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Artículo de método

La estimulación del nervio vago como una herramienta para inducir plasticidad en vías pertinentes para el Aprendizaje Extinción

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DOI:

10.3791/53032

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21 de agosto de 2015

 ,  ,  , 
1School of Behavioral and Brain Sciences, The University of Texas at Dallas

En este artículo

Resumen

La estimulación del nervio vago (VNS) se ha convertido en una herramienta para inducir plasticidad sináptica específica en el cerebro anterior para modificar una serie de comportamientos. Este protocolo describe cómo implementar VNS para facilitar la consolidación de la memoria miedo extinción.

Resumen

Extinción describe el proceso de atenuar las respuestas conductuales a estímulos neutros cuando ya no proporcionan el refuerzo que ha estado manteniendo la conducta. Existe una estrecha correspondencia entre el miedo y la ansiedad humana y, por lo tanto, los estudios sobre el aprendizaje de la extinción podrían proporcionar información sobre la naturaleza biológica de los trastornos relacionados con la ansiedad, como el trastorno de estrés postraumático, y podrían ayudar a desarrollar estrategias para tratarlos. La investigación preclínica tiene como objetivo ayudar al aprendizaje de la extinción e inducir la plasticidad específica en los circuitos de extinción para consolidar la memoria recién formada. La estimulación del nervio vago (ENV) es un enfoque poderoso que proporciona una liberación temporal y específica del circuito de neurotransmisores, lo que resulta en la modulación de las redes neuronales involucradas en una tarea en curso. La VNS mejora la consolidación de la memoria tanto en ratas como en humanos, y el emparejamiento con la exposición a señales condicionadas mejora la consolidación del aprendizaje de la extinción en ratas. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para la preparación de piezas a medida y los procedimientos quirúrgicos necesarios para VNS en ratas. Usando este protocolo mostramos cómo VNS puede facilitar la extinción de las respuestas de miedo condicionadas en una tarea de condicionamiento auditivo del miedo. Además, aportamos evidencias de que la ENV modula la plasticidad sináptica en la vía entre la corteza prefrontal medial infralímbica (IL) y el complejo basolateral de la amígdala (BLA), que está implicado en la expresión y modulación de la memoria de extinción.

Introducción

Clásica miedo acondicionado proporciona un modelo animal ampliamente utilizado para estudiar las bases biológicas de los trastornos de ansiedad. Durante el condicionamiento del miedo, un estímulo aversivo (el estímulo no condicionado, Estados Unidos, por ejemplo, una descarga en las patas) se presenta en conjunción con un estímulo neutro, tal como un tono y / o un contexto (el estímulo condicionado; CS). Durante el condicionamiento del miedo, se forman asociaciones entre el CS y los EE.UU.. Finalmente, la presentación de la CS solo provoca una respuesta de miedo (la respuesta condicionada; CR). En el miedo extinción, el CS se presenta repetidamente en ausencia de los EE.UU., haciendo que el CR para disminuir gradualmente 1. Por lo tanto, la extinción del miedo condicionado es un proceso activo en el que se atenúan las respuestas de comportamiento de miedo a los estímulos neutros cuando ya no predicen resultados aversivos. La extinción de las respuestas condicionadas requiere consolidación de nuevos recuerdos que compiten con las asociaciones aprendidas. Una característica distintiva de los trastornos de ansiedad es impaextinción ired 2-4. Por lo tanto, la extinción del miedo condicionado en modelos animales sirve como un paradigma importante tanto para el aprendizaje inhibitorio y como un modelo de terapia de comportamiento para los trastornos de ansiedad humanos 5,6.

