Cardiaca Presión-Volumen Análisis Loop Utilizando conductancia catéteres en ratones

Resumen

El análisis del bucle de presión-volumen cardíaco es la forma más completa de medir la función cardíaca en el corazón intacto. Describimos una técnica para realizar y analizar los bucles de volumen de presión cardíaca, utilizando catéteres de conductancia.

Resumen

El análisis del bucle de presión-volumen cardíaco es el "estándar de oro" en la evaluación de las medidas dependientes e independientes de la carga de la función ventricular sistólica y diastólica. Las medidas de la contractilidad ventricular y la distensibilidad se obtienen mediante el examen de la respuesta cardíaca a los cambios en la poscarga y la precarga. Estas técnicas se desarrollaron originalmente hace casi tres décadas para medir la función cardíaca en grandes mamíferos y humanos. La aplicación de estos análisis a pequeños mamíferos, como ratones, se ha logrado mediante la optimización de técnicas microquirúrgicas y la creación de catéteres de conductancia. Los catéteres de conductancia permiten estimar la reserva de sangre explotando la relación entre la conductancia eléctrica y el volumen. Cuando se realizan correctamente, estas técnicas permiten probar la función cardíaca en modelos de ratones mutantes genéticos o en estudios de tratamiento farmacológico. La exactitud y precisión de estos estudios depende de una cuidadosa atención a la calibración de los instrumentos, la realización sistemática de mediciones hemodinámicas y el análisis de datos. Revisaremos los métodos para realizar experimentos de bucle presión-volumen utilizando un catéter de conductancia en ratones.

Introducción

Análisis de bucle de volumen de la presión cardíaca proporciona información detallada de la función cardíaca y son el estándar de oro para la evaluación funcional ^1. Mientras que las técnicas de imagen como la ecocardiografía o resonancia magnética cardiaca proporcionan medidas funcionales, estas medidas son altamente dependientes de las condiciones de carga. Medidas independiente de la carga de la contractilidad cardíaca y la relajación requieren mediciones dinámicas de la presión ventricular y la relación volumen en un intervalo de precarga y la poscarga. Esta comprensión de la relación presión-volumen surge del trabajo pionero de Sagawa y colegas ^2,3. Demostraron en ex vivo corazones perfundidos canina que las medidas derivadas de la contractilidad del bucle presión-volumen fueron independientes de las condiciones de carga ^4.

En la aplicación in vivo de estos análisis se hizo posible con el desarrollo de catéteres de conductancia en los años 1980. Este avance técnico permitido Kass y sus colaboradores para llevar a cabo el análisis de bucle presión-volumen en humanos ^5,6. La miniaturización de los catéteres de conductancia y mejoras en las técnicas quirúrgicas en el finales de 1990 de ⁷ hizo el análisis de la función cardiaca roedor viable, lo que permite estudios genéticos y farmacológicos a realizar. Este avance tiene ya lugar a la utilización generalizada de análisis de bucle presión-volumen y ha generado una gran cantidad de información sobre la fisiología cardiaca de los mamíferos.

Un concepto clave en el uso de catéteres de conductancia y la interpretación de los datos obtenidos a partir de que es la relación entre el volumen y la conductancia. La conductancia es inversamente proporcional a la tensión, que se mide usando un catéter con electrodos colocados de manera proximal, por lo general colocados debajo de la válvula aórtica, y distalmente, en el ápice LV ^8. Los cambios en la tensión o de la conductancia se mide por cambios en la corriente que fluye desde proximal a distal del electrodo. Aunque la piscina de sangre contribuyens de manera significativa a la conductancia, la contribución de la pared ventricular, denominado conductancia en paralelo (V _p), a la conductancia medida se debe restar de obtener mediciones de volumen LV absolutos.

Los métodos para llevar a cabo esta corrección, llamada una calibración de solución salina, se discuten en el protocolo a continuación. La relación matemática entre la conductancia y el volumen, descrito por Baan y sus colegas, es que el volumen = 1 / α; (ρ L ²⁾ (GG _{p), donde} α = factor de corrección de campo uniforme, ρ = resistividad de la sangre, L = distancia entre los electrodos, G = conductancia y G _{p =} conductancia no sangre ^9. Es de destacar que el factor de corrección de campo uniforme en ratones se aproxima a 1,0 debido a los volúmenes de cámara pequeñas ^10. Junto con transductores de presión, el catéter de conductancia proporciona datos de presión y volumen simultánea en tiempo real.

