Observación del Movimiento ciliar de las células epiteliales del plexo coroideo Ex Vivo

Resumen

En este estudio, se optimizó una técnica detallada de microscopía óptica para la observación y el análisis en tiempo real del movimiento de los cilios CPEC ex vivo junto con un método de microscopía electrónica para el análisis ultraestructural.

Resumen

El plexo coroideo se encuentra en la pared ventricular del cerebro, cuya función principal se cree que es la producción de líquido cefalorraquídeo. Las células epiteliales del plexo coroideo (CPEC) que cubren la superficie del tejido del plexo coroideo albergan múltiples cilios únicos, pero la mayoría de las funciones de estos cilios aún no se han investigado. Para descubrir la función de los cilios CPEC con especial referencia a su motilidad, se desarrolló un sistema de observación ex vivo para monitorear la motilidad ciliar durante los períodos embrionario, perinatal y postnatal. El plexo coroideo se diseccionó del ventrículo encefálico y se observó bajo un microscopio de contraste mejorado con video equipado con óptica de contraste de interferencia diferencial. Bajo esta condición, se desarrolló un método simple y cuantitativo para analizar los perfiles móviles de los cilios CPEC durante varias horas ex vivo. A continuación, se observaron los cambios morfológicos de los cilios durante el desarrollo mediante microscopía electrónica de barrido para dilucidar la relación entre la madurez morfológica de los cilios y la motilidad. Curiosamente, este método pudo delinear cambios en el número y la longitud de los cilios, que alcanzaron su punto máximo en el día postnatal (P) 2, mientras que la frecuencia de latidos alcanzó un máximo en P10, seguido de un cese abrupto en P14. Estas técnicas permitirán dilucidar las funciones de los cilios en diversos tejidos. Si bien las técnicas relacionadas se han publicado en un informe anterior¹, el presente estudio se centra en técnicas detalladas para observar la motilidad y morfología de los cilios CPEC ex vivo.

Introducción

Los cilios son proyecciones en forma de pelo en la superficie de la mayoría de las células de vertebrados, que han atraído la atención de los investigadores médicos debido a una clase de enfermedades denominadas ciliopatías ^2-4. A pesar de la expresión ubicua del orgánulo, se ha descrito una amplia variedad de funciones ciliares, incluyendo la motilidad y la biodetección. Por ejemplo, los cilios móviles en la superficie mucoepitelial transportan moco⁵ y restos epiteliales a la salida de los tractos, previniendo así la enfermedad al limpiar la superficie de los epitelios. Además, durante los períodos tempranos de desarrollo y las etapas embrionarias, los cilios regulan la proliferación de las células madre⁶ y están involucrados en la determinación de la asimetría izquierda-derecha del cuerpo de los vertebrados⁷.

Las células epiteliales del plexo coroideo (CPECs) son derivados de las células neuroepiteliales que cubren la superficie del tejido del plexo coroideo en el cerebro, que desempeñan un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis del entorno intracraneal mediante la producción de líquido cefalorraquídeo (LCR). Se ha demostrado previamente que los CPEC tienen múltiples cilios inmóviles que regulan la producción de LCR a través de receptores acoplados a proteínas G que se concentran específicamente en los cilios⁸. A pesar de que estos cilios habían sido considerados como cilios inmóviles inactivos, se descubrió que algunos cilios CPEC exhiben motilidad transitoria durante el período neonatal¹. Este hallazgo fue muy importante porque reveló que los llamados cilios inmóviles no son necesariamente inmóviles desde el comienzo del desarrollo y podrían mostrar motilidad transitoria durante ventanas de tiempo específicas, posiblemente en respuesta a demandas y funciones fisiológicas específicas⁹. Para describir con precisión la naturaleza móvil de los cilios CPEC, es necesario desarrollar un sistema de observación ex vivo que abarque el análisis de los perfiles cinéticos únicos de los cilios CPEC.

