En este estudio, se optimizó una técnica detallada de microscopía óptica para la observación y el análisis en tiempo real del movimiento de los cilios CPEC ex vivo junto con un método de microscopía electrónica para el análisis ultraestructural.
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Artículo de método
Observación del Movimiento ciliar de las células epiteliales del plexo coroideo
En este artículo
Resumen
Resumen
El plexo coroideo se encuentra en la pared ventricular del cerebro, cuya función principal se cree que es la producción de líquido cefalorraquídeo. Las células epiteliales del plexo coroideo (CPEC) que cubren la superficie del tejido del plexo coroideo albergan múltiples cilios únicos, pero la mayoría de las funciones de estos cilios aún no se han investigado. Para descubrir la función de los cilios CPEC con especial referencia a su motilidad, se desarrolló un sistema de observación ex vivo para monitorear la motilidad ciliar durante los períodos embrionario, perinatal y postnatal. El plexo coroideo se diseccionó del ventrículo encefálico y se observó bajo un microscopio de contraste mejorado con video equipado con óptica de contraste de interferencia diferencial. Bajo esta condición, se desarrolló un método simple y cuantitativo para analizar los perfiles móviles de los cilios CPEC durante varias horas ex vivo. A continuación, se observaron los cambios morfológicos de los cilios durante el desarrollo mediante microscopía electrónica de barrido para dilucidar la relación entre la madurez morfológica de los cilios y la motilidad. Curiosamente, este método pudo delinear cambios en el número y la longitud de los cilios, que alcanzaron su punto máximo en el día postnatal (P) 2, mientras que la frecuencia de latidos alcanzó un máximo en P10, seguido de un cese abrupto en P14. Estas técnicas permitirán dilucidar las funciones de los cilios en diversos tejidos. Si bien las técnicas relacionadas se han publicado en un informe anterior1, el presente estudio se centra en técnicas detalladas para observar la motilidad y morfología de los cilios CPEC ex vivo.
Introducción
Los cilios son proyecciones en forma de pelo en la superficie de la mayoría de las células de vertebrados, que han atraído la atención de los investigadores médicos debido a una clase de enfermedades denominadas ciliopatías 2-4. A pesar de la expresión ubicua del orgánulo, se ha descrito una amplia variedad de funciones ciliares, incluyendo la motilidad y la biodetección. Por ejemplo, los cilios móviles en la superficie mucoepitelial transportan moco5 y restos epiteliales a la salida de los tractos, previniendo así la enfermedad al limpiar la superficie de los epitelios. Además, durante los períodos tempranos de desarrollo y....
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Protocolo
Los protocolos y uso de animales experimentales fueron aprobados por los comités de cuidado animal y el uso institucional de la Universidad de Yamanashi y la Universidad de Waseda. Cuidado de los animales se realizó de acuerdo con las directrices institucionales.
1. Preparación CPEC
- Preparar los siguientes aparatos y materiales: un microscopio estéreo, preferiblemente capaz de transmitir la iluminación desde la parte inferior; un par de pinzas de relojero (Dumont # 3 o # 4), llama-esterilizado, tijeras de funcionamiento rectas, llama-esterilizado; dos platos de 10 cm de plástico estériles que contienen 20 ml de hielo frío medio....
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Resultados
Una visión general del flujo de trabajo se muestra en la Figura 1, incluyendo imágenes de los dispositivos.
Observaciones de movimiento vivo de CPECs
Película 1 muestra una película de CPECs aisladas a partir de un ratón perinatal, y la película 2 muestra una vista ampliada de las imágenes en la película 1. Debe tenerse en cuenta que las puntas ciliares individuales son menos claros en imágenes f.......
