Adaptación del Proceso Electrohilado para proporcionar tres ambientes únicos para un Tri-capa In Vitro Modelo de la pared de la vía aérea

Resumen

Los avances en las tecnologías de biomateriales permiten el desarrollo de construcciones tridimensionales de tipo multicélula. Hemos desarrollado protocolos de electrospinning para producir tres andamios individuales para cultivar las principales células estructurales de la vía aérea y proporcionar un modelo 3D in vitro de la pared del bronquiolo de la vía aérea.

Resumen

El electrospinning es un método altamente adaptable que produce andamios fibrosos porosos en 3D que pueden explotarse en el cultivo celular in vitro. Las alteraciones de los parámetros intrínsecos dentro del proceso permiten un alto grado de control sobre las características del andamio, incluido el diámetro de la fibra, la alineación y la porosidad. Mediante el desarrollo de andamios con dimensiones y topografías similares a las matrices extracelulares (MEC) específicas de órganos o tejidos, se pueden crear microambientes representativos de aquellos a los que las células están expuestas in situ.

La pared del bronquiolo de la vía aérea, compuesta por tres microambientes principales, se seleccionó como tejido modelo. Utilizando la ECM descelularizada de las vías respiratorias como guía, electrohilamos el polímero no degradable, tereftalato de polietileno (PET), mediante tres protocolos diferentes para producir tres andamios electrohilados individuales optimizados para el cultivo de células epiteliales, fibroblastas o de músculo liso. Utilizando un sistema de biorreactor disponible comercialmente, cocultivamos de manera estable los tres tipos de células para proporcionar un modelo in vitro de la pared de las vías respiratorias durante un período de tiempo prolongado.

Este modelo destaca el potencial de estos métodos para ser empleados en estudios de diagnóstico in vitro que investigan importantes mecanismos de diafonía intercelular o evalúan nuevos objetivos farmacéuticos, al proporcionar una plataforma relevante para permitir el cultivo de células adultas completamente diferenciadas dentro de entornos 3D, específicos de tejidos.

Introducción

El campo de la medicina regenerativa y la ingeniería de tejidos está avanzando rápidamente, con los avances en la tráquea y el riñón regeneración dos logros recientes notables. Los biomateriales desarrollados en la ingeniería de tejidos son cada vez más accesibles, con oportunidades para la transferencia de dichos protocolos a los laboratorios menos especializados. Un campo de cebada para beneficiarse a través de aumentar el uso de biomateriales es el diagnóstico in vitro.

Los estudios in vitro son una importante plataforma para investigar vías de señalización intracelulares en tipos de células individuales, y han ayudado a delinear mecanismos subyacentes numerosos fisiopatologías enfermedad. Estos estudios se basan generalmente en un solo tipo de células que se cultiva como una monocapa sobre plástico de cultivo de tejidos (TCP); un (2D) superficie rígida de dos dimensiones mucho menos elástica y porosa que las células (3D) entorno tridimensional están expuestos a dentro de un tejido u órgano. Los modelos animales han sido tradicionalmente correomployed para confirmar los efectos encontrados in vitro también traducir a todo el tejido, y también se puede utilizar como plataformas pre-clínicos para investigar enfermedades humanas. Sin embargo, entre las especies diferencias socavan esta confianza en los modelos animales en nuestra comprensión de las enfermedades humanas ^-. Por ejemplo, gran comprensión de la enfermedad pulmonar del asma se basa en un modelo de ratón pesar de las diferencias inherentes entre la condición humana y este modelo incluyendo poca evidencia de la infiltración de mastocitos del haz de músculo liso de las vías respiratorias, o la capacidad de desarrollo espontáneo de la enfermedad en el animal modelar ^3,4. También hay consideraciones éticas relacionadas con el uso de modelos animales, con la norma "3Rs" de "reemplazo, refinamiento y reducción" en la experimentación animal que está siendo alentado en el Reino Unido y otros países.

