Investigación de sináptica Tagging / Captura y Cruz de captura utilizando aguda hipocampo rebanadas de Roedores

Summary

Este artículo de video describe procedimientos experimentales para estudiar la plasticidad a largo plazo y sus procesos asociativos, como el marcaje sináptico, la captura y el etiquetado cruzado en las neuronas piramidales CA1 utilizando cortes agudos del hipocampo de roedores.

Abstract

El etiquetado y captura sináptica (STC) y el etiquetado cruzado son dos mecanismos importantes a nivel celular que explican cómo se logra la especificidad y asociatividad de la sinapsis en las neuronas dentro de un marco de tiempo específico. Estos procesos relacionados con la plasticidad a largo plazo son los principales modelos candidatos para estudiar las bases de la formación de la memoria y la persistencia a nivel celular. Tanto la STC como el marcaje cruzado implican dos procesos en serie: (1) la configuración de la etiqueta sináptica como desencadenada por un patrón específico de estimulación, y (2) la captura sináptica, mediante la cual la etiqueta sináptica interactúa con las proteínas relacionadas con la plasticidad (PRP) recién sintetizadas. Gran parte de la comprensión sobre los conceptos de STC y cross-tagging surge de los estudios realizados en la región CA1 del hipocampo y, debido a la complejidad técnica, muchos de los laboratorios aún no pueden estudiar estos procesos. Las condiciones experimentales para la preparación de cortes de hipocampo y el registro de LTP/LTD tardío estable son extremadamente importantes para estudiar el marcaje sináptico/marcaje cruzado. Este artículo de video describe los procedimientos experimentales para estudiar los procesos de plasticidad a largo plazo, como STC y el etiquetado cruzado en las neuronas piramidales CA1, utilizando registros estables de potencial de campo a largo plazo de cortes agudos de hipocampo de ratas.

Introduction

La codificación y el almacenamiento de información en el cerebro sigue siendo el desafío más importante y perseguido con mayor intensidad en la neurociencia. A lo largo de los años, la potenciación a largo plazo (LTP) y la depresión a largo plazo (LTD) se han convertido en los principales correlatos celulares de la memoria^1,2. Estos cambios dependientes de la actividad, que exhiben especificidad de entrada y asociatividad, dan como resultado la estabilización de los rastros de memoria en las redes neuronales ^1,3,4. El mantenimiento de las dos formas de plasticidad sináptica requiere la síntesis de productos relacionados con la plasticidad (PRPs)^5-10. La especificidad de la sinapsis, que implica la interacción de una proteína recién sintetizada solo con sinapsis activadas específicas que expresan LTP o LTD, es crítica para la memoria. Esta especificidad se explica por el concepto de 'Marcaje y Captura Sináptica' (STC), donde los PRPs interactúan con sinapsis recientemente activas y 'marcadas'^11,12. El proceso STC ofrece un marco para las propiedades asociativas de los recuerdos a nivel celular. Nos proporciona una base conceptual de cómo las formas de plasticidad a corto plazo se transforman en formas duraderas de plasticidad de una manera asociativa y dependiente del tiempo¹³.

Durante el proceso de STC, una fuerte tetanización en una entrada que conduce a una LTP tardía dependiente de la síntesis de proteínas, da como resultado el refuerzo de una LTP temprana independiente de la síntesis de proteínas inducida en otra entrada independiente en la misma población de neuronas en una persistente¹³. El establecimiento de una etiqueta sináptica local por una actividad neuronal transitoria y la síntesis de los PRPs difusibles por la actividad neuronal fuerte son los dos eventos clave durante STC^13,14. La captura de las PRPs por las sinapsis "marcadas" recientemente potenciadas es fundamental para el mantenimiento de la potenciación a largo plazo. Se han realizado muchos estudios para confirmar la existencia del fenómeno STC^15-17 e identificar las 'etiquetas' candidatas18 y 'PRPs'19. Proteína quinasa II dependiente de calcio/calmodulina (CaMKII) y quinasa 1/2 regulada por señales extracelulares (ERK1/2); El CaMKIV, la proteína quinasa M (PKM) y el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) son algunas de las moléculas candidatas para 'tag' y 'PRP' respectivamente^19-21. El modelo de marcaje sináptico se ha ampliado aún más para incluir las interacciones asociativas positivas entre LTP y LTD: el "etiquetado cruzado sináptico"²². En el marcaje cruzado sináptico, una LTP/LTD tardía en una entrada sináptica transforma la LTD/LTP temprana independiente de la síntesis de proteínas opuesta en una entrada independiente en su forma duradera o viceversa²².