Debido a que existe una estrecha correspondencia entre el miedo y la ansiedad humana, se cree que estos estudios pueden dar una idea de la naturaleza biológica de los trastornos relacionados con la ansiedad, como el trastorno de estrés post-traumático y ayudarán a desarrollar estrategias para tratarlas. Un objetivo importante de la investigación preclínica es para ayudar a la extinción de aprendizaje e inducir plasticidad específica en los circuitos de extinción para consolidar el aprendizaje extinción. Estimulación del nervio vago (VNS) es un enfoque neuroprosthetic mínimamente invasiva que podría utilizarse para proporcionar modulación temporal y específica de circuito apretado de las áreas del cerebro y las sinapsis que participan en una tarea en curso. Una serie de estudios recientes del grupo de Michael Kilgard en la Universidad de Texas en Dallas tienense muestra que el apareamiento VNS con estímulos sensoriales o motoras discretas (por ejemplo, un tono o un tirón de la palanca) es altamente eficaz en la promoción de plasticidad cortical para tratar el tinnitus 7, o para superar los déficits motores después del accidente cerebrovascular 8-10. Además, no contingente VNS que ocurre dentro de una corta ventana de tiempo después de aprender promueve igualmente la plasticidad cortical y mejora la consolidación de la memoria en ratas y en humanos 11-13.

Teniendo en cuenta el papel del nervio vago en la vía parasimpático, no es sorprendente que podría participar en la modulación de las memorias y la plasticidad sináptica. Eventos emocionales altamente tienden a producir recuerdos más fuertes que los recuerdos no emocionales. Esto es probablemente debido a la influencia de las hormonas del estrés en la consolidación de la memoria. Post-entrenamiento la administración de la hormona del estrés adrenalina aumenta consolidación de la memoria en los animales humanos y no humanos, pero la adrenalina no cruza la barrera sangre-cerebro-barrera 14, 15 . Por lo tanto, la liberación de adrenalina inducida por el estrés debe afectar el cerebro indirectamente para mejorar la consolidación de la memoria. Una fuerte evidencia sugiere que el nervio vago puede ser el vínculo entre circulante adrenalina y el cerebro. Miyashita y Williams 16 encontraron que la administración sistémica de adrenalina aumentó de tiro del nervio vago, y el aumento de los niveles de norepinefrina en la amígdala 17. La administración sistémica de adrenalina no mejora la consolidación de la memoria cuando los receptores β-adrenérgicos están bloqueados en la amígdala 18 lo que sugiere que el nervio vago juega un papel en la vía que convierte experiencias excitantes emocionalmente en recuerdos a largo plazo.

Por lo tanto, la vinculación VNS con el entrenamiento tiene el potencial para mejorar los cambios cerebrales que apoyan la consolidación de la memoria y la exposición a las señales condicionadas en ausencia de refuerzo aumenta la consolidación del aprendizaje de la extinción en ratas 19,20. Aquí se describe el uso de un VNSsa herramienta para promover la plasticidad cortical y facilitar la extinción de una respuesta de miedo condicionado.

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Protocolo

Todos los procedimientos descritos en este protocolo se llevan a cabo de conformidad con la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, y que fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Texas en Dallas.