Una alternativa atractiva sería la recapitulación de los tejidos humanos en la estructura de creación vitros para investigar la naturaleza de cooperación entre los tipos de células humanas adultas en una sola unidad. Existen células en estructuras multicelulares 3D dentro del tejido, cada uno dentro de un micro-entorno único. El cultivo de las células en TCP sólo permite la cultura de monocapas de células, incapaces de replicar este entorno, o proporcionar la capacidad para la cultura de varias celdas. Biomateriales avance ofrece la oportunidad de desarrollar ambas plataformas 3D naturales y sintéticos para el cultivo celular. ECM descelularizado se puede utilizar para el cultivo celular 3D cuando recelularizado con otros tipos de células, incluyendo células madre ^1, sin embargo, tales protocolos pueden ser complejo y consume mucho tiempo, con la disponibilidad de tejido limitada y en gran parte de origen no humano. Otros protocolos permiten un mayor control sobre los entornos celulares creados como nanoimpresión, la deposición de ECM, las tecnologías de la hoja de la célula, o electrospinning. Electrohilado crea esteras porosas no tejidas 3D de fibras con diámetros que van desde nanómetros a micrómetros, replicating dimensiones ECM naturales. Andamios electrospun se están empleando cada vez más como plataformas de cultivo de células en 3D ^-. La manipulación de los parámetros de electrospinning permite el control intrincada sobre características de andamio, tales como tamaño de poro, diámetro de la fibra, la topografía y la alineación, y la química de superficie. Alteraciones de tales parámetros han sido demostrado que afectan directamente la adhesión celular y el crecimiento, cuando las células se cultivaron en el aislamiento.

Estas ventajas han sido explotados en el presente estudio para permitir el cultivo de múltiples tipos de células como una sola construcción de tejido 3D, utilizando el bronquiolo de las vías respiratorias como una estructura de tejido 3D modelo. La pared bronquiolo consta de tres regiones principales (Figura 1). La mucosa es donde las células epiteliales de las vías respiratorias se sientan en la interfase aire-líquido (ALI), proporcionando una barrera importante para el medio ambiente externo. Ellos residen en la membrana basal reticular (RBM), una ECM bien compacta compone principalmente de collagen IV, perlecans, y lamininas. La capa de sub-mucosa se encuentra directamente debajo de la mucosa, una región más porosa compuesta de múltiples tipos de células, incluyendo fibroblastos, miofibroblastos y la infiltración de leucocitos en condiciones de enfermedad. Finalmente haces musculares lisas envuelven alrededor de la vía aérea en una forma helicoidal, y se componen de hojas alineadas de músculo liso de las vías respiratorias (ASM). Es estado contráctil relativa del músculo liso que controla el tono de las vías respiratorias. El empleo de andamios electrospun dentro del sistema pulmonar había hasta hace poco ha limitado a fines regenerativos; con una sustitución traqueal electrospun siendo trasplantado con éxito. Mientras éxito, tales tratamientos son limitados en número, y se centran en la tráquea debido a la naturaleza relativamente simple de la función del tejido. Existen ejemplos limitadas de los modelos de la vía aérea se utilizan para diagnóstico in vitro, y se centran principalmente en las mediciones de contracción del músculo ^liso,. El no tóxico y non-degradable tereftalato de polietileno polímero (PET) ha sido previamente electrospun, y fue empleada en el presente estudio para asegurar andamios producidos podrían ser almacenados por largos períodos sin degradar (lo que les permite ser utilizados "off the shelf"), y también pueden ser adecuados para el cultivo celular estable durante períodos de tiempo prolongados. Los estudios previos de nuestro grupo han demostrado que el empleo de tres variaciones de un protocolo básico de electrospinning, tres andamios electrospun PET individuales pueden ser producidos para proporcionar topografías óptimas para el cultivo de las vías respiratorias epiteliales, fibroblastos y células del músculo liso en el aislamiento ^21,22 y el cocultivo de las vías respiratorias células epiteliales y fibroblastos ^22. Diámetro de fibra se encontró que afectará en gran medida la funcionalidad del epitelio ^22, y la alineación de la fibra permite la generación de hojas alineadas de músculo liso ^21. Estos estudios se realizaron de forma independiente el uno del otro en condiciones estáticas. En el presente estudio, estos difereandamios NT, que contienen células humanas adultas completamente diferenciada han sido cocultivadas durante una semana a la ALI en un biorreactor disponible comercialmente como una sección 3D de la pared de las vías respiratorias, proporcionando un fisiológicamente relevantes modelo in vitro para investigar las vías respiratorias respuestas inter-celulares. Mientras que este protocolo está utilizando el bronquiolo de las vías respiratorias como un sistema modelo, podría ser adaptado como una plataforma para el cocultivo 3D de unidades de la mucosa de otros órganos.

Protocolo

ASM células primarias de individuos no asmáticos fueron aisladas de biopsias bronquiales en el Hospital Glenfield (Leicester, Reino Unido) como se describe anteriormente. La investigación fue aprobado por el Comité de Ética de Leicestershire y los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito.