Con respecto a la motilidad, aunque varios informes técnicos han descrito observaciones de los cilios móviles del epitelio traqueal^5,10, flagelos monocelulares móviles¹¹, los llamados cilios móviles^{convencionales 12} y cilios nodales¹³, los métodos analíticos detallados aplicables a estructuras relativamente onduladas como el plexo coroideo no han sido bien documentados hasta ahora. Además, se requiere una alta resolución de tiempo para analizar el movimiento ciliar de los CPEC, en los que son indispensables costosas cámaras de alta velocidad. Para eludir esta necesidad y simplificar el monitoreo de la motilidad ciliar de varios tipos de células, se ha introducido una cámara de alta velocidad y bajo costo, y se ha desarrollado un método fácilmente accesible y conveniente para registrar la motilidad de los cilios móviles, especialmente para describir la velocidad y el patrón de movimiento de cada cilio¹. Además, se ha utilizado aquí el software de análisis de imágenes original "TI Workbench" para facilitar el análisis detallado de la motilidad. En conjunto, este método proporciona una nueva estrategia concisa para analizar el movimiento ciliar junto con la microscopía electrónica de barrido correlativa (SEM), que puede adoptarse en una amplia gama de investigaciones sobre el cilio.

Protocolo

Los protocolos y uso de animales experimentales fueron aprobados por los comités de cuidado animal y el uso institucional de la Universidad de Yamanashi y la Universidad de Waseda. Cuidado de los animales se realizó de acuerdo con las directrices institucionales.

1. Preparación CPEC

1. Preparar los siguientes aparatos y materiales: un microscopio estéreo, preferiblemente capaz de transmitir la iluminación desde la parte inferior; un par de pinzas de relojero (Dumont # 3 o # 4), llama-esterilizado, tijeras de funcionamiento rectas, llama-esterilizado; dos platos de 10 cm de plástico estériles que contienen 20 ml de hielo frío medio Leibovitz L-15; Platos con fondo de cristal de 35 mm que contienen 2 ml RT Leibovitz medio L-15; un vaso de precipitados de 100 ml que contiene 70% de etanol; cachorros neonatales ratón.
2. Brevemente sumerja un ratón neonatal en etanol al 70% y la eutanasia de forma rápida por decapitación con las tijeras que operan.
3. Coloque la cabeza inmediatamente helada Leibovitz L-15 en el medio estéril 10 cm dish.
4. Retire la piel de los bóveda craneal utilizando el par de pinzas relojero, cortar el cráneo para exponer el cerebro, y luego cortar los nervios craneales para aislar todo el cerebro.
5. Transferir el cerebro a un nuevo plato que contiene helado Leibovitz L-15 medio y observar bajo el microscopio estereoscópico, asegurándose de que el cerebro está completamente inmerso en el medio.
6. Establezca la cara dorsal del cerebro hacia arriba, y orientar el cerebro para que los bulbos olfatorios residen en la posición tres (para personas diestras). Mantenga el cerebro suavemente con las pinzas en la mano izquierda.
7. Usando las pinzas de disección finas (Dumont # 3 o # 4) en la mano derecha, cortar el cuerpo calloso y debajo del parénquima que conecta los hemisferios cerebrales, a lo largo de la fisura longitudinal del cerebro.
8. Presione suavemente los hemisferios cerebrales de distancia a los lados laterales y exponer la fisura cerebral transversal.
9. Separar los hemisferios pellizcando a cabo ªe parénquima entre el hemisferio y el tálamo.
10. Retire con cuidado el plexo coroideo del ventrículo lateral que se adjuntan a la parte lateral del hipocampo por el Affixa lámina.
11. Transferir el plexo coroideo aisladas para el plato de fondo de vidrio de 35 mm que contiene frescos medio Leibovitz L-15, y las cubrirás de un peso (Lista de Materiales) suavemente para mantener el tejido en su lugar.