1. Construcción de VNS Puños

  1. Crear una herramienta de perforación por cortar la punta de una aguja de 22 G ½.
  2. Ejecute el final ahora romo de la aguja de 22 G ½ sobre un archivo de metal varias veces para aplanarlo. Mantenga la aguja en un ángulo de 45º en el fichero y ejecutarlo varias veces en el archivo mientras gira. Esto hará que el metal se convierta en más delgado y furl hacia adentro. PRECAUCIÓN: Inserte la punta del bisturí en el extremo cortado de la aguja y girar con un poco de fuerza hacia abajo para desplegar el metal.
  3. Use binoculares de aumento para los pasos restantes de la sección 1.
  4. Usando un bisturí (10 o 15 de la cuchilla) cortar segmentos de 4 mm de tubo.
  5. Coloque un segmento de 4 mm sobre unapequeña broca u otra herramienta de forma similar. Esto es para mantener el tubo en su lugar mientras está siendo manipulado.
  6. Perforar 4 agujeros en el tubo (Figura 1A). Los agujeros deben hacer los cuatro puntos a 2 mm por 2 mm de lado y deben estar limpias y sin asperezas.
    NOTA: La herramienta de perforación necesita ser afiladas (paso 1.2) cada 2 o 3 agujeros. Dificultad con este paso es casi seguro que debido a una herramienta de perforación que no es lo suficientemente fuerte.
  7. Con el tubo todavía en la broca, utilizar un bisturí para cortar el tubo longitudinalmente entre los agujeros de modo que dos agujeros terminan a ambos lados del corte (Figura 1B).
  8. Utilizando una aguja de coser e hilo de sutura, pasar la sutura a través de los agujeros para crear el aparejo para la colocación definitiva de la banda alrededor del nervio vago. Comience con la aguja en el interior del manguito y pasarlo a través de uno de los agujeros, y luego volver a través del agujero adyacente desde el exterior (Figura 1C). Ate el thread juntos ~ 2 cm desde el plástico de modo que el tubo y el hilo de hacer un triángulo. Permitir ~ 8 cm de hilo después de que el nudo y el asiento. Repita el proceso para los orificios en el lado opuesto del corte. El tubo está ahora listo para ser conectado.
  9. Prepare los cables de los puños.
    1. Cortar el alambre de platino iridio en segmentos de 70 mm.
    2. Utilizando el mejor consejo para la antorcha de la joyería, crear una llama fuerte con azul de centro que es tan refinada como sea posible y lo utilizan para despojar ~ 1 cm del revestimiento plástico del alambre. Aplicar el centro azul de la llama al extremo pelado del cable para crear una pequeña bola. Aplicar el centro azul de la llama a varios puntos de la parte desnuda de fusionar los siete hilos juntos. El cable en estos lugares se parecen doblar.
    3. En el extremo opuesto del cable, aplicar el centro azul de la llama hasta el final para crear una pequeña bola. Minimizar separar el plástico en este extremo.
  10. Conectar el manguito (Figura 1D).
    NOTA: Steps en la sección 1.10 debe hacerse bajo los prismáticos de aumento.
    1. Tape el manguito hacia abajo usando los hilos de manera que se orienta con el corte corriendo horizontalmente. Tire de los hilos apretados para que el brazalete se abrió y luego con cinta adhesiva por las roscas.
    2. Sujete el extremo balled del lado pelado del cable preparado con # 5 pinzas y empujar a través del orificio inferior derecha. Tire de las pinzas fuera del agujero, dejando el extremo del alambre en el medio del manguito.
    3. Vuelva a captar el final balled del cable pelado (ahora en el centro del manguito) y empujarlo a través del agujero superior derecha. Tire de las pinzas fuera del agujero, dejando el alambre pasa completamente a través del manguito y suelta en el lado superior del manguito.
    4. Vuelva a captar el final balled del cable pelado (ahora fuera del manguito en la parte superior) y empuje de nuevo a través del orificio superior derecha de la parte interior. Continúa haciéndolo hasta que el cable esté firmemente en su lugar: prueba tirando en el extremo opuesto del cable.
      NOTA:Durante este proceso es crítico para diferenciar las porciones aisladas / pelados del alambre. El alambre que se coloca en última instancia en el "canal 'del manguito debe ser despojado, pero todo por debajo de los orificios inferiores (fuera del manguito en el extremo inferior) debe estar aislado. Esto asegura el suministro de corriente sólo para el nervio vago.
    5. Sujete el extremo balled del lado aislado y empujarlo a través del agujero de la parte inferior derecha de la parte interior del manguito, enrollarlo alrededor de una vez.
    6. Repita los pasos 1.10.2 - 1.10.5 en el lado izquierdo del manguito de manera que dos alambres terminan fijado a la tubería, uno en el lado derecho y otro en el lado izquierdo.
    7. Coloque un alfiler de oro en el brazo de la mano con el agujero hacia arriba. Llene el agujero con fundente.
    8. Suelda el extremo aislado del alambre (ahora unido al manguito) en el pasador.
    9. Permita que la soldadura se enfríe, y luego se funden de nuevo. Esto asegura una buena conexión entre el extremo del alambre y el inside del pasador. Aplicar más de soldadura si es necesario. Repita para el segundo alambre.
    10. Con los cables corriendo hacia la derecha, marque la parte superior del manguito con marcador permanente. También marcará el broche de oro unido a la iniciativa parte superior.