1. Electrohilado PET Andamios (Figura 2)

1. Preparar una solución (10 ml) de la botella de bebida de grado PET en un 1: 1 diclorometano (DCMro) - ácido trifluoroacético solución (TFA). Se requieren concentraciones de PET de 8%, 30% y 10% peso / volumen (peso / vol) para nanofibras, microfibra y andamios alineados respectivamente y luego se agita la solución de O / N a TA durante la PET se disuelva.
2. Transferir la solución de PET en una jeringa y adjuntar un 23-G (para nanofibras) o un 18-G (para microfibra y alineado) aguja a la jeringa y coloque la jeringa en una bomba de jeringa motorizada. Asegúrese de que la punta de la aguja se hace girar a la parte inferior.
3. Coloque el mandrel 15 cm de distancia de la punta de la aguja, lo que garantiza que la aguja está orientado hacia el centro del tambor.
4. Conecte el suministro de electricidad a la punta de la aguja con pinzas de cocodrilo y tierra el mandril (vía el zócalo de plátano) a la tierra. Conectar la fuente de alimentación al mandril y velocidad ajustada a 60 rpm (equivalente a aproximadamente 13,2 m · min ^-1) para nanofibras y microfibra andamios. Velocidad establecida para 2000 rpm (equivalente a aproximadamente 440 m · min ^-1) andamios para alineados.
5. Ajuste la bomba de jeringa a una velocidad de flujo de 0,5 ml · h ^-1 para nanofibras andamios azar y alineados o 2.0 ml · h ^-1 para andamios de microfibra. Deje que la bomba funcione hasta que la solución se extruye desde la punta de la aguja con el fin de eliminar el aire en la aguja. Luego parar la bomba.
6. En la bomba de jeringa, ajustar el volumen total de la solución a ser expulsado a 2 ml y arrancar la bomba.
7. Conjunto de alimentación de tensión de 14 kV, y el interruptor en la supl poderly.
8. Electrospin hasta que ha sido electrospun 2 ml de solución (4 h para andamios nanofibras y alineados, 1 hr para andamios de microfibra).
9. Cortar el andamio con una cuchilla a lo largo de la anchura del mandril. Esto produce una hoja 2D de andamio el tamaño del área de superficie del mandril (en este caso, una hoja rectangular 22 cm x 11 cm) que puede ser cuidadosamente se quitó el mandril). Guarde el andamio en papel de aluminio para reducir la carga electrostática).
   Nota: Los andamios bifásicos son producidos por secuencial electrospinning un andamiaje de nanofibras directamente sobre un andamio de microfibra.

2. Esterilización de andamios antes del uso en cultivo celular

1. De la hoja de andamio, perforar discos de andamios bifásicos o alineados utilizando una biopsia de la pluma 0,8 mm de diámetro y se adhieren a la empaquetadura usando pegamento acuario no tóxico.
2. Esterilizar andamios utilizando irradiación ultravioleta durante 30 min en cada lado de los andamios antes de sumergirse en un 20% Vol / vol solución antibiótica / antimicótica (2x10 ml ^{-1 5} unidades de penicilina G, 2.000 mg ml ^-1 de sulfato de estreptomicina y 500 mg ml ^-1 anfotericina B) O / N a 4 ° C.
3. Lave los andamios con PBS 3 veces, y luego almacenar los andamios en placas de pocillos TCP en PBS a 4 ° C hasta su uso.

3. Teléfonos Constituyentes Cultura Medios

1. Células epiteliales Cultura CALU3 en medio DMEM-F12 suplementado con suero de 10% vol / vol de ternera fetal (FCS), solución 2 nM L-glutamina, 1% vol / vol antibiótico / antimicótico solución (10.000 unidades ml ^-1 penicilina G, 100 mg ml ^-1 de sulfato de estreptomicina y 25 mg ml ^-1 anfotericina B).
2. Cultivo de fibroblastos y células ASM MRC5 en medio DMEM suplementado con suero de 10% vol / vol de ternera fetal (FCS), solución 2 nM L-glutamina, 1% vol / vol antibiótico / antimicótico solución (10.000 unidades de penicilina G ml ^-1, 100 mg ml ^-1 de sulfato de estreptomicina y 25 mg ml ^-1 anfotericina B).
3. Cultura co-cultivos de células epiteliales, fibroblastos-ASM en un DMEM-F12 70:30: mezcla de medio DMEM.

4. Siembra de fibroblastos y células epiteliales en bifásica Andamios

1. En una placa de cultivo de tejidos, remojar los andamios en medio suplementado DMEM-e incubar a 37 ° C durante 1 hora antes de la siembra de células.
2. Retire los medios suplementados con DMEM, coloque la fase de microfibra de andamio apical y sembrar 1.5 x10 ⁴ MRC5 células de fibroblastos en 30 l de medio suplementado-DMEM. Agite la placa en un agitador orbital durante 2 horas, antes de salir en una incubadora a 37 ° C 5% de CO ₂ en el aire O / N.
3. Gire el andamio sobre lo que la fase de nanofibras de andamio enfrenta apical, semillas 3.0 x10 ⁴ CALU3 células epiteliales en 30 l de los medios de comunicación-F12 suplementado DMEM en la fase de nanofibras del andamio y se incuba for 2 horas a 37 ° C, 5% de CO ₂ en el aire antes de sumergirse en el andamio 70:30 DMEM-F12: DMEM suplementado con medios de comunicación O / N antes de transferir al biorreactor.