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Discusión
Perspectivas de este método
Aunque la técnica descrita aquí no proporciona un análisis más detallado de los cilios que los métodos publicados anteriormente, la importancia de esta técnica reside en la simplicidad del sistema y la eficacia de costes, que se puede aplicar fácilmente a cualquier tipo de detección de la motilidad ciliar ex vivo. En particular, TI Workbench proporciona una interfaz simple y fácil de usar que permite a los investigadores observar y analizar la motilidad c.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia. Este documento tiene por objeto informar metodología detallada para observar la motilidad de los cilios en los tejidos del plexo coroideo aisladas. Novedades científicas se han reportado en estudios anteriores 1,8.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por un Proyecto para Universidades Privadas: subvención de fondos de contrapartida del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología (MEXT) de Japón (T.I.) y Subvenciones de Ayuda para la Investigación Científica (C) de MEXT (S.T. y K.N).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reactivos requeridos | |||
| para la obtención de imágenes de células vivas | |||
| etanol | Wako Chemicals | 057-00456 | |
| Leibovitz L-15 medio | Life Technologies | 11415-064 | |
| para la preparación de SEM | |||
| etanol | Wako Chemicals | 057-00456 | |
| Solución salina equilibrada de Hank | Life Technologies | 14170112 | |
| paraformaldehído | Merck | 1040051000 | |
| glutaraldehído | Nacalai tesque | 17003-05 | |
| acetato de isoamilo | Nacalai tesque | 02710-95 | |
| Tamices moleculares 4A 1/8 | Wako Chemicals | 130-08655 | para la preparación de |
| solución salina (PBS) tampón de fosfato | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| , 0,1 M | Para hacer 100 ml, mezcle 19,0 ml de 0,1 M NaH2PO4 y 81,0 ml de 0,1 M Na2HPO4 | ||
| monosódico fosfato (dihidrato) | Nacalai tesque | 31718-15 | |
| fosfato disódico (anhidro) | Nacalai tesque | 31801-05 | |
| suclose | Nacalai tesque | 30406-25 | |
| tetróxido de osmio | Nisshin EM | 300 | |
| hielo | |||
| [header] | |||
| Herramientas y materiales para la disección | |||
| para imagen en vivo y preparación SEM | |||
| microscopio estereoscópico | Olympus | SZX7 | |
| toalla | |||
| Φ Plato | |||
| Vaso de precipitados | |||
| tijeras de operación rectas | Sansyo | S-2B | |
| Dumont | No.DU-3 o -4, INOX | ||
| para imagen de células vivas | |||
| fondo de vidrio | Matsunami Glass D110300 | ||
| para preparación SEM | |||
| lámina | |||
| Frasco de vidrio de 5 ml con tapón de polietileno | Nichiden Rika-Glass | PS-5A | |
| pipeta de transferencia | Samco Scientific | SM251-1S | para transferencia de muestras |
| palillo | para la transferencia de muestras | ||
| pulverización iónica con oro-paladio | Hitachi | E-1030 | |
| secador de punto crítico | Hitachi | HCP-2 | |
| [header] | |||
| equipos y materiales microscópicos | |||
| para imagen de células vivas | |||
| microscopio invertido | fuerte Olympus | IX81 | |
| 100 W carcasa de bulto de mercurio y fuente | Olympus | Se puede utilizar la lámpara de mercurio U-ULH y BH2-RFL-T3 | |
| 100 W | Ushio | USH103D | |
| condensador DIC, n.a. 0,55 | Olympus | IX-LWUCD | |
| obturador eléctrico | Vincent Associates | VS35S22M1R3-24 y VMM-D1 | . |
| Filtro de paso de banda (400-700 nm, Φ 45 y nbsp; mm) | Filtro ND Koshin Kagaku | C10-110621-1 | |
| (Φ 45 mm) | Olympus | 45ND6, 45ND25 | combinación de filtros ND de 25% y 6% se utiliza |
| lente objetivo (inmersión en agua) con elemento DIC | Olympus | UApo 40XW/340, n.a., 1.15 con cámara de video de alta velocidad IX-DPAO40 | |
| Allied Vision Technologies | GE680 | ≥ Velocidad de fotogramas de 200 Hz y tiempo de exposición de 1 mseg | |
| Software de adquisición/análisis de imágenes | el software | TI Workbench | capaz de adquirir a altas velocidades de fotogramas. |
| PC para control / análisis de cámaras | Apple | Mac Pro | |
| mesa de aislamiento de vibraciones | Meiritsu Seiki | AD0806 | |
| peso para pañuelos | Kits de anclaje de corte | Warner Instruments | Se puede hacer con malla de nailon pegada a una forma de U aplastada Φ 0.5 mm de alambre de platino. |
| cubreobjetos (peso alternativo al pañuelo) | Matsunami | hecho a medida | Un cubreobjetos se puede utilizar como pesa de tejido. |
| para microscopio SEM | |||
| invertido | Olympus | IX81 | |
| microscopio electrónico de barrido | JEOL | JSM-6510 |
Referencias
- Nonami, Y., Narita, K., Nakamura, H., Inoue, T., Takeda, S. Developmental changes in ciliary motility on choroid plexus epithelial cells during the perinatal period. Cytoskeleton. 70 (12), 797-803 (2013).
- Bisgrove, B. W., Yost, H. J. The roles of cilia in d....
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