Pressu Cardiacare-volumen de análisis presenta ventajas particulares sobre otras medidas de la función cardiaca, ya que permiten la medición de la función ventricular independiente de las condiciones de carga y de la frecuencia cardíaca. De carga independiente índices cardíacos específicos de la contractilidad incluyen: relación del volumen final de la presión sistólica (ESPVR), d P / d _t max relación volumen--end diastólica, elastancia máxima _(Emax) y precarga trabajo sistólico reclutable (PRSW). Una medida independiente de la carga de la función diastólica es la relación volumen de la presión diastólica final (EDPVR) ^11. El siguiente protocolo describe la realización del análisis de bucle de volumen de presión cardiaca, utilizando tanto la carótida y un enfoque apical. Si bien la metodología para llevar a cabo estos estudios se han descrito en detalle previamente ^8,11, vamos a revisar los pasos clave para obtener mediciones de presión-volumen precisos, incluyendo tanto la solución salina y la calibración cubeta de corrección, y proporcionar una demostración visual de thesprocedimientos e. La investigación con animales llevados a cabo para este estudio fue manejado de acuerdo a los protocolos aprobados y normas de bienestar animal de Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Duke Medical Center.

Protocolo

1. Preparativos conductancia catéter y calibración de presión

1. Conecte el catéter de conductancia al módulo catéter hemodinámica. Calibrar electrónicamente mediciones de la presión y el volumen mediante el registro de la presión preestablecida y el volumen establecido en el módulo de sonda. Grabar un rastreo de 0 mm Hg y 25 mm Hg (Figura 1A) y asignar las tensiones a ambos trazados de presión (Figura 1B y 1C). Del mismo modo, grabar un trazado volumen de 5 RVU y 25 RVU (Figura 1D) y asignar las tensiones a ambos trazados volumen (1E y 1F).
2. Confirme la calibración de presión electrónico con una calibración de presión manual, utilizando un esfigmomanómetro de columna de mercurio. Coloque el puerto manguito del esfigmomanómetro con una llave de paso de 3 vías. Llene un sistema de válvula hemostática de 3 puertos, a menudo utilizado para la angioplastia coronaria, con agua RT utilizando el puerto de lado.
   1. Coloque la punta de un catéter de conductancia en la válvula hemostática lleno de fluido y seguro suavemente ingenioHout retorcimiento del catéter. Conecte la válvula hemostática para el esfigmomanómetro e inflar hasta 200 mmHg y el bloqueo de 3 vías llave de paso. Examinar si la presión medida se corresponde con la presión de inflado del esfigmomanómetro.
3. Place catéter en solución salina calentada a 37 ° C que está en el nivel de la presión campo de operación y medir. Ajuste el control de presión hasta que las presiones registradas está en cero.

2. Anestesia / intubación

1. Administrar ketamina / xilazina (80-100 / 10 kg mg ^-1) como una inyección intraperitoneal.
   Nota: agentes anestésicos alternativos pueden ser utilizados. Una extensa lista de anestésicos se proporcionan en las revisiones anteriores de esta técnica ^11,12. Anestesia adecuada puede ser confirmado por pizca de cola suave.
2. Una vez anestesiado, afeitarse el cuello y el pecho con cortar el pelo y el lugar en una almohadilla caliente. Mantener la temperatura rectal del ratón en 36,5 a 37,5 ºC. Las bajas temperaturas del cuerpodará lugar a ritmos cardíacos deprimidos. Aplique ungüento para los ojos para evitar la sequedad
3. Haga una incisión en la línea media en el cuello y diseccionar los músculos traqueales para exponer la tráquea. Coloque un tubo endotraqueal a través de la boca, mientras que la visualización de la tráquea para asegurar la intubación, y conectar con el respirador.
4. Mantener ratón en el ventilador durante el procedimiento. Configuración del conjunto de ventilador basan en el peso de los animales a lo descrito previamente ^11. Volumen corriente (ml) = 6,2 x (peso de los animales en kilogramos) ^1.01 y la frecuencia respiratoria = 53,5 x (peso de los animales en kilogramos) ^-0.26.