La preparación del corte del hipocampo es el modelo más utilizado en los estudios de plasticidad sináptica a largo plazo^23,24. Gran parte de la comprensión sobre los conceptos de marcaje sináptico y etiquetado cruzado surge de los estudios realizados en la región CA1 del hipocampo y, debido a la complejidad técnica, muchos de los laboratorios aún no pueden estudiar estos procesos. Las condiciones experimentales para la preparación de cortes de hipocampo de rata y el registro de LTP/LTD tardío estable durante horas prolongadas son extremadamente importantes para estudiar el marcaje sináptico/marcaje cruzado^23,25,26. Este artículo describe los procedimientos experimentales detallados para estudiar los procesos de plasticidad a largo plazo, como STC y el etiquetado cruzado en las neuronas piramidales CA1, utilizando registros estables de potencial de campo a largo plazo de cortes agudos de hipocampo de ratas.

Protocol

Todos los animales procedimientos fueron aprobados por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad Nacional de Singapur.

1. Preparación de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF)

1. Preparar la ACSF que consiste en (en mM) 124 NaCl, 3,7 KCl, 1,0 MgSO ₄ .7H ₂ O, 2.5 CaCl ₂ • 2H ₂ O, 1.2 KH ₂ PO _4, 24,6 NaHCO _3, y 10 D-glucosa. Asegúrese de que el pH de la ACSF está entre 7.2 hasta 7.4 cuando burbujeado a la saturación con 95% O ₂ y 5% de mezcla de CO ₂ (carbógeno). ²¹ Utilice esta ACSF tanto para la disección, rebanada preparación y para la perfusión durante las grabaciones electrofisiológicas.
   NOTA: Utilice aparato limpia para la medición y la celebración de la ACSF. El uso de aparatos impuro puede conducir a soluciones turbias o formación de precipitados. Use agua desionizada durante todos los preparativos.
2. Preparar un 2 L 10x ACSF Stock excluyendo _NaHCO3 y D-glucosa en un matraz volumétrico. Añadir los reactivos a agua desionizada en el orden siguiente: NaCl (144.96g), KCl (5,52 g), MgSO ₄ .7H ₂ 0 (4,92 g), CaCl ₂ • 2H ₂ 0 (7,56 g), KH ₂ PO ₄ (3,28 g) y la parte superior hasta un volumen de 2 L. Revuelva continuamente durante al menos 30 minutos utilizando un agitador magnético para asegurar que todos los reactivos se disuelven. Guarde el archivo en 4 ^{o C y} utilizar dentro de 2 semanas.
3. Antes de la disección y los experimentos, se diluye el stock de ACSF en un matraz aforado junto con la adición de cantidades requeridas de NaHCO ₃ y D-glucosa. Para una solución 1 L, diluir 100 ml de la acción a 1 L después de añadir 2,07 g _de NaHCO3 y 1,802 g de D-glucosa. La ACSF debe ser una solución clara libre de cualquier precipitado o partículas sin disolver.
4. Enfriar alrededor de 200-300 ml de ACSF en hielo, para ser utilizado durante la disección. Asegúrese de que la ACSF utilizada para la disección es de entre 2-4 ° C. Utilice la ACSF restante para electropexperimentos hysiological. Burbuja todas las soluciones ACSF a la saturación con carbógeno (5% de CO _2, 95% O ₂₎ de forma continua. A la espera de la ACSF se enfríe, preparar el área de disección y la cámara de corte.

2. Preparación de la Cámara de interfaz

NOTA: Una cámara de corte interfaz cerebro, que se utiliza para la incubación de los cortes y el mantenimiento de ellos durante registros electrofisiológicos (Figura 2B), se compone de dos compartimentos. La cámara inferior contiene agua mantenida a 32 ° C destila por un controlador de temperatura y se burbujeó continuamente con carbógeno.