5. La siembra de células ASM en la Alineados Andamios

1. En una placa de cultivo de tejidos, remojar los andamios en medio suplementado DMEM-e incubar durante 1 hora a 37 ° C antes de la siembra 2,5 x10 ⁴ células en 30 l de medio suplementado DMEM-e incubando durante 2 hr (37 ° C, 5% de CO ₂ en el aire). Sumerja andamio a cambio medio suplementado-DMEM a la incubadora y dejar O / N antes de la creación de una cultura tri en el biorreactor.

6. Configurando el Tri-cultivo utilizando el Sistema de biorreactor (Figura 7)

1. Coloque la junta andamio bifásica en la ranura dentro de una cámara con la fase epitelial hacia arriba en la cámara.
2. Coloque el andamio alineados debajo del andamio bifásica (por lo que es adyacente a la microfiber fase del andamio bifásica) y bloquee las dos cámaras del biorreactor juntos.
3. Montar dos circuitos de flujo de perfusión conectados a dos depósitos medianas (medio suplementado DMEM-F12-en reservorio apical, DMEM-F12 / DMEM-medios suplementados en depósito basal) y medios de comunicación de la bomba alrededor de los dos circuitos en aproximadamente 0,1 ml / min usando una bomba peristáltica (40 ml de medio se recicla a través de cada circuito). Casa todas las partes del sistema dentro de una incubadora a 37 ° C, 5% de _CO2 en aire.
4. Después de una semana, retire el soporte de la cámara apical, y la cultura de las células epiteliales en el ALI durante una semana más antes de su análisis.

Resultados

Imágenes de microscopio electrónico de barrido de los tejidos de las vías respiratorias descelularizado o imágenes inmunohistoquímico de las biopsias de las vías respiratorias identificados características deseables de la ECM vía aérea hemos querido introducir en topografías de andamios electrospun: matriz de RBM nativo consta de fibras de aproximadamente 153 nm ± 30,6 nm (media ± SD n = 50 mediciones ) de diámetro (Figura 3A y 5A), mientras que la matriz que rodea el RBM era más porosa en la naturaleza (Figura 3C). Inmunohistológicos secciones a través de haces musculares lisas muestran ASM presente como hojas alineadas de células ²¹ (Figura 3E). Esta información fue utilizada para guiar las características introducidas en los andamios electrospun. Un mandril giratorio era capaz de girar de forma estable a altas velocidades (> 2000 rpm / 440 m · min ^-1) para producir andamios con fibras alineadas. Rotación mandril lenta (60 rpm 13,2 m · min ^-1) no afectó la orientación de las fibras, Sino que se produce andamios con espesor más uniforme que cuando electrospinning sobre una placa estática. Mediante la alteración de los parámetros de electrospinning (concentración PET y caudal de la solución), fue posible para crear fibras de andamios con diámetros de varios micrómetros o cientos de nanómetros (electrospinning parámetros se indican en la Tabla 1).

Electrospun fibras con diámetros de fibra equivalentes a las fibras naturales de GBR (150 nm) se produjo usando una solución de PET 6%, sin embargo a concentraciones tan bajas de PET, el gotear de las fibras se produjeron (Figura 4A). Esta fue eliminado mediante el aumento de la concentración de la solución de PET a 8%, lo que produce nanofibras uniformes que posee un diámetro medio de 255 nm ± 2,4 nm (media ± SEM) y el tamaño medio de poro de 1,43 micras ± 0,02 micras (figuras 4B, 5A y B). Para electrospin nanofibras fue necesario reducir el tamaño de la aguja de 18 G a 23 G, lo que permite velocidades de flujo más lentas whilst mantener una velocidad de flujo superior y reducir la obstrucción de la aguja, un problema recurrente con la aguja más grande. Cuando electrospinning microfibras, un aumento en la solución de PET a> 30% de plomo PET a una falta de uniformidad en fibra de diámetro (Figura 4F), además de múltiples bloqueos en la punta de la aguja debido a la alta viscosidad de la solución. Esteras de microfibra uniformes que poseen un diámetro promedio de fibra de 2,50 m ± 0,02 m (media ± SEM) y el tamaño medio de poro de 10,45 micras ± 0,13 micras fueron producidos cuando electrospinning una solución PET peso / vol 30% a una velocidad de flujo de 2 ml / h ^-1 (figuras 4F, 5A y B). Electrospinning secuencial del andamiaje de nanofibras directamente sobre un andamio de microfibra (todavía unido al mandril) creó un andamio bifásica (Figura 3D). Los diámetros medios de fibra eran 280 nm ± 20 nm y 2,30 m ± 0,06 m para las fases de nanofibras y microfibras respectivamente,comparable a las dimensiones de nanofibras y microfibras andamios individuales. Además, el espesor de la andamio bifásica fue similar a la suma de las nanofibras y microfibras andamios individuales (Figura 5C). Mediante el aumento de la velocidad de mandril (2000 rpm / 440 m · min ^-1), se produjeron nano o microfibra andamios altamente alineados. La solución PET peso / volumen 8% no era óptima para la producción de nanofibras alineados y fibras producidas poseen una morfología de onda (Figura 3F). Un aumento de 10% de PET anuló este efecto, pero aún así resultó en un diámetro de fibra reducida (216 nm ± 2,2 nm (media ± SEM)) en comparación con las nanofibras andamios alineadas al azar. Alineación de la fibra se calculó mediante la determinación de la desviación del ángulo de cada fibra de la fibra de ángulo medio. En andamios nanofibras alineados 79% de fibras fueron alineados (± 10 ° de ángulo de fibra media) en comparación con el 10,2% de fibras en alineadas al azar Scaff nanofibrasedad (Figura 5D).

