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Artículo de método

La fabricación de una funcionalizado magnética bacteriana NANOCELULOSA con nanopartículas de óxido de hierro

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DOI:

10.3791/52951

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26 de mayo de 2016

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1Department of Bioengineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Nuclear, Plasma and Radiological Engineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Micro and Nanotechnology Laboratory, University of Illinois at Urbana-Champaign, 4Program of Study and Control of Tropical Diseases (PECET), University of Antioquia, 5Sealy Center for Vaccine Development, University of Texas Medical Branch, 6WHO Collaborating Center for Vaccine Research, Evaluation and Training on Emerging Infectious Diseases, University of Texas Medical Branch, 7Beckman Institute, University of Illinois at Urbana-Champaign

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para hacer magnética una nanocelulosa bacteriana (BNC) para aplicaciones en la reconstrucción de vasos sanguíneos dañados. El BNC fue sintetizado por la cepa de G. xylinus. Por otro lado, la magnetización del BNC se realizó a través de la precipitación in situ de iones ferrosos Fe2+ y Fe3+ dentro de la malla BNC.

Resumen

En este estudio, NANOCELULOSA bacteriana (BNC) producido por la bacteria Gluconacetobacter xylinus se sintetiza y se impregna in situ con nanopartículas de óxido de hierro (IONP) (Fe 3 O 4) para producir un NANOCELULOSA bacteriana magnética (MBNC). La síntesis de MBNC es un proceso de múltiples pasos preciso y diseñado específicamente. Brevemente, NANOCELULOSA bacteriana (BNC) unas películas se forman a partir G. conservado xylinus cepa de acuerdo con nuestras necesidades experimentales de tamaño y morfología. Una solución de hierro (III) hexahidrato de cloruro de (FeCl 3 · 6H 2 O) y de hierro (II) tetrahidrato de cloruro de (FeCl 2 · 4H 2 O) con una relación molar 2: 1 se prepara y se diluye en agua de alta pureza desoxigenada. Una película BNC se introduce entonces en el recipiente con los reactivos. Esta mezcla se agita y se calienta a 80 ° C en un baño de aceite de silicona y hidróxido de amonio (14%) se añade a continuación, dejando caer para precipitar elferroso iones en la malla BNC. Esta última etapa permite la formación de nanopartículas de magnetita situ (Fe 3 O 4) dentro de la malla NANOCELULOSA bacteriana para conferir propiedades magnéticas a BNC película. Un ensayo toxicológico se utilizó para evaluar la biocompatibilidad de la película BNC-IONP. El polietilenglicol (PEG) se utilizó para cubrir los IONPs el fin de mejorar su biocompatibilidad. microscopía electrónica de barrido (SEM), las imágenes mostraron que el IONP se encuentra preferentemente en la fibrilla entrelazado espacios de la matriz BNC, pero algunos de ellos también se han encontrado a lo largo de las cintas BNC. mediciones de microscopio de fuerza magnética realizadas en el MBNC detectaron los dominios magnéticos de presencia con el campo magnético de alta intensidad y débil, lo que confirma la naturaleza magnética de la película MBNC. los valores del módulo de Young obtenidos en este trabajo son también en un acuerdo razonable con los reportados por varios vasos sanguíneos en estudios previos.

Introducción

El NANOCELULOSA bacteriana (BNC) es sintetizada por la cepa de Acetobacter xylinum, también conocido como Gluconacetobacter xylinus, y se deposita en forma de películas o unas películas sobre la interfaz aire-líquido durante el cultivo estacionario. Estos unas películas BNC adoptan la forma del recipiente en el que se cultivan, y su grosor depende del número de días en cultivo. A. xylinus utiliza la glucosa en el medio para la síntesis de las microfibrillas de celulosa a través de un proceso de polimerización y la posterior cristalización. La polimerización de los residuos de glucosa se lleva a cabo en la membrana extracelular de bacterias donde las cadenas de glucano se extruyen de los poros individuales distribuidos en la envoltura celular. La cristalización de las microfibrillas de celulosa se ​​produce en el espacio extracelular con la formación de las hojas de la cadena de glucano por van der Waals seguido por el apilamiento de las hojas por H-1 de unión.

