El estudio de la función de proteínas y el Papel de la expresión de la proteína alterada por la interferencia de anticuerpos y reconstrucciones tridimensionales

Resumen

El control de la expresión de proteínas no solo es esencial para todos los organismos vivos, sino también una estrategia importante para investigar las funciones de las proteínas en modelos celulares. El protocolo presentado muestra la aplicación de la interferencia de anticuerpos en células de mamíferos, incluidas las neuronas primarias del hipocampo, y demuestra el uso de reconstrucciones tridimensionales en el estudio de la función de las proteínas.

Resumen

Una gestión estricta de la expresión de proteínas no sólo es esencial para todos los organismos vivos, sino también una estrategia importante para investigar las funciones de proteínas en modelos celulares. Por lo tanto, la investigación reciente inventado diferentes herramientas para dirigir la expresión de proteínas en líneas de células de mamífero o incluso modelos animales, incluyendo ARN y la interferencia de anticuerpos. Mientras que la primera estrategia ha recogido mucho la atención durante las últimas dos décadas, los péptidos que median una translocación de cargas de anticuerpos a través de las membranas celulares y en las células, obtuvieron mucho menos interés. En esta publicación, se proporciona un protocolo detallado cómo utilizar un portador de péptido llamado Chariot en células de riñón de embriones humanos, así como en las neuronas del hipocampo primarias para llevar a cabo experimentos de interferencia de anticuerpos y ilustrar adicionalmente la aplicación de las reconstrucciones en tres dimensiones en el análisis de la función de proteínas. Nuestros hallazgos sugieren que Chariot es, probablemente debido a su señal de localización nuclear, particularly bien adaptado a proteínas diana que residen en el soma y el núcleo. Sorprendentemente, cuando se aplica a cultivos de hipocampo Chariot primarios, el reactivo resultó ser sorprendentemente bien aceptado por las neuronas disociadas.

Introducción

Un control estricto de la expresión de la proteína es esencial para todos los organismos vivos para comandar su propio desarrollo, así como para reaccionar a las señales ambientales. Por lo tanto, una multitud de mecanismos se ha inventado durante la evolución de regular con precisión el nivel de expresión de cada proteína codificada por la aplicación. 20.000 genes existentes en cualquier célula eucariota en un momento dado de su vida. Que tienen lugar en diferentes etapas de la producción de proteínas, los mecanismos de regulación van desde la gestión de la estructura de la cromatina, la transcripción y ARN manipulación a la dirección de las modificaciones posteriores a la traducción de proteínas, el transporte y la degradación.

Por lo tanto, no es sorprendente que el mal funcionamiento de los mecanismos moleculares y los niveles de expresión de proteína alterada subyacente se han asociado con diversas enfermedades como el cáncer o discapacidad intelectual. De hecho, mirando a la complejidad excepcional del desarrollo neuronal y la función del cerebro de los mamíferos, el Sensitividad de estos sistemas sofisticados a alteraciones en la expresión de la proteína se manifiesta en varios déficits intelectuales bien conocidos que incluyen la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson (AD y PD), así como los trastornos del espectro autista (TEA) como el Síndrome X Frágil (SXF). Esta última enfermedad se caracteriza por una extensa misexpression de una variedad de proteínas, que se debe a la pérdida de una sola proteína traducción regulación, FMRP (Frágil proteína Retraso Mental X) ^1-4. Proteína Además, reordenamientos cromosómicos que afectan a la carga variable ligada al cromosoma X A (VCXA), una proteína, que administra la estabilidad del ARNm y la traducción mediante la modificación de ARNm de tapado ^5, recientemente se han asociado con déficits intelectuales, mientras que las mutaciones puntuales no fueron identificados en pacientes con discapacidad cognitiva a partir de ahora ^{6, 7,} lo que sugiere que los deterioros mentales observados originan a partir de la expresión VCXA alterada y la expresión desregulada de su prote objetivoins. De acuerdo con estos hallazgos, un estudio que investiga si novo copia variaciones en el número de genes que están asociados con TEA estableció que los nuevos genes duplicaciones y deleciones son un factor de riesgo significativo para ASD ^8, lo que apoya la idea de que los niveles de proteína de expresión elevados o disminuidos pueden causar déficit intelectual.

Sorprendentemente, las investigaciones recientes proporcionan evidencia adicional de que el nivel de expresión de una proteína dada se ajusta con precisión para evitar su agregación como consecuencia de cantidades elevadas de proteínas casi sin márgenes de seguridad ^9. Por lo tanto, se ha propuesto que incluso pequeños incrementos son suficientes para inducir enfermedades tales como AD y PD ^9. A pesar de la variedad de los mecanismos moleculares que contribuyen al control de la expresión de proteínas sugiere un esquema de regulación compleja a la luz de estos hallazgos, un estudio que investiga el nivel de expresión de más de 5.000 genes de mamíferos demostró que ¹⁰la naturaleza prefiere un esquema más parsimoniosa: La abundancia celular de las proteínas ha demostrado ser regulada principalmente a nivel de la traducción ^10, ilustrando así que la gestión de la disponibilidad de ARN sirve principalmente para afinar la expresión de proteínas.