El andamiaje de nanofibras 8% se utilizó para recapitular la RBM en el que residen las células epiteliales, y fue utilizado para apoyar el cultivo de células CALU3 (una línea celular epitelial de las vías respiratorias). El peso / vol andamio de microfibra 30%, siendo más poroso en la naturaleza se utiliza para imitar la región sub-mucosa, y se cultivó con células MRC5 (una línea celular de fibroblastos-vías respiratorias). El 10% p / v andamiaje nanofibras alineados proporcionado referenciación topológica para asegurar la alineación de células ASM cuando se cultivan en el cadalso. Todos los tres tipos de células mostraron un aumento en la viabilidad cuando se cultivan en sus andamios individuales durante un período de 2 semanas (Figura 6A), y expresaron las proteínas específicas del tipo de célula después del período de 2 semanas de cultivo (Figura 6B, 6C, y 6D). Además de la caracterización de las interacciones individuales celular andamios han sido reportados en otros lugares ^21,. El electrospinning secuencial del andamiaje de nanofibrasen el andamio de microfibra produjo un andamio bifásica para el cocultivo de las células epiteliales CALU3 y células de fibroblastos MRC5 en las fases de nanofibras y microfibras respectivamente. El cultivo de las dos células juntos bajo condiciones estáticas se ha informado en otras partes ^22. Más trabajo de intentar agregar otras capas de células o extender los tiempos de cultivo bifásicos más allá de 2 semanas bajo condiciones estáticas no tuvo éxito (datos no mostrados). Para la cultura un modelo de tres capas que durante un período prolongado, se utilizó un biorreactor de flujo de perfusión. El CALU3 y MRC5 células fueron sembradas en el andamio bifásica, y las células ASM sembradas en un andamio alineados, y ambos se cultivaron por separado durante 2 días. Los dos andamios fueron comprados juntos para formar un modelo de tres capas de la pared de las vías respiratorias dentro del biorreactor (Figura 7). Ambas cámaras fueron perfundidos con los medios de comunicación durante 7 días antes de la cámara epitelial apical tenía sus medios de comunicación eliminan, y las células epiteliales se cultivaron en elALI durante 7 días. Los andamios se fijaron y seccionaron y se tiñeron o bien, andamios o enteros se inmunotiñeron para los marcadores específicos de células. Secciones a través de la cultura tri-capa mostraron núcleos de células distribuidas a través de las tres capas de la cocultivo (Figura 8B). Cuando las células se inmunotiñeron para los marcadores específicos de células, las células epiteliales poblaron la fase de nanofibras como una célula apical-capa confluente y se tiñeron positivas para citoqueratina (Figura 8C), en la fase de microfibra, fibroblastos tiñeron positivo para S100A4 (Figura 8D), y en los 10% de células ASM andamio alineados manchadas positivo para SM22α (Figura 8E), lo que indica una buena supervivencia de cada tipo de célula en el modelo 3D de la pared de la vía aérea.