2. imágenes en vivo de CPEC cilios

1. Confirmar ultravioleta adecuada (UV) y el filtro (s) deducido (IR) de corte para bloquear la luz corta que 400 nm y más de 700 nm, y que de densidad neutra (ND) Filtros (25% y 6%) se inserta en la trayectoria de la luz del microscopio invertido.
2. Ajuste el enfoque de la lente objetivo más o menos a ojo, y luego ajustar el condensador de modo que el centro y el enfoque para ajustarse a la iluminación Köhler. Insertar un contraste de interferencia diferencial apropiado (DIC) prisma, un elemento de DIC, así como elementos del analizador y el polarizador en el liruta luchar para ajustarse a la óptica DIC.
3. Ajustar el contraste de la vista por la posición del prisma DIC modo que la estructura de la superficie del tejido es más reconocible. Si todos los cilios de las células diana son móviles, una visión clara de cilios móviles no se puede obtener por el ojo a causa de su movimiento.
4. Cambie la trayectoria de la luz a la cámara de video, y quitar los filtros ND para aumentar la potencia de la luz.
5. Utilice la cámara en el modo de enfoque para ajustar el campo de visión y el enfoque. Durante el enfoque, en el que las imágenes de vídeo se visualizan en tiempo real en el monitor, una visión clara de cilios móviles no está disponible.
6. Utilice la cámara a 200 Hz con un tiempo de exposición de 0,1 ms para el período (segundos a minutos) deseado. Después de la adquisición de la pila de imágenes, cuadros individuales se mostrarán las estructuras ciliares claras. Si bordes ciliares están borrosas, aumentar la velocidad de fotogramas o utilizar un tiempo de exposición corto.
7. Registrar el movimiento de los cilios CPEC dentro 25-60 minutos después de la eutanasia en LeibovitzL-15 medio.

3. Análisis de movimiento ciliar

1. Rastrear manualmente superando patrones de cada cilio en el monitor de la computadora. Marcar las posiciones de punta ciliar en cada cuadro con el puntero del ratón, que se ensamblan para obtener información trayectoria de cada cilio. Cualquiera de analizar la información de trayectoria utilizando el mismo software o exportar a otras aplicaciones más generales para su posterior análisis. La eficiencia de este paso de análisis se describe en la discusión.
2. Clasificar las trayectorias en dos modos de movimiento, de ida y vuelta o de rotación, por ojo.
3. Calcular la frecuencia de latido ciliar (CBF) utilizando la siguiente fórmula: [CBF = (número de fotogramas por segundo) / (número promedio de marcos para un solo latido)] ^14, que se puede obtener a partir de un diagrama de movimiento punta ciliar (Figura 3 ). Repetir este cálculo para múltiples ciclos de batido ciliar, porque otra cilios en la misma célula puede interferir con el movimiento de cada cilium, resultando en irregularidad.
4. Para analizar la uniformidad angular de la ciliar superando ejes dentro de una sola célula, definir el ángulo θ golpes para cada trayectoria (Figura 4). Para trayectorias de nuevo adelante y hacia atrás, ajuste la posición de la punta cilios a una línea recta, y definir θ como el ángulo de la línea hace con el eje x. Para las trayectorias de rotación, encajar las posiciones a una elipse, y definir θ como el ángulo del eje mayor de la elipse hace con eje x. Los detalles de la instalación se describen en la sección de Resultados Representante.
5. Para obtener una descripción cuantitativa de cada trayectoria, calcular generalizada relación de aspecto AR. Brevemente, rotar la trayectoria por - θ y definir AR como la relación entre las anchuras de la distribución a lo largo de x - y -axes Y (Figura 4B). Los detalles se muestran en la sección Resultados Representante, y la interpretación, El significado y la limitación de los parámetros se describen en la Discusión.

4. Preparación de muestras para SEM

Nota: SEM es un método importante para evaluar el estado de los cilios en CPECs de una manera integral. Para preparar muestras para SEM, un procedimiento estándar se informó anteriormente ¹⁵ se emplea con ligeras modificaciones.