1. Encienda el controlador de temperatura y preestablecido que a 32 ° C. Lave la cámara superior de 10 a 15 minutos mediante la ejecución de agua destilada a través de la tubería de entrada. Asegúrese de que la cámara superior está limpio antes de colocar la red. Compruebe que el nivel de agua en la cámara inferior es de aproximadamente 70% lleno de agua destilada.
2. Coloca elneta en la cámara superior para proporcionar una superficie de descanso para las rebanadas (Figura 2C). Ajuste el tubo de flujo de salida para asegurar que el nivel de la solución está suficientemente mojando toda el área de la red. Coloque la tapa encima de la red para mantener un ambiente humidificado carbógeno dentro de la cámara superior.
3. Ajustar la velocidad de flujo de 1 ml / min. Mantener esta velocidad de flujo a lo largo del período de incubación rebanada y el experimento. Comience carbogenating la ACSF 1x recién preparada y sumerja el tubo de entrada a la ACSF. Permita 20 minutos para el ACSF a saturarse con carbógeno y de la cámara superior para ser llenado con él.

3. Preparación de rodajas de hipocampo agudas

NOTA: El protocolo de disección consiste en (1) La eliminación del cerebro del animal en ACSF frío y (2) Aislamiento y corte en rodajas del hipocampo. A fin de que las neuronas que permanecen viables, aíslan y colocan cerebro en ACSF frío rápidamente y completar el conjuntoproceso que incluye cortar dentro de 3-5 min.

1. La extracción del cerebro en ACSF fría
   1. Coloque las herramientas de disección de la manera mostrada en la Figura 1A. Organizar las herramientas de acuerdo con el orden de uso para facilitar el proceso de disección. Antes de empezar, asegúrese de que todas las herramientas de disección están listos.
   2. Montar una hoja de afeitar, limpiado con acetato de etilo, etanol absoluto y agua destilada, en el helicóptero de tejido manual (Figura 1B), asegure firmemente y asegúrese de que el borde de corte está alineada de manera uniforme. Prueba de cortar un trozo de papel de filtro para asegurar que la hoja está firmemente asegurado. Ajuste el deslizamiento Vernier micrómetro a su posición inicial.
   3. La eutanasia del animal utilizando dióxido de carbono (CO ₂₎ en una cámara de inducción y decapitar con tijeras de vendaje o guillotina. Usando una tijera Iris, quitar la piel y de la piel por encima del cráneo. Haga un corte a través de la parte posterior para eliminar el brainstem.Make una pequeña incisión a lo largo ªe lado derecho del cráneo y una incisión más larga a la izquierda.
      ¡CUIDADO! Haga solamente una pequeña incisión en el lado que se utiliza para los experimentos para evitar dañarlo. Al insertar las tijeras, asegúrese de que la fuerza aplicada es hacia arriba para evitar daños en el cerebro.
   4. Retirar con cuidado el cráneo con un hueso rongeur comenzando desde la izquierda hacia el lado derecho del cráneo para revelar la corteza. Una fina capa de duramadre también puede ser visto. Retire con cuidado las placas frontales con la gubia. Eliminar la mayor parte de la duramadre, junto con las placas frontales.
      ¡CUIDADO! Tenga cuidado de que la duramadre no cortar a través del tejido cerebral.