Figura 1. El bronquiolo de las vías respiratorias. Biopsia bronquial de una gravevías respiratorias asmáticas que muestra el epitelio de la membrana basal reticular (RBM), con la región submucosa subyacente poblada con células mesenquimales, y los haces de músculo liso que rodean pobladas con células de músculo liso teñidas para alfa-actina de músculo liso (marrón). La barra de escala indica 200 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Un diagrama esquemático del equipo de electrospinning. Una jeringa que contiene la solución de polímero / disolvente (con aguja fija) se coloca en una bomba de jeringa frente al mandril. Un potencial eléctrico se establece entre las fibras de la aguja y el mandril causando a ser expulsado de la punta de la aguja y depositado sobre el mandril giratorio. A medida que la fibra pasa a través de la atmósfera,el disolvente se evapora causan la deposición de fibras de polímero en el mandril. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Comparación de los andamios electrospun a ECM de las vías respiratorias nativo. Imágenes de microscopio electrónico de barrido de la membrana descelularizado sótano (A), de las vías respiratorias descelularizado bronquiolo sección transversal (C) y una sección histológica de un paquete de músculo liso de las vías respiratorias (teñidas con hematoxilina y eosina, escala barra de 40 micras) (E) en comparación con nanofibras (B) bifásica (D) y alineados (F) andamios PET. Haga clic aquí para veruna versión más grande de esta figura.

Tabla 1. Parámetros utilizados para electrospinning la microfibra, nanofibras y alineados andamios de forma individual y para el andamio bifásica.

Figura 4. La alteración de las concentraciones de PET afecta características de la fibra. Imágenes de microscopio electrónico de barrido de andamios electrospun hiladas a partir de 6%, 8%, 10% (AC), 25%, 30% y 35% (EG) (peso / volumen) de soluciones de PET . También se muestran los andamios alineados producen a partir de 8% (D) y el 30% de soluciones de PET (H) en peso / vol. AD fotografiada con una ampliación 5.000x, EH fotografiado con una ampliación 1.000X. Por favor, haga clic aquí para ver una mayorversión de esta figura.

Figura 5. Propiedades de los andamios de PET. Electrospun curvas (A) de distribución que muestran la distribución de diámetro de la fibra de la membrana basal reticular la matriz extracelular (ECM RBM), andamios nano y micro-fibras alineadas al azar, y el andamiaje de nanofibras alineados. (B) del histograma muestra la distribución de tamaño de poro relativa en nano y micro-fibra de andamios. (C) Espesor medio de las nanofibras, microfibra, andamios bifásicos y alineados (media ± desviación estándar, n = 6). (D) histograma que muestra la desviación de la orientación media de fibra en nanofibras andamios aleatorios o alineados análisis de fibra Andamios se llevó a cabo utilizando el software ImageJ. Parrendar clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6. La cultura de los tipos de células individuales en los andamios individuales. (A) Resultados de ensayo de viabilidad celular alamarBlue para las células ASM en andamios alineados, las células CALU3 en andamios nanofibras y células MRC5 en andamios de microfibra (media ± SEM, n = 3- 20). Imágenes de microscopio electrónico de barrido de la nanofibra, microfibra y andamios fibra alineados (B, C y D, respectivamente) y las imágenes de inmunofluorescencia de células teñidas CALU3 para E-cadherina (rojo), MRC5 células teñidas para vinculina (rojo) y las células ASM manchadas de SM22α (rojo) todo en su andamio especializada (E, F y G respectivamente). Hoechst fue utilizado para teñir los núcleos (azul), barra de escala indica 40 &# 181;. M Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7. sistema de perfusión para el modelo de la pared de la vía aérea tri-capa. (A) Fotografía del recipiente biorreactor conectado a la bomba peristáltica y embalses medios 2x. (B) Esquema de los andamios tri-capas. (C) Esquema de los dos circuitos de biorreactor cuando el modelo de la vía aérea se mantiene en la interfase aire-líquido. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8. Completar 3D modelo de la pared de la vía aérea. (A) biopsia bronquial de la pared de la vía aérea con la capa mucosa resaltado en rojo, la región submucosa resaltado en verde, y el haz del músculo liso de relieve en oro. (B) Sección a través de la pared de la vía aérea de tres capas que consiste en andamios bifásicos y alineados pobladas con epiteliales, fibroblastos y células musculares lisas fijos después de 2 semanas cocultivo. Los núcleos celulares se tiñeron con DAPI (azul) con reflectancia andamio (gris) al mismo tiempo fotografiado. Los andamios también se fijaron y immunostained para marcadores específicos de células después de 2 semanas, con células CALU3 teñidas para citoqueratina (verde) (C), MRC5 células teñidas para S100A4 (verde) (D), y las células musculares lisas teñidas para SM22α (rojo) ( E). La barra de escala indica 200 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Mesa 1.