1. Antes de la disección de los tejidos del cerebro, preparar el fijador en un vial de vidrio de 5 ml con un tapón de polietileno. El fijador se compone de 2% de paraformaldehído, 2.5% de glutaraldehído (solución media de Karnovsky ¹⁶⁾ en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,4.
2. Diseccionar el tejido del cerebro como se describe en el paso 1.
3. Brevemente enjuagar el tejido aislado con solución salina equilibrada de Hank (HBSS) en un nuevo plato y luego fijar el tejido en el fijador en el vial de vidrio durante 1 hora a temperatura ambiente. Utilice pipetas de transferencia desechables y manipular las muestras gently. Después de enjuagar en HBSS, el tejido se vuelve pegajosa.
   1. Para transferir los especímenes en la solución de fijación, expulsar lentamente una pequeña cantidad de solución que contiene el tejido de la pipeta de transferencia como una gotita y añadir a la fijador.
4. Después de la fijación, deseche el fijador y lavar el tejido con tampón fosfato tres veces.
5. Sumergir el tejido en una solución de sacarosa al 10% para lavar los aldehídos restantes. Para garantizar la eliminación completa de los aldehídos, sumergir las muestras en la solución durante 10 min y luego repetir dos veces con 10% de sacarosa fresco. Este paso es importante para lograr la adecuada post-fijación en los pasos posteriores.
6. Sumergir el tejido en una solución de 1% de tetróxido de osmio en tampón fosfato durante 30 min y luego se coloca en hielo durante post-fijación. Juzgar el grado de osmification por el color de la muestra: cuando aldehídos se eliminan por completo, la muestra es de color negro.
7. Lavar las muestras de tejidos después de la fijada extensamente con doble destiladad agua varias veces.
8. Deshidratar las muestras por inmersión en concentraciones graduadas de etanol, por lo general 65%, 75%, 85%, 95%, 99%, y 100%, durante 10 min cada uno. Obtener etanol anhidro mediante la colocación de tamices moleculares en etanol 99,5% de una botella que acaba de adquirir. Repita deshidratación con etanol anhidro tres veces.
9. Colocar las muestras deshidratadas en acetato de isoamilo, un reactivo de sustitución de secado de punto crítico, para 10 min. Repita este paso dos veces. Este reactivo se evapora rápidamente y la muestra puede convertirse en seco, lo que resulta en la destrucción por la tensión superficial. Por lo tanto, no secar la muestra por completo.
10. Después de que el intercambio final de acetato de isoamilo, eliminar la mayor parte del disolvente, inmediatamente envolver el vial de vidrio abierto con papel de aluminio, y colocar el vial en hielo seco. Usando una aguja o unas pinzas finas, hacer varios agujeros en la lámina que cubre la boca del vial, de modo que el dióxido de carbono líquido fluye fácilmente en el vial en el secador de punto crítico. Continúe con el siguiente pasolo más rápido posible.
11. En este paso, minimizar el arrastre de acetato de isoamilo en la cámara de la secadora, pero no dejes que la muestra se seque completamente antes de secado de punto crítico. Además, no deje la muestra en hielo seco durante un tiempo innecesariamente largo para evitar la formación de escarcha en el vial.
12. La transferencia de los viales de vidrio envueltas en papel aluminio que contienen las muestras de tejido en el secador de punto crítico que asegura la estructura de la superficie del tejido permanece intacta, mientras que la eliminación de agua contenida en el tejido. La información detallada sobre el funcionamiento del secador de punto crítico puede obtenerse a partir de las instrucciones del fabricante.
13. Maneje las muestras cuidadosamente con un palillo de dientes para minimizar el daño mecánico. Las muestras de tejido secas resultantes son frágiles. Montar las muestras en trozos de metal y escudo de oro-paladio usando una pulverización catódica de iones.

5. Observación por SEM

1. Observe por SEM y grabar imágenes con una cámara digitalequipado para microscopio electrónico de barrido.
2. Transferir datos de imagen digital a un PC para su análisis.

Resultados

Una visión general del flujo de trabajo se muestra en la Figura 1, incluyendo imágenes de los dispositivos.

Observaciones de movimiento vivo de CPECs

Película 1 muestra una película de CPECs aisladas a partir de un ratón perinatal, y la película 2 muestra una vista ampliada de las imágenes en la película 1. Debe tenerse en cuenta que las puntas ciliares individuales son menos claros en imágenes f...