   5. Retire la duramadre restante, en su caso, específicamente en la unión entre la corteza y el cerebelo con el extremo plano de una espátula. Para los pasos 3.1.5 y 3.1.6, es decir, mantener la presión hacia arriba, lejos del cerebro para evitar dañarlo. El uso de la espátula, cuchara suavemente el cerebro en una placa de Petri llena de frío y ACSF carbogenated (2-4 ° C), placed en un bloque de refrigeración de aluminio.
2. Aislamiento del hipocampo
   1. El uso de un bisturí, hacer un corte recto para extirpar el cerebelo y otro corte para quitar la parte anterior del cerebro (aproximadamente un cuarto). Hacer un corte superficial a lo largo de la línea media.
   2. Retire cuidadosamente la corteza con una hoz, a partir de la línea media para revelar el hipocampo dorsal. Retire la capa de la corteza anterior del hipocampo. Utilice los dedos o pinzas en ángulo para apoyar el cerebro. Hacer un pequeño corte en la comisura del hipocampo. Retire con cuidado el hipocampo con la hoz partir de hipocampo dorsal utilizando movimientos ondulantes.
      ¡CUIDADO! Sea amable para evitar el estiramiento y desgarro del hipocampo.
   3. Retire el córtex y los tejidos conectivos en todo el hipocampo aislada con la hoz.
3. Cortando el tejido del hipocampo y la transferencia de las rebanadas sobre la cámara de interfaz
   1. Coloque un pedazo de ACSF-papel de filtro empapado (Grado 1, 30 mm) en la etapa de corte de la máquina de cortar manual. Cucharada y colocar el tejido del hipocampo en el papel de filtro. Mueva el papel de filtro para alinear el hipocampo en una orientación adecuada en relación con la hoja de la máquina de cortar de manera que el hipocampo se corta en un ángulo de alrededor de 70 ^o a la fimbria.
   2. Seque el exceso de solución que rodea el tejido del hipocampo con un papel de filtro plegado (Grado 1, 85 mm), dejando el hipocampo ligeramente húmedo. Comience cortando el hipocampo transversalmente. Slice y desechar el tejido desde el extremo del hipocampo, donde la morfología rebanada no está claro.
   3. Cortar el tejido restante en rodajas micras de espesor 400. Recoge rodajas de hipocampo suavemente de la hoja con un cepillo con cerdas suaves usando movimientos birlar suaves y coloque las rodajas en un pequeño vaso lleno de ACSF carbogenated frío. Realice los pasos 3.3.1-3.3.3 lo más rápidamente posible ya que el tejido del hipocampo se expone al aire.
      NOTA: En general, las dos terceras partes del hipocampo se corta, y 4-6 rebanadas con morfología clara se pueden preparar.
   4. Transfiera las rebanadas suavemente en la red en la cámara de corte con una pipeta Pasteur de plástico limpio con una punta ancha (hecho cortando 2-3 cm de la punta). Ajuste cuidadosamente la posición de los cortes en la red utilizando una pequeña jeringa con una punta doblada. Coloque las rodajas de una manera que facilite la localización del electrodo y la grabación. Compruebe que las rodajas están suficientemente rodeados por ACSF pero no están sumergidas o flotantes (Figura 2C-D). Cubra la cámara e incubar las rodajas de 2/3 h.
      NOTA: La capa de células piramidales en los cortes sanos debe mostrar cierta transparencia.