2. Construcción de casquete de VNS Sitio entrada

  1. Cortar 30 segmentos de 26 mm de alambre de cobre AWG. Franja de una pequeña porción en cada extremo.
  2. Corte el extremo estrecho de alfileres de oro sueltos y soldar el extremo pelado del cable al extremo del corte de la espiga de oro. Cree dos compuestos alambre / pin para cada sitio de entrada deseada. Coloque un conector en las manos que ayudan y soldar el extremo del cable de un compuesto de alambre / pin a la cada uno de los dos dientes fundente del conector (Figura 2G).
  3. Marque uno de los cables con Sharpie. Durante la cirugía, colocar el implante con el rostral alambre marcado al cable sin marcar.

3. VNS Cirugía

  1. Crear herramientas de vidrio personalizada para manejo de Vagus nervio durante la cirugía.
    1. Utilice vidrio borosilicato para tirar de una micropipeta para que tenga una punta larga cónica. Si no extractor de pipeta está disponible, romper el vidrio para crear un borde más largo.
    2. Mantenga el extremo no ahusada de la pipeta con un paño grueso (para evitar quemaduras) y presione el extremo cónico / roto en una superficie resistente al fuego suave, mientras que la aplicación de la llama azul de la antorcha de la joyería para el extremo cónico. El vidrio se dobla ya que se presiona en la superficie. Aplicar la llama hasta que un gancho o formas forma J.
  2. Procedimientos quirúrgicos VNS
    1. Reunir y esterilizar todas las herramientas. Prepare un área quirúrgica sanitaria, calefacción.
    2. Anestesiar los animales con ketamina / xilazina (85 mg / kg, 5 mg / kg, IP). Evaluar la profundidad del plano anestésico mediante la supervisión de las vocalizaciones de los animales y de abstinencia-reflejos en respuesta a los pies y / o pellizcos cola.
    3. Afeitarse la parte superior de la cabeza y el lado izquierdo del cuello del animal. Proteja los ojos del animal con la mineraaceite o ungüento al ojo. Aplique una solución de yodo de limpieza con una gasa y luego alcohol con una gasa para las áreas afeitadas. Repita una vez.
    4. Inyectar 0,05 ml marcaına por vía subcutánea en la parte superior de la cabeza y permitir que el bolo para dispersar mientras que la colocación del animal en el instrumento estereotáxico.
    5. Utilice un bisturí para realizar una incisión en la piel sobre el cráneo para exponer tanto lambda y bregma. Preparar el camino para el manguito utilizando fórceps romos para subcutáneamente túnel desde el lugar de la incisión en el lado izquierdo en la parte delantera de la oreja en el lado izquierdo del cuello.
    6. Tire de la zona de la incisión abierta con pinzas hemostáticas. El uso de hisopos de algodón, aplique peróxido de hidrógeno en el cráneo expuesto a eliminar cualquier tejido restante.
    7. El uso de un bisturí, perforar dos agujeros de arranque poco profundas en el cráneo para colocar tornillos de anclaje. Deben colocarse lo suficientemente separados para dejar espacio para el implante, pero no demasiado cerca de los tejidos circundantes. Evite colocar tornillos directamente en la línea media.
      1. Con la fuerzaps y un destornillador, conducir un tornillo de hueso en los dos agujeros. Los tornillos deben estar apretados en los agujeros, con las tapas de 2-3 mm por encima de la superficie del cráneo para dejar espacio para el acrílico para rellenar debajo y alrededor de los tornillos.
    8. Llenar el espacio debajo, alrededor y entre los tornillos con una pequeña cantidad de acrílico, evitando el tejido circundante. A continuación, colocar una mayor cantidad de acrílico en el medio del cráneo entre los dos tornillos.
    9. Coge el implante de modo que el cable marcado está orientado rostral al cable sin marcar y colocar rápidamente el implante en el acrílico, teniendo cuidado de no obtener acrílico en los pines de oro, la zona del corchete, o en el sitio de entrada en la parte superior. Una vez colocado dejar solidificar ~ 5 min hasta que se seque. Esto también se puede hacer usando el brazo de la estereotáxico para el apoyo. Rellene las grietas o huecos entre el implante y el cráneo con una baja viscosidad de la mezcla de acrílico. Deje que se seque.