El estudio de la dosis de proteínas de interés (POI), por tanto, no sólo es importante para la comprensión de las funciones endógenas de una proteína, sino también para la investigación de muchas enfermedades y el desarrollo de terapias. Por lo tanto, últimas décadas han visto el avance de varias estrategias utilizando ARN de interferencia para manipular la dosis PDI. Aunque la interferencia de ARN se utiliza ampliamente para estudiar la función de la proteína e incluso está siendo aplicado en los ensayos clínicos para el tratamiento de cáncer o enfermedades oculares, así como para seguir las terapias antivirales en pacientes ^11-13, algunos pueden surgir dificultades que podrían hacer que la estrategia imposible. Por ejemplo, la secuencia de semillas, que impulsa la caída por homología es comparativamentebles efectos a corto, por lo tanto, promueven desviado. Como las secuencias altamente eficientes son raros y hay que encontrar entre miles de opciones (revisado en ^14), la identificación de la secuencia correcta puede ser lento y costoso, pero los resultados pueden todavía ser decepcionante.

Una estrategia alternativa es dirigirse directamente al PDI por anticuerpos. A continuación, se ilustra el uso del carro portador de proteína (fabricado por Active Motif) para reducir la disponibilidad de proteínas celulares, y el empleo de las reconstrucciones tridimensionales para estudiar la función de proteínas después de knock-down.

El motivo activa de Chariot, en sí misma un péptido de 2,8 kDa, se utiliza para los péptidos de transporte, proteínas y anticuerpos a través de membranas de células de mamíferos ^15. Los asociados de péptidos con PDI que puede formar junto no covalentes complejos macromoleculares que utilizan las interacciones hidrofóbicas, con lo cual los complejos Chariot-PDI se internalizan en las células en un endosoma-independent manera. Es importante destacar que, Chariot se indicó que era ni afectar a la localización intracelular de las proteínas transportados, ni que ejercen efectos citotóxicos o para afectar la actividad biológica de su carga ^15.

Protocolo

1. Soluciones de archivo

1. Resuspender el polvo motivo activo liofilizado en _H2O estéril a una concentración final de 2 mg / l. Golpee suavemente para mezclar.
2. Preparar alícuotas pequeñas (por ejemplo, 12 l cada uno, se requieren 2 l por reacción) y almacenar a -20 ° C.

2. Preparación de células

1. De semillas de células de mamífero tales como células HEK293 o neuronas primarias en un medio de crecimiento placa de 24 pocillos en 500 l incluyendo antibióticos.
   NOTA: Al usar las neuronas, sembrar las células a baja densidad y utilizar sólo las dos filas intermedias de la placa de 24 pocillos. Cada pozo tendrá así una contraparte vacía para albergar el medio durante la incubación (paso 4.2). Al manipular las neuronas, asegúrese siempre de que las células no se mantienen fuera de la incubadora durante más de unos pocos minutos.
2. Cultivar las células en condiciones apropiadas (humedecido, 5% de _CO2 y 37 ° C) hasta que las células son aplicación. 50%confluente.
   NOTA: Al usar las neuronas, cultivar las células hasta la etapa de desarrollo deseado se alcanza y cambian aplicación. 25-50% del medio dos veces a la semana. Medio: medio Neurobasal (que contiene 1x B27, 5 mM L-glutamina y 1x penicilina y estreptomicina; comparar con ref 16).

3. Formación de complejos Chariot

1. Por reacción, diluir 0,1-2 g de la POI o el anticuerpo correspondiente, así como la proteína de control, o anticuerpo de control, respectivamente, en 50 l de PBS.
   NOTA: La técnica también funciona con los complejos macromoleculares que consiste en anticuerpos primarios y secundarios pre-determinada (cp 'Resultados representante', Figura 1.). Mezclar y efectos.
2. Para cada muestra, diluir 2 l Chariot solución madre en 50 l de PBS utilizando tubos separados con el fin de evitar la auto-asociación de Chariot. Mezclar y efectos.
3. La transferencia de la PDI o anticuerpo (paso 3.1) diluido a la dilución del carro mediante una pipetating. Mezclar y efectos.
4. Incubar la mezcla durante 30 minutos a temperatura ambiente (complejos Chariot-PDI formarán).