4. Grabación de respuestas CA3-CA1 sinápticas

NOTA: La electrofisiología configuración utilizada para el campo de potencial de grabación se muestra en la Figura 2A. Un Faradías jaula se recomienda si la interferencia eléctrica está fuera del control después de la adecuada conexión a tierra de los ajustes eléctricos. Muchos tipos diferentes de cámaras sumergidas y de interfaz están disponibles comercialmente. Sin embargo, las cámaras de la interfaz se prefieren como rebanadas exhiben respuestas sinápticas más robustas en ellos.

1. Posicionamiento de electrodos
   1. Encienda el aparato eléctrico (estimuladores y amplificadores) que se utilizarán. Montar y asegurar los electrodos de estimulación y registro de los titulares de plexiglás de los micromanipuladores.
      NOTA: Utilizamos monopolar, laca recubiertos, electrodos de acero inoxidable de resistencia 5 mO tanto para fines de estimulación y registro.
   2. Antes de usar, inserte estos electrodos dentro de los capilares de vidrio tirados y asegurar con pegamento epoxi exponer sólo una pequeña porción de la punta del electrodo (Figura 2E). Esto da fuerza a los electrodos de lo contrario esbeltas y ayuda a asegurar con firmeza en el eletitulares ctrode.
   3. Guiada bajo el microscopio, coloque el electrodo (s) estimulante en el estrato radiado de la región CA1 para estimular las fibras colaterales de Schaffer y el electrodo de registro en la región dendrítica apical de CA1 para grabar (fEPSP) las respuestas de campo-EPSP.
      NOTA: Acercamiento de la superficie del líquido por encima de la rebanada con los electrodos da un sonido que ayuda a localizar rápidamente la superficie de la rebanada (proporcionado, el amplificador está conectado a un altavoz).
   4. En marcado y captura experimentos sinápticas, de acuerdo con la necesidad del experimento, dos posiciones o tres electrodos de estimulación (S1, S2 o S3) a cada lado del electrodo de registro para estimular dos o más entradas independientes pero superpuestos. Coloque los estimulantes y grabación de electrodos a unos 200 m de distancia.
   5. Si es necesario, localizar otro electrodo de registro en la capa de estrato piramidal para la grabación de pico de población (Figura 3A) .Cuando tanto elelectrodos han tocado el corte, utilizando el software de adquisición, dará una estimulación de prueba para asegurar una señal fEPSP adecuada.
      NOTA: Nosotros usamos, impulsos bifásicos de corriente constante (duración del impulso de 0,1 ms / de onda media) para la estimulación de prueba.
   6. Una vez que se obtiene una señal fEPSP adecuada, cuidadosamente baje los electrodos unos 200 m de profundidad utilizando mandos de movimiento fino de los manipuladores. Permitir 20 min para las rodajas se recuperen. Pon a prueba la independencia vía con una facilitación del protocolo de dos pulsos ^27,28.
2. Relación insumo-producto
   1. Determinar la relación de entrada-salida (estimulación aferente vs pendiente fEPSP) para cada entrada mediante la medición del valor de la pendiente en un rango de intensidades de corriente. Realice este entre 20 mu de 100 mu. A continuación, establezca la intensidad de estimulación para cada entrada para obtener 40% de la pendiente máxima fEPSP. Mantener esta constante durante todo el experimento.
   2. Después de 15-20 minutos, comenzará a grabar la línea de base. Supervisar el fEPSP pendiente de cerca durante este período y restablecer la intensidad del estímulo si la pendiente fluctúa más del 10% del valor de ajuste y comenzar una nueva línea de base. Registro al menos 30 minutos o 1 hora inicial estable antes de continuar.
      NOTA: Para la prueba o la estimulación basal, utilizamos cuatro barridos de 0,2 Hz bifásicos pulsos de corriente, constantes (0,1 mseg por polaridad) dados cada 5 minutos. Una inclinación de estas cuatro respuestas se considera entonces como una repetición. Las señales son filtradas y amplificadas por un amplificador diferencial, digitalizado utilizando un convertidor de analógico a digital y monitoreado en línea con el software hecho a medida.
3. La inducción de LTP / LTD usando los protocolos de estimulación
   NOTA: Tanto LTP y LTD han sido clasificados como temprano y tarde-LTP / LTD basado en los requisitos de la síntesis de proteínas; la traducción que requiere este último y / o transcripción de su difunto mantenimiento [de revisión ver ^4]. Una variedad de paradigmas de estimulación eléctrica puede specifically inducen las diferentes formas de LTP y LTD.
   1. WTET: 100 Hz, 21 pulsos bifásicos de corriente constante (0,2 mseg por fase).
   2. STET: Tres explosiones de 100 pulsos de un segundo (100 Hz) cada 10 minutos (Pulse ancho de 0,2 ms por fase).
   3. 900 ráfagas más de una duración 15 min. 1 explosión consta de 3 pulsos (0,2 ms de ancho) con un intervalo entre impulsos de 50 ms (20 Hz). El intervalo entre la explosión es de 1 seg (número total de pulsos 2.700).

5. Limpieza de la cámara de corte y sistema de perfusión

1. Después de la grabación ha terminado, recoja las rodajas de hipocampo para su posterior análisis bioquímico o de lo deseche de manera apropiada. Cierre el suministro de carbógeno y controlador de temperatura. Lave el pelele carbógeno en agua destilada.
2. Limpie la red a fondo con un cepillo y agua destilada. Lavar el equipo de perforación durante 15-20 min con agua destilada a una velocidad de flujo superior. Una vez en 3-4 días, cambiar el agua destilada en elcompartimento inferior de la cámara y también limpia la cámara regularmente con solución de peróxido de hidrógeno al 3% para evitar el crecimiento de hongos.

