22. El consenso act...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Kriss Franklin, Amanda Pollard y Justine Shaffer ayudaron en el entrenamiento de animales y la recopilación de datos. Sarah Freeman y Alisa Ivanova contribuyeron al análisis de datos. Este estudio cuenta con el apoyo de WVU School of Medicine Start-Up, NIH/NIGMS U54GM104942 y NIH CoBRE P20GM109098.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
MATLAB® R2013aMathWorksPlataforma de diseño para vídeo personalizadoa software de anotación de vídeo
Sony HDR-CX380/B Handycam de alta definiciónSony27-HDRCX330/BDispositivo de adquisición de vídeo.
Jif Mantequilla de Cacahuete Cremosa - Sin Gluten 454 gJ.M. Smucker CompanyEstímulo de recompensa alimenticia.
Tableta de Sacarosa - Chocolate 1800 gTestDiet1811256Estímulo de recompensa alimenticia.
Palitos para roer madera de manzanitaBioServeW0016Para la presentación de estímulos de recompensa alimentaria.

Referencias

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