3. Colocación de la conductancia catéter en la cámara LV

1. Enfoque de la carótida
   1. Para asegurar la esterilidad, dos conjuntos de instrumentos quirúrgicos estériles son uno Used- para la incisión inicial en la piel y uno para operar en la toracotomía. Los instrumentos deben ser descontaminados utilizando un esterilizador seco entre los animales durante una sesión quirúrgica individuo unand autoclave al final de cada día quirúrgico.
   2. Después de que la piel ha sido descontaminado con tres ciclos de un exfoliante de la piel Clorhexidina + alcohol (solución de alcohol / 70% de clorhexidina al 0,5%), realizar una incisión sobre la carótida derecha desde la mandíbula al esternón. Diseccionar el tejido circundante para exponer la carótida derecha, y cortar el nervio vago, que corre junto a la carótida.
   3. Coloque una sutura de seda 6-0 estéril alrededor del extremo distal (lejos del pecho) de la arteria carótida, la corbata y seguro. Coloque dos suturas adicionales debajo de la arteria carótida proximal (más cerca en el pecho) a la primera sutura, sin apretar atar la sutura media. Tire suavemente la sutura proximal y asegurar sujetando a la piel. Asegúrese de que la arteria carótida se ha sujetado tanto proximal y distal antes de proceder.
   4. Hacer una pequeña incisión en la arteria carótida R., proximal a la primera sutura, y se extienden longitudinalmente hacia el pecho.
   5. Inserte la punta del catéter de conductancia,empapado previamente en solución salina caliente durante 30 min, en el recipiente a través de la incisión y asegurar el catéter usando la sutura media.
   6. Avanzar suavemente el catéter en el ventrículo izquierdo a través de la carótida, mientras ve el bucle presión-volumen de rastreo para asegurar la colocación correcta.
      Nota: La ubicación óptima del catéter debe producir bucles de presión-volumen que aparecen rectangular (Ver Figura 2). Si se encuentra cualquier resistencia al paso del catéter, tire suavemente hacia adelante y avanzar de nuevo con una suave presión. Rotación suave del catéter puede ayudar con la colocación en el ventrículo izquierdo. Forzar el catéter de conductancia puede llevar a complicaciones cardiovasculares graves o daños al catéter.
   7. Record línea de base de presión-volumen bucles de ~ 10 min después de la colocación del catéter y el logro de un estado estacionario (Figura 2).
2. Enfoque Apical
   1. En un ratón anestesiado y ventilado, hacer una incisión from el proceso xifoides y cortar a través de la pared torácica lateralmente hasta que el diafragma es visible.
   2. Cortar aunque el diafragma y visualizar el vértice del corazón.
   3. Insertar el catéter de conductancia en el ápex del ventrículo izquierdo a través de una herida de arma blanca aguja (usando una aguja G 25-30), hasta que el electrodo proximal está justo en el interior del ventrículo.
   4. Record línea de base de presión-volumen bucles de ~ 10 min después de la colocación del catéter y el logro de un estado estacionario.

4. Varying poscarga Usando transitoria oclusión aórtica

1. Para realizar la oclusión aórtica transitoria, hacer una pequeña incisión horizontal en la parte superior del pecho y diseccionar el tejido circundante para exponer la aorta transversal.
2. Colocar una ligadura de seda 6-0 por debajo de la aorta transversal. Después de bucles de presión-volumen han regresado a la línea de base, junte ambos extremos de la sutura con una presilla de la aguja, suave y lentamente elevar la sutura durante 1-2 seg, y liberar lentamente la tensión.
3. Repita este procedimiento, hasta tres grabaciones óptimas separados están hechos del mismo animal.
   Nota: las grabaciones óptimas deben tener al menos 5 ciclos de bucle de volumen de presión y un aumento constante de la presión sistólica finales durante la aplicación de la tensión en la sutura (Figura 3A y 3C).

5. Variación de precarga Usando transitoria vena cava inferior Oclusión (IVC)

1. Para llevar a cabo la oclusión transitoria vena cava inferior, hacer una incisión horizontal debajo de la apófisis xifoides, debajo del diafragma para exponer la IVC.
2. Coloque una ligadura de seda 6-0 por debajo de la IVC. Después de bucles de presión-volumen han regresado a la línea de base, junte ambos extremos de la sutura con una presilla de la aguja; suave y lentamente aumentar la sutura durante 1.2 segundos, y suelte lentamente la tensión. IVC oclusión también se puede realizar por la aplicación suave de presión usando un hisopo de algodón con punta.
3. Repita este procedimiento hasta tres grabaciones óptimas separados son made del mismo animal.
   Nota: las grabaciones óptimas deben tener al menos 5 ciclos de bucle de volumen de presión y una caída constante de la presión diastólica final del ventrículo izquierdo durante la aplicación de la tensión en la sutura (Figura 4A y 4B).