Results

La metodología descrita se ha utilizado para estudiar las formas de larga duración de LTP / LTD y sus interacciones asociativas tales como etiquetado sináptica y transversal de captura de cortes de hipocampo agudos de ratas adultas. ²³ Esta técnica ha demostrado ser eficaz para los experimentos con ratas (Wistar) y una variedad de cepas de ratón ^30,31. La metodología se ha utilizado con éxito para las grabaciones de LTP estables de hasta a 8-12 hr. ³²

La 'etiqueta' establecido por el tetanization débil de una entrada (S1) captura la inducida por la fuerte tetanization de otra entrada independiente, sino que se superponen "PPR" (S2; Figura 3B, círculos rellenos) transformando la forma en descomposición de otra manera de la LTP (principios -LTP) en S1 en una de larga duración de un (Figura 3B, círculos abiertos) (Para la comparación de las primeras LTP inducida por WTET ver ^20,33). Los PRP capturados por los débilesetiqueta de conjunto tetanization no necesariamente provienen de la inducida STET-tarde-LTP, pero también puede ser proporcionada por el inducido SLFS tarde-LTD. Este tipo de interacción asociativa positiva entre LTP y LTD se conoce como 'cross-tagging / captura ". La temprana-LTP inducida WTET en S1 se reforzó a finales del LTP (Figura 3C, círculos abiertos) mediante la captura de las PPR proporcionados por el inducido SLFS tarde-LTD en S2 (Figura 3C, círculos llenos). Estadísticamente potenciación o depresión significativa se mantuvo en S1 y S2 en ambos casos en comparación con su propia línea de base (prueba de Wilcoxon, p <0,05).

Para que se produzca la interacción-tag PRP, el orden temporal de los dos eventos (débil-fuerte antes de /-fuerte-débil antes) no es crucial siempre y cuando la ventana de tiempo entre los dos eventos se mantiene dentro del intervalo de 30-60 minutos. Sería conveniente incluir un tercero, independiente, pero la superposición sináptica enpuesto y lo utilizan como un control de la línea de base para monitorear la estabilidad de las grabaciones. Los protocolos de estimulación eléctrica utilizados para inducir formas temprana y tardía de LTP / LTD deben ser validados en experimentos de una sola entrada para la consistencia y fiabilidad antes de utilizarlos en experimentos STC. También nos gustaría hacer hincapié en la importancia de la metodología rebanada preparación se describe en el protocolo ya que el éxito de estos experimentos se basa en gran medida de la calidad de las lonchas.

Figura 1. Herramientas (A) utilizados en la disección del hipocampo: (a) Vendaje Tijeras (b) Iris tijeras (c) gubia ósea (d) una espátula fina, (e) el número de bisturí 11 (f) hoz (g) Soft pincel -bristle (h) de plástico pipeta Pasteur (i) de papel de filtro (85 mm) (j) de papel de filtro (30 mm) (k) vasos de vidrio (l) bloques de refrigeración de aluminio para adaptarse placa de Petri y cubiletesplato (m) Petri. (B) cortador de tejidos manual. (a) Plataforma (b) corte el brazo con portacuchillas (c) Vernier micrómetro, la resolución de 10 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Electrofisiología configuración para la grabación de potencial del campo que consisten de estimuladores (A) (b) un amplificador diferencial (c) un convertidor analógico a digital (d) del osciloscopio (e) ordenador con software de adquisición (f) de vibraciones sobremesa resistentes (g) microscopio con> 4x magnificación (h) de la interfaz de cámara cerebro-slice (i) un sistema de perfusión para el regulador de temperatura ACSF y carbógeno alimentación (j) (k) una fuente de iluminación (l) manipuladores con los titulares de los electrodos. (B) Interfaz cerebro-slicecámara. (C) y (D) rodajas de hipocampo en la cámara de interfaz. electrodos de acero (E) de acero sellado en un capilar de vidrio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. (A) Representación esquemática de una rebanada y el electrodo ubicación del hipocampo transversal para la grabación-potencial de campo: En esta representación, dos electrodos de estimulación (S1 y S2) se colocan en el stratum radiatum de la región CA1 para estimular dos independientes pero solapamiento entradas sinápticas neuronas piramidales CA1 Onto. Dos electrodos de registro extracelular, uno para grabar campo EPSP (potencial excitatorio postsináptico) del compartimiento dendrítico apical y otra para grabar somática pico de población de la célula piramidalcuerpos, se encuentran en el estrato radiatum y estrato piramidal respectivamente. CA1- cornu ammonis región 1, CA3- cornu ammonis región 3, giro dentado DG-fibras colaterales SC- Schaffer, S1-estimulante electrodo 1, electrodo S2 estimulante 2. (B) Débil antes fuerte paradigma para estudiar STC: tetanization Débil (WTET) se aplica a S1 (círculos abiertos) para la inducción de LTP temprana seguida de tetanization fuerte (STET) de S2 (círculos rellenos) en 30 min para inducir la tarde-LTP. La temprana-LTP en S1 se reforzó a finales del LTP mostrando etiquetado y capturar la interacción (n = 6) (C) Débil antes fuerte paradigma para estudiar cruz-etiquetado:. Temprano-LTP es inducida por WTET en S1 (círculos abiertos), seguido por la inducción de la tarde-LTD en S2 (círculos rellenos) utilizando SLFS después de 30 minutos. En S1, a principios-LTP se transforma en tarde-LTP duración de 6 horas mostrando cruz-etiquetado y captura (n = 6). Flecha individual representa tetanization débil aplicada para la inducción temprana-LTP. Triplete de flechas representafuerte tetanization para inducir tarde-LTP. La flecha discontinua representa el punto de tiempo en el que SLFS se aplica a la entrada sináptica representante para inducir la tarde-LTD. Las barras de error indican SEM. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Corte de hipocampo aguda es un excelente sistema modelo para el estudio de LTP y otros procesos de plasticidad funcionales tales como STC y transversal de captura. Se conserva gran parte de la red estructural laminar de los circuitos del hipocampo, permite localizaciones de los electrodos precisos y ofrece al lado, una plataforma abierta para la rápida manipulación neurofarmacológico sin una barrera sangre-cerebro.