Discusión

La capacidad de electrospin fibras poliméricas con propiedades estructurales comparables a ECM natural ha llevado a numerosos polímeros naturales o sintéticos, o mezclas de polímero que se está electrospun para recrear estos ^ambientes,. La manipulación de los parámetros del proceso (incluyendo la elección del polímero, la concentración de polímero,, distancia punta de la aguja disolvente y temperatura) ¿pueden todas las características de la influencia de andamios; sin embargo, algunos parámetros pueden tener un mayor impacto en las propiedades de andamios que otros ^25,. Cuando la modificación de PET diámetro de la fibra, encontramos los parámetros clave a ser la concentración del polímero utilizado, la velocidad a la que la solución de polímero era electrospun, y el diámetro de la aguja. Cuando electrospinning fibras alineadas los parámetros clave son el método de recogida utilizado (un mandril giratorio), y la velocidad a la que gira el mandril. A través de la reducción de la velocidad del mandril a 60 rpm, encontramos los andamios alineados al azar producidos mostraron mayor uni andamiola conformidad en comparación con electrospinning sobre una placa de colector plano.

Se analizaron las características de los tejidos de las vías respiratorias descelularizado proporcionar orientación para las distintas topografías de andamios desarrollados por la cultura de cada uno de las vías respiratorias de tipo celular. Nanofibras electrohiladas son un andamio atractivo para replicar estructuras de la membrana basal debido al tamaño de poro pequeño pero de alta porosidad global que permite una mayor difusión metabolito mientras restringir el movimiento celular. ⁹ Mientras que la optimización de los parámetros de electrospinning, un intervalo de concentraciones de PET y las tasas de flujo fueron probados. Las fibras más finas se lograron utilizando una solución peso / vol PET 6%, utilizado anteriormente por otros grupos. Sin embargo, los altos niveles de abalorios, y una falta de uniformidad eran constantes problemas. Los intentos iniciales para eliminar el rebordear incluyeron la adición de un tensioactivo catiónico, bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), a la solución para disminuir la tensión superficial, y prueba de varias fuentesde PET. La adición de tensioactivo redujo la cantidad de gotear, pero no completamente. Después de probar un número de fuentes comerciales de gránulos de PET, se utilizó botella de bebida de calidad alimentaria PET, cortando botellas de bebidas y disolviendo estos en el DCM: TFA solución de disolvente. Usando esto como la fuente de PET resultó en un aumento en la uniformidad de fibra y una reducción en fibra rebordear. Al aumentar la concentración de la solución ligeramente a 8% en peso / vol y reduciendo el diámetro de la aguja (18G a 23G) hemos producido consistentemente nanofibras defecto libres con un diámetro de fibra de aproximadamente 250 nm. Andamios nanofibras electrohiladas pueden ser altamente electrostática a la recogida del mandril haciendo la manipulación manual de los andamios difíciles. Esto fue mejorado mediante el almacenamiento de los andamios en papel de aluminio después de girar y sumergirse en un 70% IMS antes de su uso. Este apareció para ayudar a disipar la carga electrostática residual que queda en el patíbulo del proceso de electrospinning.

Para proporcionar la parte superiorographies similar a los microambientes individuales encontradas por los tres tipos de células de las vías respiratorias principales dentro de la pared de la vía aérea, un protocolo básico electrospinning se adaptó para producir tres andamios únicos para estos tipos de células: por electrospinning una solución de bajo PET concentración lentamente, se generaron nanofibras alineados al azar, en el que las células epiteliales se sembraron (imitando el RBM). Por electrospinning una solución PET concentración más alta a una velocidad mayor, se generaron microfibras alineadas al azar (produciendo un andamio más porosa), en las que se sembraron fibroblastos (imitando la zona sub-mucosa inmediatamente debajo de la RBM). Por electrospinning una solución de baja concentración de PET en una gran velocidad de rotación del mandril alineado nanofibras se produjeron, en el cual las células musculares lisas orientadas en la dirección de la fibra, produciendo capas de células alineadas.

Diámetros de las fibras sin mayor problema al aumento del tamaño de los poros, lo que permite una mayor penetratio celularn en los andamios y así ayudar a crear un verdadero entorno ^3D,. Se emplearon los andamios de microfibra para el cultivo de fibroblastos en el estudio para asegurar que las células residían en múltiples planos dentro del andamio. Al aumentar la concentración de PET a 30% en peso / vol, se produjeron fibras de PET con un diámetro medio de 2,5 micras. Fibras de mayor diámetro (≈ 4 micras) se produjeron utilizando una solución de PET peso / volumen 35%, pero la uniformidad de espesor andamio se perdió, y la mayor variabilidad entre las fibras individuales era evidente. Los poros en el andamio de microfibra eran más de 7 veces mayor que los medidos en las nanofibras andamios (10.45 micras vs 1,43 micras, respectivamente), pero todavía estática siembra de las células proporcionan la penetración celular limitada. Esto se ha mejorado mediante la siembra de las células dinámicamente usando un mezclador orbital, un método demostrado ser eficaz previamente.