6. Saline Calibración

1. En la conclusión del estudio, una conductancia en paralelo (V _p) valor puede ser obtener mediante la inyección de un bolo de 10 l de solución salina hipertónica (15%) en el animal a través de la vena yugular (Figura 5A y 5B).
   Nota: Esta bolo causará un aumento aparente en volumen con ningún cambio en la presión. Esta aparente cambio de volumen es el resultado de un cambio en la conductancia de la acumulación de sangre en lugar de debido a un aumento real en volumen. Una disminución transitoria de la dP / dt _max puede ser observado, como solución salina hipertónica tiene un efecto inotrópico negativo ^13. El V _p calculada se puede introducir en el volumen de la presión software de análisis de bucle a lo largocon los parámetros de calibración y cubeta para convertir de RVU en microlitros.

7. Cubeta de calibración

1. Para realizar una calibración de cubeta, coloque una cubeta con pozos de diámetros conocidos proporcionadas por el fabricante en una almohadilla eléctrica o un baño de agua se calienta a 37 ºC. Rellene los primeros 4-5 agujeros con sangre heparinizada caliente fresca de los ratones sometidos a evaluaciones hemodinámicas.
   Nota: Una calibración cubeta permite una evaluación precisa del ventrículo izquierdo charco de sangre utilizando la sangre de ratón y permite la conversión de los datos de volumen de RVU a microlitros.
2. Insertar el catéter de conductancia en el primer pocillo, hasta que se sumergen todos los electrodos. Mueva suavemente el catéter en el pozo, lo que generará la variación UVR.
3. Registrar los cambios de conductancia en el canal de volumen en UVR. Seleccionar la más alta RVU para la calibración.
   Nota: El volumen de los pocillos o bien se puede calcular mediante 1) utilizando la ecuación para el volume de un cilindro, donde el radio es el de la bien cubeta y la longitud se basa en la longitud entre los dos electrodos de detección de interiores o 2) el control en las instrucciones del fabricante. La salida de la conductancia se puede correlacionar con los volúmenes conocidos para desarrollar una ecuación de calibración que convierte los datos de RVU en ¹¹ microlitros.

8. Eutanasia

1. A la conclusión del protocolo, los ratones se sacrificaron por dislocación cervical, mientras que bajo anestesia.
2. Con el fin de asegurar la muerte, los ratones que tienen dislocación cervical sufrido deben someterse a un método secundario de la eutanasia. Utilizamos desangrado bajo anestesia, con la recolección de tejido cardíaco para la experimentación, o toracotomía bilateral bajo anestesia.

9. Análisis de datos usando Volumen Presión Loop Software de Análisis

1. Calcular V _p de Saline calibración
   1. Seleccione la presión y el volume bucles obtenidos durante la expulsión de la solución salina hipertónica (Figura 5A y 5B)
   2. Exportación bucles de software de análisis de volumen de presión. Elija la opción para la calibración Saline (Figura 5C)
   3. Registre el valor V _p calculado (Figura 5D).
      Nota: El _valor de p V se calcula mediante la identificación de la intersección del volumen 1) End-diastólica vs. volumen sistólico final de la calibración de solución salina y 2) línea de volumen volumen = final sistólica diastólica final. La intersección de estas líneas proporciona la V _p, que se calcula por el volumen de presión software de análisis de bucle.
2. Introduzca la conductancia de volumen (RVU) en relación con opciones de canales de volumen (Figura 1F)
3. Mida relación bucle presión-volumen de línea de base
   1. Seleccionar 8-10 ciclos cardíacos de los canales de presión y volumen, una vez se ha alcanzado el estado de equilibrio (Figura 2A) y la exportación a análisis suaveWare. Identificar 5-6 bucles final de la expiración (Figura 2B)
   2. Utilice el valor _p V para corregir la conductancia en paralelo. Elija la opción "Estado Estacionario" y generar una tabla resumen hemodinámica (Figura 2C)
4. Medida bucle relación presión-volumen durante la constricción de la aorta
   1. Seleccionar 8-10 ciclos cardíacos de los canales de presión y volumen que corresponden a la constricción de la aorta antes del aumento de las presiones telediastólica (Figura 3A) y la exportación de software de análisis. Identificar 5-6 bucles final de la expiración (Figura 3C)
   2. Seleccione el análisis "contractilidad" (Figura 3B), que calculará el volumen de presión Relación de fin sistólica (ESPVR)
5. Medida bucle relación presión-volumen durante IVC Constricción
   1. Seleccionar 8-10 ciclos cardíacos de los canales de presión y volumen que corresponden a IVC constricción (Figure 4A) y la exportación de software de análisis. Identificar 5-6 bucles final de la expiración (Figura 4B)
   2. Seleccione el análisis "contractilidad" (Figura 3B), que calculará precarga reclutable Trabajo Carrera (PRSW) (Figura 4C), Máximo dP / dt vs EDV (Figura 4D), así como la ESPVR y la relación volumen de la presión diastólica final (Figura 4E)