4. Transfección de células

1. Diluir los complejos Chariot (paso 3.4) en 100 l de medio de crecimiento pre-calentado (37 ° C, sin aditivos). Se elimina el medio y se lavan las células una vez utilizando pre-calentado PBS 1x.
   NOTA: Al usar las neuronas, no se puede desechar el medio, que se volverá a utilizar. Mantenerlo a 37 ° C. Para el lavado, utilice PBS que contenía 0,5 mM de _MgCl2 y _CaCl2.
   Sugerencia: mantener el medio en los pozos vacíos, mientras que la incubación de la placa (paso 4.5).
2. Aplicar la solución del complejo Chariot (paso 4.1) a las células y las células oscilar suavemente para asegurar una distribución uniforme de la solución. Cultivar las células en condiciones estándar (paso 2.2) durante 1 h. Añadir suero a una concentración final de 10%. Cuando se utilizan las neuronas, añadir el medio desde el paso 4.1. Cultivar las células durante 1 a 2 horas más.
   NOTA: Latiempo de incubación óptimo depende del tamaño y las propiedades de la carga y puede ser necesario ajustar empíricamente. Las siguientes sugerencias pueden servir como guía: Para los péptidos, 1 hora suele ser suficiente, para las proteínas se recomiendan 1-2 horas, para los anticuerpos de 2 horas, y para la transfección de las neuronas con anticuerpos de 4 horas.
3. las células del proceso de análisis, como de costumbre. Tenga en cuenta: la técnica es compatible con los experimentos que usan protocolos de fijación, así como imágenes en directo.

5. Imaging

1. El uso de un microscopio de barrido láser, tomar z-pilas de células y / o compartimentos de células de interés utilizando aproximadamente 0,25 a 0,5 micras distancia. La distancia capa depende del tamaño de la estructura a ser reconstruido y necesita ser determinado individualmente.

6. Reconstrucción

1. En los pasos siguientes, utilice la parte inferior Esc para alternar entre Seleccionar y Navegar, Cntr para seleccionar varios objetos o haciendo clicn ellos y tecla de mayúsculas para cortar objetos (cp. paso 6.10).
2. Abra el archivo en LSM-Imaris.
3. Usando el ajuste de visualización para cada canal, contrastar la imagen hasta que las estructuras más brillantes llegar a la saturación. Tenga en cuenta que este ajuste no influirá en la construcción de la superficie, que sólo sirve para ayudar al experimentador en umbralización la imagen.
4. Haga clic en el icono Añadir nuevas superficies. Se abrirá un asistente.
5. Seleccionar: Segmento solamente una zona de interés. Proceder al siguiente paso.
6. Ajustar los márgenes de la caja de selección para adaptarse a su objeto de interés. Por favor tener en cuenta que la imagen tiene 3 dimensiones y que la selección necesita ser ajustado en el plano z también. Si la forma rectangular de la caja de selección no debe coincidir con el objeto de interés correctamente, apague el objeto y / o ampliar el cuadro hasta que todas las estructuras necesarias están incrustados. objetos no deseados pueden ser eliminados más tarde (cp. paso 6.10). Proceder.
7. Seleccione la ch apropiadaannel. El nivel de detalle de la zona de superficie o diámetro de la esfera deben configurarse para que coincidan las estructuras en proceso de reconstrucción. Dependiendo de las características de la señal, ya sea intensidad absoluta o contraste local se pueden utilizar. En general, contraste local funciona mejor para las señales difusas. En cualquier caso, los ajustes deben ser ajustados por separado para cada señal o estructura de interés, respectivamente.
8. Con la herramienta de umbral, reconstruir la estructura de interés.
9. Completar la reconstrucción haciendo clic en la flecha verde inferior.
10. Ajuste el objeto mediante el uso de la herramienta de lápiz para cortar y eliminar las superficies según sea necesario. Sólo es posible cortar en dirección norte-sur, por lo tanto, la inclinación de la imagen con el fin de cortar el objeto deseado.
11. Obtener mediciones de volumen, área e intensidades para cada superficie mediante la selección de Estadística, estadísticas detalladas, y valores medios.
12. (Paso opcional) Observar las estadísticas codificadas por colores (cp. Figura 2E y F), seleccione la ficha Color de la superficie correspondiente y marcar 'Estadística Codificada' en lugar de 'base'. Se mostrarán varias opciones.

Resultados

En los párrafos siguientes, los resultados de ejemplo que ilustran una caída funcional de un POI (Simiate, para más detalles, véase ^{16, 17)} usando el reactivo Chariot y la interferencia de anticuerpos se presentan. Los resultados demuestran que la disminución de la expresión de Simiate deteriora la actividad transcripcional, y, en una forma dependiente de la dosis, induce la apoptosis, que culmina en las tasas de mortalidad de más del 99% si se aplican cantidades de anticuerpos más altos...

Discusión

A continuación, se presenta un protocolo para estudiar la importancia de los niveles de expresión de proteínas en el control de las funciones celulares de una manera impulsada dosis. El protocolo descrito permite una manipulación afinado de expresión de la proteína en varios tipos de células de mamíferos, incluyendo las neuronas del hipocampo, por lo tanto, facilitar los estudios detallados de función de la proteína en el nivel celular.

A pesar de la interferencia de ARN representa una estra...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Carro	Active Motif	30025	tienda en -20 ° C
Medio neurobasal	Life technologies	21103-049	calentamiento hasta 37 ° C antes de usar
1x tecnologías B27	Life	17504044	almacenar a -20 ° C
L-glutamina	Life technologies	25030-149	tienda a -20 ° C
Penicilina y estreptomicina	Life technologies	15140-122	tienda a -20 ° C
Imaris software	Bitplane	n.a.caro	, pero inigualable
Microscopio de Barrido Láser	Zeiss	n.a.