    10. Use binoculares de aumento para los pasos restantes de la sección 3.2.
    11. Retire ªe animales desde el instrumento estereotáxico. Colocar el animal sobre su lado derecho, girando ligeramente hacia la posición ventral.
    12. Hacer una pequeña incisión aproximadamente sobre la vena yugular izquierda. El hueso de la mandíbula y la clavícula deben ser más o menos la misma distancia a la zona de la incisión. Ampliar la incisión utilizando disección roma hasta que se alcance la capa muscular. Los esternocleidomastoideo, esternohioideo y omohioideo músculos deben ser visibles. Use retractores músculo para mantener el sitio libre.
    13. Continuar disección roma lo largo de los surcos naturales entre los músculos. Busque el pulso de la arteria carótida. La partida a través del músculo hacia el pulsante revelará la arteria carótida. Tire de los músculos de la espalda con el retractor muscular. La vaina que contiene la arteria carótida también contiene el nervio vago. Cuidadosamente embotar diseccionar la vaina con las tijeras.
    14. Identifique el nervio vago. Es el nervio más grande en la vaina carotídea y es por lo general hacia el lado del animal izquierda de la arteriapero se puede encontrar en cualquier lado. Cambie a las herramientas de cristal de encargo y separar el nervio vago de la arteria carótida. El nervio debe estar libre de cualquier otro tejido durante al menos 5 mm.
    15. A partir de la incisión en la cabeza, utilizando los hilos en el lado opuesto del manguito de los cables, tire del manguito a través del túnel subcutáneo previamente hecha con fórceps o pinzas hemostáticas pequeñas. Empujarlo a través del tejido en el sitio de la incisión en el cuello.
    16. Levante con cuidado el nervio usando las herramientas de vidrio y empujar los hilos en el lado del manguito opuesta los cables bajo el nervio. Tire de los hilos hasta el final, con cuidado de no rozar el nervio. El manguito debe ser inmediatamente adyacente al nervio.
    17. Asegúrese de que el brazalete está orientado con el lado marcado 'top' superior. La caída de la nervio en el centro del manguito. El nervio ahora debe mentir a través de ambos cables en el canal del manguito (Figura 2B). Ate los hilos juntos para cerrar el puño.
    18. En el casquete, conecte los pernos fijados al manguito en los pines de oro en el sitio de entrada de la estimulación. Conecte la clavija marcada en el broche de oro unido al diente más anterior en el sitio de entrada de simulación.
    19. Para verificar que el manguito estimula adecuadamente el nervio vago, realizar una interrupción de la respiración de prueba por, que conecta el estimulador para el sitio de entrada de la estimulación en el headcap y funcionando estimulación (0,2 mA, 60 Hz, hasta 10 segundos). La respiración debe detenerse brevemente y de la frecuencia cardíaca debe caer, la verificación de la función del manguito.
    20. Asegure los pasadores en el sitio de entrada de la estimulación con acrílico. Cubra los cables y verifique que los pernos y cables expuestos no conducen a cortocircuitos. Utilice acrílico para suavizar las irregularidades o para llenar los vacíos. Deje que se seque.
    21. Sutura cerrada ambos sitios de incisión. Inyectar 0,05 ml por vía subcutánea marcaına cerca del sitio de la incisión del cuello. Aplique ungüento antibiótico a la incisión sitios. Opcionalmente, deje un conector macho en su lugar en el sitio de entrada a la estimulaciónevitar daños o la obstrucción durante el proceso de curación.
    22. Se trata con antibióticos y siga el cuidado post-operatorio estándar, incluyendo la analgesia adecuada. Vuelta de los animales a las instalaciones de alojamiento de los animales después de recuperar la movilidad. Permita 5 días de recuperación. Para asegurar la longevidad máxima y la función de la headcap, animales de casa individualmente para el resto del experimento.
      NOTA: ratas Sham-VNS se someten a la misma cirugía, sin embargo, el circuito está diseñado para corto a nivel de la headcap (es decir, un headcap se implanta y el nervio vago se separa de la arteria carótida, pero no del manguito de electrodo se coloca alrededor de la nervio).