Resultados

Análisis bucle presión-volumen se puede utilizar para medir la función cardiaca en ratones modificados genéticamente o ratones sometidos a ^14,15 estudios ^fármaco 16. Bucles de volumen de presión representativos se proporcionan desde el trabajo publicado previamente ¹⁶ que investiga el efecto de ß-Arrestin sesgada ligando AT1R, TRV120023. Para probar si TRV120023 afecta a la función cardíaca in vivo, se realizó un análisis bucle presión-volumen en ratones de tipo salvaje que reci...

Discusión

Se describe un método para el análisis perfoming bucle presión-volumen con un catéter de conductancia en ratones, para derivar el análisis exhaustivo de tanto la contractilidad cardíaca y la relajación. Suga, Sagawa y sus colegas utilizaron presión-volumen bucles para definir medidas de la contractilidad cardíaca, específicamente la pendiente de la ESPVR, o la elastancia telesistólico _(s E), y E _máx. Elastancia, definido por la relación de la presión a volumen (P / V), varía a lo largo de la duraci...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
AnaSed (xilacina)	Lloyd Laboratories	NADA n.º 139-236	Anestésico
Ketaset (ketamina)	Pfizer	440842	Anestésico
VIP3000	Matrx Medical Inc.		Máquina de anestesia
Ventilador	Aparato Harvard Modelo	683	Equipo quirúrgico
Kit de tubos	Aparato Harvard	72-1049	Equipo quirúrgico
Manta homeotérmica	Kaz Inc.	5628	Equipo quirúrgico
Microscopio estereoscópico	Carl Zeiss Optical Inc.	Stemi 2000	Iluminador de Equipo
Quirúrgico	Cole– Parmer	41720	Equipo quirúrgico
Dumont n.º 55 Pinzas Dumostar	Fine Science Tools Inc	11295-51	Instrumentos quirúrgicos
Pinzas Graefe, curvas	Fine Science Tools Inc	11052-10	Instrumentos quirúrgicos
Pinzas Moria MC31	Fine Science Tools Inc	11370-31	Instrumentos quirúrgicos
Tijeras de mayo	Fine Science Tools Inc	14512-15	Instrumentos quirúrgicos
Tijeras de iris	Fine Science Tools Inc	14041-10	Instrumentos quirúrgicos
Portaagujas Halsey	Fine Science Tools Inc	12501-13	Instrumentos quirúrgicos
Olsen– Portaagujas Hegar	Fine Science Tools Inc	12002-12	Instrumentos
quirúrgicos tijeras de resorte	Fine Science Tools Inc	15610-08	Instrumentos quirúrgicos
almohadillas desechables	Kendall/Tyco Healthcare	1038	Suministros quirúrgicos
Esponjas de gasa estériles, estériles	Dukal	62208	Suministros quirúrgicos
Aplicadores con punta de algodón, estériles	Solon	368	Suministros quirúrgicos
Sutura quirúrgica,  seda, 6-0	DemeTECH	FT-639-1	Suministros quirúrgicos
Jeringas de insulina de 1 cc	Becton Dickenson	329412	Surgical Supplies Access
9 Válvula de hemostasia	Merit Medical	MAP111	Equipo hemodinámico
Esfigmomanómetro	Baumanómetro	320	Equipo hemodinámico
Millar Sistema PV MPVS-300/400 o MPVS Ultra (incluye cubeta de calibración)	ADInstruments Inc		Equipo hemodinámico
Catéter de conductancia 1.4F	ADInstruments Inc	SPR-839	Equipo hemodinámico
PowerLab 4/30 con Chart Pro	ADInstruments Inc.	ML866/P	Software hemodinámico
cortadora de animales	Wahl	8787-450A
Varios Tubos intradérmicos PE-10	Becton Dickenson	427401	Varios
Tubos intradérmicos PE-50	Becton Dickenson	427411	Varios
Surtido de agujas (calibre 18, 25 y 30; Thomas Scientific)			Miscelánea
0.9% (wt/vol) inyección de cloruro de sodio, USP)	Hospira	NDC no. 0409-4888-50	Miscelánea
Cinta			Miscelánea
Alconox (Alconox Inc.) para la limpieza de catéteres	ADInstruments Inc.		misceláneo