Imánnanopartículas integrado del IC a una matriz de BNC se pueden manipular fácilmente por un campo magnético externo a fin de aumentar la fuerza necesaria para dirigir y confinar las células musculares lisas (CML) que contiene nanopartículas magnéticas, en el sitio dañado de la pared arterial. Esta estrategia mantiene el SMCs lejos de otros tejidos, y mantiene las células en su lugar contra la fuerza ejercida por el flujo de sangre. Se ha demostrado que las SMC juegan un papel importante en el vasoelasticity del vaso sanguíneo, donde forman abundantes capas situadas principalmente en la túnica media 2.

El método utilizado para la síntesis de MBNC implica BNC película sumerge y agita en una solución de hierro (III) cloruro (II) hexahidrato de cloruro de hierro y tetrahidrato en 80 ° C. se añadió hidróxido de amonio para formar nanopartículas de óxido de hierro en el interior de la malla BNC. La adición de hidróxido de amonio cambia el color de la solución de naranja a negro. El compacto IONPs juntos a lo largo de la fibrilla BNCs con una distribución no uniforme.

Este protocolo se centra en el diseño de una película bacteriana NANOCELULOSA-magnética de nanopartículas, lo que hemos llamado NANOCELULOSA bacteriana magnética (MBNC), que está destinado para su uso como un sustituto de la falta, los vasos sanguíneos de pequeño diámetro dañados o lesionados. SA Barud y colaboradores han publicado recientemente un trabajo similar para producir un documento magnética flexible basado BNC-BNC mezclando unas películas en una dispersión acuosa estable de PEG y nanopartículas de óxido de hierro superparamagnéticas 3. A continuación, describimos la producción de celulosa bacteriana y su impregnación in situ con nanopartículas magnéticas. Se utilizó un ensayo de citotoxicidad basado en la detección de roturas de cadena de ADN única para poner a prueba la biocompatibilidad de las unas películas BNC y MBNC.

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Protocolo

1. Preparación de Bacterial NANOCELULOSA (BNC)

Nota: Todos los pasos se llevan a cabo en condiciones asépticas, a menos que se indique lo contrario.