En este artículo se describe la metodología para la preparación de cortes de hipocampo agudas viables de ratas adultas jóvenes y utilizarlos para investigar STC y cross-tagging. Investigaciones anteriores han hecho hincapié en que el género y la edad de los animales son factores importantes a considerar para su uso en estudios de electrofisiología. Se utilizan ^27,28 animales adultos tanto jóvenes con las funciones de los receptores adultos plenamente expresadas (ratas Wistar machos de entre 5-7 semanas). ²³ Asimetrías en las conexiones entre el hipocampo izquierdo y derecho se han observado en los roedores y ²⁹principales diferencias en la expresión del receptor de NMDA han sido reportados como bien ^34. Hemos utilizado el hipocampo derecho con el fin de ser coherente con nuestros estudios anteriores LTP. ^23,32 Sin embargo, ninguno de los hipocampos se puede utilizar siempre y cuando se mantenga la coherencia.

Como en cualquier protocolo, es muy importante para llevar a cabo el aislamiento y cortar procedimientos rápidamente, pero teniendo cuidado de que el tejido no se estira, dañado, rindió seco o hipóxica. Las variaciones en el pH, la temperatura y la composición iónica de las soluciones pueden tener un efecto profundo sobre la viabilidad de las rebanadas y los resultados. Por lo tanto tales variaciones deben ser evitados. Se ha observado que la liberación de calcio dependiente del receptor de glutamato que ocurren durante las etapas de preparación puede afectar irreversiblemente la síntesis de proteínas en el tejido nervioso ^{35,36, 37.} El uso de máquinas de cortar tejidos manuales puede ayudar a minimizar este al permitir que el proceso se complete muy rápidamente en comparación con vibraslicers. Sin embargo, muchos laboratorios también utilizan efectivamente vibraslicers con las precauciones necesarias para preservar la viabilidad de la rebanada. Otro factor importante a considerar es el largo período de incubación antes de comenzar los experimentos. Esto se ha observado que es realmente crucial para lograr la estabilidad en los niveles estatales y activación quinasa metabólicos en las rebanadas después de la perturbación causada durante la preparación ^23. Dicha estabilidad es necesaria para mantener la coherencia en las grabaciones de larga duración. Nos re-enfatizar en esta observación y sugerimos las largas horas de incubación de alrededor de 3 horas.

Una variedad de parámetros de estimulación son conocidos para inducir LTP, pero los mecanismos moleculares provocados en cada caso puede no ser el mismo (para revisión ver ^38). Esto puede influir en la durabilidad y otras características de la LTP, que, a su vez, pueden afectar los resultados de marcado y captura experimentos sinápticas. Por lo tanto es importante validar los paradigmas y las características de estimulacióndel suscitó LTP en las condiciones del laboratorio que realice y mantener la consistencia.