4. auditivo miedo acondicionado

NOTA: Este protocolo acondicionado temor es más intensa que la mayoría 21 porque el objetivo de estos experimentos es para mejorar la extinción. Con leves condicionamiento del miedo que se extingue fácilmente, un efecto suelo puede ocultar esta mejora.

  1. Animales Casa en un 12 horas de luz / oscuridad ciclo con acceso ad libitum a comida y agua. Manejar los animales todos los días durante la recuperación de la cirugía.
  2. Configure el aparato de acondicionamiento y las pruebas, que consiste en una caja operante alojada en una cámara de sonido atenuado (Figura 2C). La caja operante tiene paredes transparentes de plástico, 20 x 20 x 20 cm, y tiene un suelo de rejilla de acero inoxidable que está conectado a un generador de choque pie. Use una casa de luz blanca para iluminar la cámara para la grabación de vídeo. Use un 9 kHz, 85 dB SPL tono como estímulo condicionado.
  3. Comportamiento de grabación con una cámara digital se encuentra dentro de la cámara, por encima de la caja operante. Ver y controlar la sesión en un equipo situado fuera de la sala de comportamiento. Guardar videos para su posterior análisis.
  4. Limpie cámaras con etanol al 70% antes y después de cada sesión de eliminar señales olfativas.
  5. Miedo-acondicionar las ratas durante 2 días (Figura 3A). Confirme que las ratas no están endamente miedo del tono mediante la presentación de 5 tonos (9 kHz, 85 dB, 30 seg) en el primer día. Asegúrese de que los niveles de congelación son insignificantes.
    1. Siga las presentaciones de tono iniciales con 8 tonos-descarga en las patas (1 seg, 0,5 mA) emparejamientos en cada uno de 2 días consecutivos. Repita los emparejamientos tono estímulo eléctrico plantar de nuevo en el segundo día. Varíe la-estímulo-intervalo entre (ISI) entre 2 y 4 minutos, con un promedio de 3 minutos para cada prueba. Aleatorizar el punto en el que se produce el choque durante el tono.
  6. En el tercer día, probar la fuerza de la asociación de tono / shock. Juego 4 tonos con un ISI de 3, 4, o 5 minutos (4 min promedio) en ausencia de estímulo eléctrico plantar y registrar el comportamiento de congelación de los animales durante las presentaciones de tono y durante las interrelaciones de estímulo intervalos como medidas de la respuesta de miedo acondicionado (CFR).
  7. El día 4, comenzar el entrenamiento de extinción con VNS o Sham VNS.
    1. Conecte las ratas en el estimulador mediante la inserción de los conectores macho de la stimulatoR en el sitio de entrada de estimulación. Coloque los animales en la cámara (Figura 2A, 2C). Ajuste el estimulador a 0,4 mA, 500 mu s de ancho de pulso a 30 Hz. Establecer estimulación para una duración total de 30,15 seg, comenzando 150 mseg antes de la aparición del tono. Juega animales 4 tonos (como en el paso 4.6) y vincular cada presentación tono con VNS o Sham VNS.
  8. Periódicamente probar la integridad eléctrica del manguito y la entrada de sitio usando un osciloscopio.
    1. Enchufe el animal en como normal y dividir la salida del estimulador para el osciloscopio.
    2. Ajuste el rango en el osciloscopio como -20 V a +20 V y ejecutar la estimulación. La forma de onda de la estimulación de 30 Hz debe ser visible en el osciloscopio. Estímulos que superen los 10 V de tamaño indican una alta impedancia y un manguito mal funcionamiento o conexión en el lugar de entrada de la estimulación.
  9. Para probar el efecto de la estimulación del nervio vago en la formación extinción ejecutar una segunda prueba CFR (como en el paso 4.6)el día 5. Registre el tiempo dedicado a la congelación durante las presentaciones de tono y compara a la congelación de referencia registrada durante la primera prueba CFR (paso 4.6).
  10. Analizar los vídeos mediante un observador independiente que es ciego a las condiciones de tratamiento. Mida el tiempo dedicado congelación durante las presentaciones de tono utilizando un cronómetro. La congelación se define como la inmovilidad completa, durante el cual la rata presenta respiración rápida, la cabeza baja, y se extendieron las patas 22. Análisis del comportamiento de la congelación se puede dividir en dos fases: durante la presentación tono y durante el intervalo entre estímulos.