Discusión

Perspectivas de este método

Aunque la técnica descrita aquí no proporciona un análisis más detallado de los cilios que los métodos publicados anteriormente, la importancia de esta técnica reside en la simplicidad del sistema y la eficacia de costes, que se puede aplicar fácilmente a cualquier tipo de detección de la motilidad ciliar ex vivo. En particular, TI Workbench proporciona una interfaz simple y fácil de usar que permite a los investigadores observar y analizar la motilidad c...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivos requeridos
para la obtención de imágenes de células vivas
etanol	Wako Chemicals	057-00456
Leibovitz L-15 medio	Life Technologies	11415-064
para la preparación de SEM
etanol	Wako Chemicals	057-00456
Solución salina equilibrada de Hank	Life Technologies	14170112
paraformaldehído	Merck	1040051000
glutaraldehído	Nacalai tesque	17003-05
acetato de isoamilo	Nacalai tesque	02710-95
Tamices moleculares 4A 1/8	Wako Chemicals	130-08655	para la preparación de
solución salina (PBS) tampón de fosfato	Sigma-Aldrich	D1408
, 0,1 M			Para hacer 100 ml, mezcle 19,0 ml de 0,1  M NaH2PO4 y 81,0 ml de 0,1  M Na2HPO4
monosódico fosfato (dihidrato)	Nacalai tesque	31718-15
fosfato disódico (anhidro)	Nacalai tesque	31801-05
suclose	Nacalai tesque	30406-25
tetróxido de osmio	Nisshin EM	300
hielo
[header]
Herramientas y materiales para la disección
para imagen en vivo y preparación SEM
microscopio estereoscópico	Olympus	SZX7
toalla
Φ Plato
Vaso de precipitados
tijeras de operación rectas	Sansyo	S-2B
	Dumont	No.DU-3 o -4, INOX
para imagen de células vivas
fondo de vidrio	Matsunami Glass D110300
para preparación SEM
lámina
Frasco de vidrio de 5 ml con tapón de polietileno	Nichiden Rika-Glass	PS-5A
pipeta de transferencia	Samco Scientific	SM251-1S	para transferencia de muestras
palillo			para la transferencia de muestras
pulverización iónica con oro-paladio	Hitachi	E-1030
secador de punto crítico	Hitachi	HCP-2
[header]
equipos y materiales microscópicos
para imagen de células vivas
microscopio invertido	fuerte Olympus	IX81
100 W carcasa de bulto de mercurio y fuente	Olympus	Se puede utilizar la lámpara de mercurio U-ULH y BH2-RFL-T3
100 W	Ushio	USH103D
condensador DIC, n.a. 0,55	Olympus	IX-LWUCD
obturador eléctrico	Vincent Associates	VS35S22M1R3-24 y VMM-D1	.
Filtro de paso de banda (400-700  nm, Φ 45 y nbsp; mm)	Filtro ND Koshin Kagaku	C10-110621-1
(Φ 45 mm)	Olympus	45ND6, 45ND25	combinación de filtros ND de 25% y 6% se utiliza
lente objetivo (inmersión en agua) con elemento DIC	Olympus	UApo 40XW/340, n.a., 1.15 con cámara de video de alta velocidad IX-DPAO40
	Allied Vision Technologies	GE680	≥ Velocidad de fotogramas de 200 Hz y tiempo de exposición de 1 mseg
Software de adquisición/análisis de imágenes	el software	TI Workbench	capaz de adquirir a altas velocidades de fotogramas.
PC para control / análisis de cámaras	Apple	Mac Pro
mesa de aislamiento de vibraciones	Meiritsu Seiki	AD0806
peso para pañuelos	Kits de anclaje de corte	Warner Instruments	Se puede hacer con malla de nailon pegada a una forma de U aplastada Φ 0.5  mm de alambre de platino.
cubreobjetos (peso alternativo al pañuelo)	Matsunami	hecho a medida	Un cubreobjetos se puede utilizar como pesa de tejido.
para microscopio SEM
invertido	Olympus	IX81
microscopio electrónico de barrido	JEOL	JSM-6510