  1. Preparar medio de cultivo.
    1. Preparar 500 ml de medio de cultivo líquido mediante la combinación de 25 g de extracto de levadura, 15 g de peptona, 125,0 g de manitol y 500 ml de agua de alta pureza. Esta mezcla en autoclave a 120 ° C durante 20 minutos y se almacena a 4 ° C.
    2. Preparar 100 ml de medios semisólidos mediante la adición de 15 g de agar a 5,0 g de extracto de levadura, 3,0 g de peptona, 25,0 g de manitol y 100 ml de agua de alta pureza. Autoclave esta mezcla a 120 ° C durante 20 min. Una vez tratado en autoclave, el depósito 5 ml de la mezcla en un 90 mm x 16 mm de plástico placa de Petri. Permitir que la solución de gel a 4 ° C y se almacena a esta temperatura hasta su uso posterior.
  2. Rehidratar G. xylinus cepa conservada en viales liofilizados mediante la adición de 1 ml de medio de cultivo líquido y pipeteando arriba yhacia abajo, como se indica por las instrucciones del fabricante.
  3. Inocular las placas de Petri que contienen medios semisólidos con pequeñas gotas de suspensión bacteriana usando un asa de inoculación. Asegúrese de que el inóculo cubre toda la placa de Petri moviendo el bucle en una dirección zag zig desde el borde hasta el centro del plato.
  4. Se incuban las placas de Petri a 26 ° C durante 72 horas en una incubadora sin CO 2. Una vez que el período de incubación es completa, pequeñas colonias blancas son visibles. Si no se utilizan de inmediato las colonias, almacenar las placas de Petri a 4 ° C mediante el sellado de la tapa con Parafilm y la colocación de los platos al revés. Las colonias se pueden almacenar de esta manera para un máximo de 6 meses.
  5. Transferencia de 2 ml del medio de cultivo líquido preparado en la etapa (1.1.1) en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos. Tomar dos colonias con una aguja de inoculación de las placas de Petri inoculadas en el paso (1.3) y colocarlos en el primer pocillo de la placa de cultivo de tejidos. REPEAT el mismo procedimiento para los 23 pozos restantes.
  6. Incubar la placa de cultivo de tejidos a 30 ° C durante 7 días. Esto dará lugar a un total de 24 BNC unas películas con diámetro de 16 mm y un espesor de aproximadamente 2-3 mm de diámetro como se muestra en la Figura 1.
    Nota: No perturbar el cultivo bacteriano en cualquier momento durante el período de incubación, por ejemplo agitando las placas. Durante el período de incubación, G. xylinus extruye moléculas de azúcar de glucopiranosa para formar una malla cristalina polimérico en la interfaz aire-líquido, que adopta la forma y el tamaño del matraz bajo condiciones de cultivo estáticas. Esta matriz polimérica, conocida como NANOCELULOSA bacteriana (BNC), es visible al final del periodo de incubación.
  7. Recoger las unas películas BNC de los medios de crecimiento y esterilizarlos en 200 ml de solución de NaOH al 1% durante 1 hora a 50 ° C, con el fin de eliminar todo rastro de G. xylinus. Opcionalmente, esta solución se agita a 300 rpm usando una barra magnéticay una placa de agitación. Descartar la solución de NaOH y añadir 200 ml de solución recién preparada 1% de NaOH. Repita el mismo proceso una vez más o hasta que las unas películas BNC en solución adquiere un aspecto translúcido.
  8. Enjuague las unas películas BNC con agua tres veces y almacenarlos en agua de alta pureza a TA. Asegúrese de que las unas películas BNC se sumergen completamente en el agua y no se les permite secar en cualquier momento.
  9. Autoclave las unas películas BNC a 121 ° C durante 20 min.
    Nota: Un estudio subcutáneo in vivo en la rata realizado por Märtson y compañeros de trabajo mostró signos de no degradación de la BNC después de 60 semanas de la implantación. De hecho, BNC es degradable en la naturaleza por las enzimas microbianas y fúngicas, que están ausentes en los mamíferos. Por otro lado, la biodegradabilidad del BNC puede ser el resultado de procesos biológicos que debilitan la red de microfibrillas in vivo 4 mecánicas, químicas, y.

2. Síntesis del polímero recubiertoLas nanopartículas de óxido de hierro y su deposición en una membrana bacteriana NANOCELULOSA