5. En Vivo Grabaciones de potenciales evocados de campo

Nota: Este paso es opcional. Potenciales evocados de campo (EFP) se registran 24 horas después de las pruebas de restauración (día 5) en ratas anestesiadas con isoflurano montados en un aparato estereotáxico, siguiendo procedimientos estándar 23,24.

  1. Reunir y esterilizar todas las herramientas.
  2. Inducir la anestesia con isoflurano (5% en el 100% de oxígeno, caudal 1l / min) en una cámara de plástico transparente. Evaluar la profundidad del plano anestésico mediante la supervisión de las vocalizaciones de los animales y de abstinencia-reflejos en respuesta a los pies y / o pellizcos cola. Utilice aceite mineral o ungüento para los ojos para proteger los ojos.
  3. Inyectar 0,05 ml marcaına subcutánea en la parte superior de la cabeza y deje que el bolo se disperse. Utilice un bisturí y pinzas para quitar el casquete del cráneo. Utilice la menor fuerza posible para evitar oscurecer bregma.
  4. Colocar el animal en el instrumento estereotáxico. Utilice un bisturí para ampliar la incisión para exponer tanto lambda y bregma. Mantener plano anestésico con isoflurano (3% en oxígeno al 100%, caudal de 1 L / min) a través de un cono de nariz.
  5. Perforar los agujeros en el cráneo por encima de la corteza prefrontal infralímbica (IL) y la amígdala basolateral (BLA). Baje unos microelectrodos de vidrio (2 M KCl; 1.2 MOhms de resistencia) en el BLA (D / V: 7.2, A / P: 2,7, M / L: 4.9 de bregma) y una estimion electrodo en la región de IL de la corteza prefrontal medial (D / V: 4,6, A / P: 3,0, M / L: 0,7 de bregma) (Figura 4A).
  6. Estimular la IL evocar EFP en el BLA. Los datos mostrados en la Figura 4 se adquirieron con los siguientes ajustes: Un impulso de estimulación de 0,3 mseg de duración, utilizando una intensidad de estimulación que correspondió a 40% de la intensidad de la corriente mínima que evoca una respuesta de campo máxima (basan en una curva de entrada-salida determinado antes recopilación de datos de línea de base), entregado cada 15 seg.
  7. Recoger datos de referencia para un mínimo de 10 a 15 minutos antes de la inducción de la plasticidad sináptica.
    NOTA: El protocolo utilizado para evocar la plasticidad sináptica variará con los requisitos de los experimentos y se debe seleccionar cuidadosamente por cada experimentador. Los datos en la Figura 4C muestra los cambios en la EFP siguiente 3 ráfagas de 100 pulsos a 50 Hz (2 seg), con intervalos entre ráfagas 20 segundos a la intensidad de corriente mínimo que evocand la respuesta de campo máxima.
  8. Medir la amplitud de la EFP como la diferencia entre la media de una ventana de 5 mseg antes de que el artefacto de estimulación y la media de una ventana de 5 mseg alrededor de 20 - 25 mseg después de la estimulación artefacto, que corresponde al pico negativo del potencial de campo. Normalizar los datos a la línea de base y establecer el promedio de una línea de base 10 min como 100%. Utilice las amplitudes EFP promediados de otro período de 10 minutos después de la inducción de plasticidad (por ejemplo, 40 - 50 min después de la inducción) para evaluar los cambios a largo plazo en EFP amplitud.
  9. Después del final de la grabación decapitar al animal anestesiado y extraer el cerebro. Preparar tejido para la verificación histológica de colocación de los electrodos.