Andamios nanofibras altamente alineados fueron creados por electrospinning un 10%p / solución PET vol sobre el mandril que gira a 2000 rpm (≈ 440 m · min ^-1). La concentración de PET se aumentó de 8% para evitar una morfología similar a una onda irregular que las fibras expuestas a concentraciones más bajas. A pesar del aumento en la concentración, la alineación de las fibras reducido el diámetro promedio de la fibra (216 nm vs. 255 nm, alineado vs. aleatorio). La alta velocidad del mandril dibujo las fibras fuera antes de que se hayan secado es probable que cause este efecto. La alineación de las fibras influido en la alineación de las células ASM, y también tiene otros efectos fisiológicos en las células ASM que se han caracterizado en otra parte ^21.

La principal limitación de este protocolo es la incapacidad de las células vivas imagen sobre / en los andamios que hacen las células apego o la diferenciación inicial durante un periodo de tiempo prolongado imposible determinar sin sacrificar muestras. Esto significa que la mayoría de optimización se produce después de que el período de cultivo, es decir, fijaring muestras y luego medir si el cultivo celular fue exitosa después de no durante el cultivo celular. La observación de un cambio de color en los andamios incubadas en alamarBlue (azul a rosa) indica células están presentes y viable, pero no es lo ideal. Electrospinning polímeros más transparentes tales como gelatina podrían ayudar en la visualización de las células en los andamios. El electrospinning de un andamio de nanofibras dentro de nuestro modelo permitió la replicación del RBM de las vías respiratorias, de manera similar compuesta de nanofibras densos en la que residen las células epiteliales. Previamente se ha demostrado que las células estructurales no puede migrar a través del andamio de nanofibras ^22, aunque las células inmunes son capaces de (datos no mostrados). Mientras ventajoso para el cultivo de tipos de células específicas en una superficie 3D (tales como células epiteliales y endoteliales), esta prevención de la migración celular estructural a través de las nanofibras pueden ser perjudiciales para el cultivo de otros tipos celulares. Como el músculo liso no es capaz de migrar a través de THe alineados de nanofibras andamio que monta el tri-capas cocultivo con el músculo liso y capas de fibroblastos uno frente al otro (en oposición a la andamio alineados que separa los dos tipos de células). Mientras que esto permite que las células estén en estrecha aposición, el estudio actual no puede concluir si un tipo de célula (ya sea el fibroblasto o músculo liso) superaría toda la capa durante un período de cultivo más prolongado. A pesar de estas limitaciones, un modelo tri-capa viable de la pared de las vías respiratorias ha sido desarrollado que proporciona una plataforma alternativa para investigar las interacciones entre estos múltiples tipos de células. Un estudio tri-capas similar se ha publicado recientemente, donde los fibroblastos fueron incorporados dentro de un colágeno cilíndrica I hidrogel con músculo liso sembradas en la superficie exterior y células epiteliales dentro de la superficie luminal ^17. La estabilidad mecánica de los andamios electrospun desarrollados aquí permitiría tubular similares construye a formar, y sigue siendo un resea actualrch objetivo dentro de nuestro grupo. Mientras que el estudio se ha centrado en la vía aérea, varios órganos dentro del cuerpo de la cuota de esta unidad estructural básica de la mucosa, y por medio de la modificación de los inquilinos de relieve en este estudio, plataformas similares podrían ser desarrollados para tejidos que contienen una unidad de membrana basal, incluyendo los vasos sanguíneos, la vejiga y la córnea, donde se han empleado modelos basados ​​en múltiples capas de colágeno.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Botellas de tereftalato de polietileno (PET)	Lucozade (GSK)	N/A	Fuente de PET para electrohilado. Cortar en trozos pequeños y pesar según sea necesario
Diclorometano (DCM)			Disolvente para PET
Ácido trifluoroacético (TFA)	Sigma		Disolvente para PET
Mandril giratorio	Construido en casa		Se utiliza para recoger fibras electrohiladas. Al girar a diferentes velocidades, las fibras se pueden alinear u orientar aleatoriamente
Bomba de jeringa	Aparato		de Harvard utilizado en el proceso de electrohilado
DMEM-F12 Medio de	Gibco		para células CALU3
DMEM	Gibco		Medio de cultivo para células HASM
MEM	Gibco		Medio de cultivo para células MRC5
Antibiótico/antimicótico solución	Gibco		Media suplemento
FCS	Gibco		Media suplemento
Mezclador orbital (Orbital shake 503)	Stuart Scientific		Para la siembra dinámica de células en andamios de microfibra
Bomba peristáltica	Watson Marlow		Para proporcionar flujo de medios a través del biorreactor
3DKube	Biorreactor Kiyatec		para el cultivo celular en 3D