  1. Burbuja 1.000 ml de agua de alta pureza con gas nitrógeno con el fin de eliminar cualquier oxígeno disuelto en el agua y reemplazarlo con nitrógeno.
  2. Use un matraz de tres bocas de fondo redondo para preparar una solución en una proporción de 2: 1 molar de hierro (III) hexahidrato de cloruro de (FeCl 3 · 6H 2 O) y de hierro (II) tetrahidrato de cloruro de (FeCl 2 · 4H 2 O) diluido con el agua de alta pureza desoxigenada. Por ejemplo, utilizar 5,4 g de FeCl3 · 6H 2 O y 1,98 g de FeCl2 · 4H 2 O en 10 ml de agua de alta pureza desoxigenada. Si esta preparación se vuelve demasiado viscoso y difícil de agitar, utilizar 0,54 g de FeCl 3 · 6H 2 O y 0,198 g de FeCl 2 · 4H 2 O en 20 ml de agua de alta pureza desoxigenada.
    Nota: Reducir el tiempo de exposición del FeCl2 · 4H 2 O al aire pesando esta chcompuesto emical lo más rápido posible. Una vez introducido en el matraz de fondo redondo de tres bocas, cerrar el matraz de tres bocas de fondo redondo con tapones de tabique hasta que está conectado al suministro de gas nitrógeno y el tubo del condensador.
  3. Use dos cuellos del recipiente para proporcionar una entrada y salida de gas nitrógeno constante mediante la conexión de la alimentación de gas nitrógeno a una aguja perforada en un tapón septum y fijado a cuellos del buque.
  4. Coloque 1 BNC película que se preparó anteriormente en el paso 1.5 (15,6 mm de diámetro y 2 a 3 mm de espesor) en el recipiente con los reactivos. Asegúrese de que la muestra está completamente sumergido en el líquido.
  5. Conectar el cuello restante del buque a un tubo condensador. Además, utilizar un tubo de secado lleno con sulfato de calcio anhidro en la parte superior del tubo de condensador. Deje correr el agua a través del tubo del condensador.
  6. Sellar todas las juntas de vidrio con grasa de vacío.
  7. Calentar la solución en un baño de aceite de silicona a 80 ° C utilizando una agitaciónplaca de cocción y mantener esta temperatura hasta el paso 2.10. Use una pequeña barra de agitación magnética para mezclar los reactivos a 350 rpm durante 5 min. Asegúrese de que el BNC está impregnado adecuadamente con la solución ferrosa y los reactivos se disuelven por completo. Mantener la agitación de la mezcla hasta el final del experimento.
    Nota: Utilizar un termómetro para verificar la temperatura del aceite de silicona. Debe ser estable a 80 ° C.
  8. Aumentar la velocidad de agitación a 700 rpm y añadir (dejando caer), en un intervalo de tiempo de 5 min, 5 ml de hidróxido de amonio (NH 4 OH, 14%) a los 10 ml de solución ferrosa usando una aguja de pipeteado, que ha sido también perforado en un tapón de septo. Después de la adición del hidróxido de amonio, el color de la solución cambia de amarillo / naranja a negro.
  9. Continuar agitando la solución a 80 ° C durante otros 5 min. Evitar agitación de alta velocidad con el fin de mantener la integridad de la muestra. Las altas velocidades, es decir, superior a 1000 rpm, pueden destruirla muestra.
  10. Bajar la temperatura de la solución a 30 ° C utilizando la parte inferior control de la temperatura de la placa caliente de agitación y se mantiene la agitación durante otros 5 min. A continuación, apague el plato caliente. En este punto, la IONP se han incorporado en la malla BNC.
  11. Enfriar la mezcla hasta RT y se separan las nanopartículas magnéticas (MNP) y BNC utilizando un imán permanente fuerte (por ejemplo, 1 Tesla). Para ello, transferir la mezcla a un matraz de recipiente y luego, mientras se mantiene el imán cerca del recipiente, mantenga la MNPs y el BNC en su lugar mientras decantar el sobrenadante.
    Nota: Tenga cuidado al manipular los imanes fuertes, ya que pueden ser perjudiciales cuando se usan incorrectamente. Para ver los pasos (2.12) - (2.14) y (2.16) utilizan el agua de alta pureza desoxigenada preparada anteriormente en (2.1) para evitar que las partículas de la oxidación.
  12. Resuspender el micronutrientes en polvo y BNC en 100 ml de agua. Agite suavemente la solución para eliminar todos los micronutrientes en polvo que no están firmemente incorporados en el BNC. Decantar los supernatant de nuevo mediante la celebración de la NPM y el BNC en su lugar con el imán.
  13. Lavar la NPM y las BNC varias veces con agua hasta que el sobrenadante alcanza pH neutro (pH ~ 7), como se mide usando una tira colorimétrica.
  14. Se separa la NANOCELULOSA bacteriana magnético funcionalizado BNC o magnético (MBNC) de la NPM con unas pinzas y enjuague el MBNC varias veces con agua hasta que el agua salga clara.
  15. Esterilizar el MBNC exponiendo el MBNC O / N a los rayos UV (110-280 nm).
  16. Autoclave de 500 ml de agua de alta pureza desoxigenada a 120 ° C durante 20 minutos y almacenan el MBNC en 20 ml de esta agua.
  17. Asépticamente, sumergir la muestra en el 1% de PEG y se agita durante 2 horas a temperatura ambiente (37 ° C). Este procedimiento mejora la biocompatibilidad y la estabilidad de las nanopartículas de óxido de hierro depositados en el BNC, específicamente aquellos expuestos en la superficie 5-7. El recubrimiento de PEG se distribuye en la red MBNC 3D.
    Nota: Desnudo IONP se oxida fácilmente en el airedebido a su alta actividad química 8. A pesar de que PEG se considera un material no biodegradable, su estabilidad química depende de las condiciones biológicas aplicadas, tales como contenido de agua, pH, temperatura, presencia de enzimas, las especies reactivas de oxígeno, especies reactivas de nitrógeno, y otros 9.