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Resultados

Esta sección ilustra ejemplos de los resultados que se pueden obtener mediante el uso de VNS en combinación con aprendizaje de la extinción para reducir la expresión de la respuesta de miedo condicionado en ratas. Para los días 1 y 2 (auditivo miedo acondicionado), las ratas fueron entrenadas en una tarea auditiva condicionamiento del miedo en el que estímulo eléctrico plantar se emparejaron con un tono. En el Día 3 (Test Tratamiento Pre), los tonos se presentaron en ausencia de estímulo eléctrico plantar para medir los...

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Discusión

Presentamos aquí un protocolo que se utiliza para facilitar la extinción del miedo condicionado durante una sola sesión de la exposición a las señales condicionado 19 y para modular la plasticidad en la vía entre la corteza infralimbic y la amígdala basolateral que pueden mediar la extinción de aprendizaje 20. Un paso crucial para el éxito de este protocolo es la correcta entrega de VNS durante el entrenamiento de extinción. Por lo tanto, la atención especial se debe dar a la construcción de los el...

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Divulgaciones

Los autores no tienen intereses contrapuestos ni conflictos.

Agradecimientos

Esta investigación fue apoyada por el Instituto Nacional de Salud Mental MH 086960-01A1 (Christa K. McIntyre).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Alcohol
AtropinaFisherA0132-5G
BetadineHenry Schein69066950
Peróxido de hidrógeno CVS209478
ketaminaHenry Schein  1129300
MarcaineHenry Schein6312615
Aceite MineralCVS152355
NeosporinCVS 629451
OxygenHome Depot304179
PennicillinFisherPENNA-10MU
PropanoHome Depot304182
XilacinaHenry Schein4019308
Herramientas
Joyería Antorcha SmithEquipo23-1001D
Aguja de coserWalgreens441831
#5 Pinzas (2)Fine Science Tools11254-20
SoldadorHome Depot 
AmScope SM-4TX-144A 3.5X-45X Microscopio estereoscópico de brazo de placa de circuito + 144 LEDAmScopeSM-4TX-144A
Helping HandsA-M Systems 726200
Portacuchillas de bisturíHerramientas de ciencia fina10003-12
Lima de metalHome Depot6601
ReglaHome Deopt202035324
Hemostáticos curvos Herramientas de ciencia fina130009-12
Tijeras finasHerramientas de ciencia fina14058-09
EspátulaHerramientas de
Destornillador pequeñoHome Depot646507
sistema de retracción de fijador magnéticoHerramientas de ciencia fina18200-04, 18200-01, 18200-05
Almohadilla térmicaWalgreens30294
MaquinillasWalgreens277966
SharpieGrapas125328
Pinzas de anilloFine Science Tools11103-09
Herramientas de vidrio de micropipeta personalizadas (forma de J y rectas) - Vidrio de borosilicatoInstrumento SutterB150-110-10
Pinzas AdsonHerramientas de Ciencias Finas 11006-12
Manguitos
TuboBraintree Scientific IncMRE-065
Alambre de Platino e Iridio Medwire10IR9/49T Pasadores
de OroMill-Max1001-0-15-15-30-27-04-0
Hilo de suturaHenry Schein100-5797
Agujas de 22 GFisher 14-815-525
Cinta de papelFisher 03-411-602
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Silastic Laboratory Tubing .51 mm ID x .94 mm ODFisher 508-002
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Teets Dental Acrílico, líquido y polvoA-M525000, 526000
Grapas dealambre de cobre sólido decalibre 261016882  
Tornillos óseos
Hojas de bisturí, 10 o 15Stoelting52173-10
jeringas de 1 mlFisher14-826-261
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Sinometer 10 MHz Osciloscopio de un solo canalSinómetroCQ5010C
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203525863ciencia fina Piezas cabeza Sistemas para cirugía Stoelting+CB33:C61 51457 22 G Agujas Fisher  impulsos aislado 10432400

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