Por lo general, no consideramos experimentos con grandes salvas de fibras presinápticas y con fEPSPs máximas de menos de 0,5 mV y los experimentos que implican cambios sustanciales en la volea de fibra durante las grabaciones también se rechazan. Además, aunque la realización de la vía de dos o tres experimentos de la vía, es importante para garantizar la independencia vía. Esto puede llevarse a cabo con un protocolo de facilitación dos pulsos ^28.

Una desventaja de los sistemas de grabación de interfaz es la formación de gotas de condensación en los electrodos durante las horas de grabación largos debido a las diferencias de temperatura y humedad entre la cámara y los alrededores. Estas gotitas deben ser cuidadosamente borrado de vez en cuando. De lo contrario, las gotitas pueden gotear sobre las rebanadas y causar perturbación o incluso la pérdida de señales. Por lo general, abordamos este by secante hábilmente las gotitas guiadas bajo el microscopio utilizando una delgada mecha de papel de filtro, sin tocar los electrodos. Sin embargo, la mejor solución sería utilizar un sistema de calefacción centralizada, tal como el sistema ETC desarrollado por la Universidad de Edimburgo investigadores.

En una nota final, existe una variedad de metodologías en los laboratorios de todo el mundo que se utilizan para la preparación de cortes de hipocampo para diferentes propósitos experimentales. Cada uno de los procedimiento ofrece algunas ventajas sobre el otro. Uno tiene que optimizar cuidadosamente los detalles minuciosos de el protocolo para adaptarse a la finalidad del experimento. Esperamos que este artículo le ayuda en la mejora de algunos aspectos de la metodología para el estudio de los procesos asociativos tardías como STC y transversal de captura.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
I. Herramientas de
1. Tijeras para vendas	KLS Martin, Alemania	21-195-23-07
	B-Braun/Aesculap, Alemania	LX553R
2. Tijeras de iris	B-Braun / Aesculap, Alemania	BC140R,
		BC100R
3. Bone rongeur	World Precision Instruments (WPI), Alemania	14089-G
4. Scalpel	World Precision Instruments (WPI), Alemania;	500236-G
	B-Braun/Aesculap, Alemania
		BB73
5. Hoja de bisturí#11	B-Braun/Aesculap, Alemania	BB511
6. Raspador de hoz	KLS Martin, Alemania	38-685-00
7. Pinzas angulares	B-Braun/Aesculap, Alemania	BD321R
8. Cámara de anestesia/inducción	MIP Anesthesia Technologies (ahora, Patterson Scientific), Oregón	AS-01-0530-LG
II. Productos químicos componentes de
1. Cloruro de sodio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S5886
2. Cloruro de potasio (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541
3. Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4.7H20)	Sigma-Aldrich	M1880
4. Cloruro de calcio dihidratado (CaCl2.2H2O)	Sigma-Aldrich	C3881
5. Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791
6. Bicarbonato de sodio (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761
7. D-Glucosa anhidra (C6H12O6)	Sigma-Aldrich	G7021
III. Instrumentos
1. Microscopio	Olympus, Japón	Modelo SZ61
2. Controlador de temperatura	Scientific Systems Design Inc. Canadá	PTC03
3. Amplificador de CA diferencial	AM Systems, EE. UU	Modelo 1700
4. Estimulador de pulso aislado	AM Systems, EE. UU	Modelo 2100
5. Osciloscopio	Rhode & Schwarz	HM0722
6. Convertidor digital-analógico	Cambridge Electronic Design Ltd. Cambridge, Reino Unido	CED-Power 1401-3
7. Interface Brain Slice Chamber	Scientific Systems Design Inc. Canadá	BSC01
8. Bomba de tubo	Ismatec, Idex Health & Ciencia, Alemania	REGLO-Analog
9. Caudalímetro de carbógeno	Cole-Parmer	03220-44
10. Iluminador de luz de fibra	Dolan-Jenner Industries	Fiber Lite MI-150
11. Micromanipuladores	Marzhauser Wetzlar, Alemania	00-42-101-0000 (MM-33)
		00-42-102-0000 (MM-32)