3. Caracterización del BNC y MBNC unas películas

  1. Propiedades mecánicas
    1. Realizar la carga normal y prueba de descarga de nanoindentación utilizando un indentador Berkovich. El radio de Berkovich indentador de diamante es de 20 nm.
    2. Utilice sílice fundida y tungsteno para calibrar área de contacto en función de la profundidad de indentación a TA. Durante la prueba, las muestras de montar sobre la ranura utilizando pegamento. El penetrador se acercó a las muestras en su dirección de espesor.
    3. Seleccionar al azar lugares de sangría en las superficies de las muestras. Evitar que el espacio entre los 2 guiones entre 200-300 mm.
    4. Se aplica la carga a lamuestras de los pasos y registrar el correspondiente desplazamiento del penetrador. Analizar la trama de carga vs profundidad para encontrar el módulo de Young.
    5. Llevar a cabo la prueba de nanoindentación de las muestras en presencia de agua desionizada (agua DI), y la prueba mediante la aplicación de tasas de carga entre 0,0001 mN / seg y 0,005 mN / seg, con picos de carga entre 0,01 y 0,60 mN mN.
    6. Utilice una celda líquida y mantener las muestras en el entorno de líquidos. Esta configuración única para la caracterización nanomecánica inmerso en un ambiente fluido es ideal para simular efectivamente el alcance funcionalidad biomecánica de las membranas BNC y MBNC.
  2. Caracterización estructural por SEM
    1. Caracterizar la estructura de fibra NANOCELULOSA por microscopía electrónica de barrido (SEM).
    2. Liofilizar las muestras durante 24 horas a -80 ° C. A continuación, montar en los espárragos SEM, por pulverización catódica con una película de Au-Pd durante 10 segundos y analizar el uso de SEM.
    3. Toma de imágenes con una ampliación de 22,000Xy 60,000X, con un voltaje de aceleración de 5 kV.
  3. dominios magnéticos
    1. Permitir las unas películas MBNC a completamente seco a temperatura ambiente, y posteriormente exponer durante 5 min a un imán permanente (1 Tesla).
    2. Inmediatamente, llevar a cabo las mediciones de fuerza magnética utilizando un bio-AFM de acuerdo con el protocolo del fabricante.
    3. Para cada medición, la captura en primer lugar las características topográficas y adquirir los dominios magnéticos durante una segunda pasada. Obtener ambas mediciones con el bio-AFM en modo de no contacto.
    4. Caracterización magnética de las nanopartículas se lleva a cabo utilizando vibración magnetómetro de muestra (VSM) en el sistema de mediciones de las propiedades físicas (PPMS) de Diseño Quantum, a temperatura ambiente (300 K), con un campo magnético en el intervalo de -10 000 a 10.000 Oe.
  4. citocompatibilidad
    1. Semillas humano las células del músculo liso de aorta (HASMC) en una placa de cultivo tisular de 6 pocillos a una densidad de 1.0x10 3 células / cm2 y se incuba durante 24 horas en presencia de las muestras de ensayo: unas películas BNC y MBNC (cada uno con un 15,6 mm de diámetro).
    2. Utilice poblaciones de células tratadas con peróxido de hidrógeno no tratados y como controles negativos y positivos, respectivamente.
    3. Realizar el ensayo de cometa de acuerdo con los protocolos del fabricante y las directrices sugeridas por A. Azqueta y AR 10 Collins.
    4. Utilice el colorante ácido nucleico SYBR Gold en este ensayo para intercalar y la etiqueta de fluorescencia del ADN contenido en las muestras a electroforesis según el protocolo del fabricante.
      Nota: Las células que no se someten a ningún daño en el ADN en presencia de muestras BNC y MBNC, mostrará un nucleoide redondo de color verde fluorescente, mientras que las células dañadas de ADN tendrán cometas de largo - muestras positivas tendrán Nucleoides (la cabeza del cometa) seguido de colas que contienen material de ADN fragmentado (porcentaje de ADN en la cola).

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Resultados

El período de incubación de G. xylinus era un total de 9 días, pero las unas películas comenzó a formarse antes y eran evidentes después de 2 días. La apariencia macroscópica de la BNC se muestra en la Figura 1, la forma de que imita la de la cultura plato de cosecha. Figura 2 describe el procedimiento para producir unas películas BNC-IONP, que resume las principales etapas implicadas en el protocolo anterior así como la configu...

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Discusión

El espesor y el tamaño de la película BNC pueden ser fácilmente manipulados por cambiar el tiempo de incubación y el tamaño del matraz en el que se cultiva durante el cultivo estático. Los micropropiedades del BNC, tales como la porosidad, se pueden modificar cambiando la proporción de oxígeno en el cultivo estático. Las concentraciones más altas de oxígeno producen más dura BNC 11. A. Bodin y compañeros de trabajo producen tubos de BNC con una presión de rotura de hasta 880 mm Hg cambiando la proporción de o...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por el Departamento de Defensa bajo el contrato No. W81XWH-11-2-0067

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Glucoacetobacter xylinusATCC700178
AgarSigma AldrichA1296-500G 
D-Mannitol BioxtraSigma AldrichM9546-250G 
Extracto de levaduraBD Biosciences212750
Peptona bacteriológicaSigma AldrichP0556
Hidróxido de sodio, solución al 50% en aguaSigma Aldrich158127-100G
Cloruro de hierro (III) hexahidratadoSigma Aldrich236489-100G 
Hidróxido de amonio Macron Fine Chemicals6665-46
Poli(etilenglicol), promedio Mn 400Sigma Aldrich202398-250G 
Cloruro de hierro (II) tetrahidratadoSigma Aldrich44939-250G
Placa de Petri DesechableSigma AldrichBR452000
Asa de Inoculación DesechableFisher Scientific22-363-604 
Sulfato de calcio anhidroW.A. Drierita Hammond 13001
Grasa de alto vacíoSigma AldrichZ273554-1EA
Aguja de pipeteo de laboratorio con extremos romos de 90°Sigma AldrichCAD7937-12EA
Tiras reactivas de pH   Sigma AldrichP4786-100EA
Matraz de destilación tipo ángulo de tres cuellos de fondo redondoSigma-AldrichCLS4965250
Aceite de silicona para baños de aceiteSigma-Aldrich85409-250ML 
Tubo de secadoChemglassCG-1295-01
Tapón de tabique, tipo manguitoChemglassCG-3022-98
Barra de agitación magnéticaChemglassCG-2001-05
CondensadorChemglassCG-1218-01
Controlador de temperaturaBriskHeatSDC120JC-A
de agitaciónFisher Scientific11-100-49SH 
Kit de ensayo CometTrevigen4250-050-K
SYBR Gold Nucleic Acid Gel StainLife TechnologiesS-11494
bio-AFMJPK InstrumentsNanoWizard 4a BioScience AFM
NanoindenterMicro Materials LtdProbador mecánico multimódulo 
Microscopía electrónica de barrido (SEM)Hitachi High Technologies AmericaHitachi S-4800
Placa calefactora

Referencias

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