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Artículo de método

Electrofisiología en aislados Preparativos Cord-tronco cerebral espinal de roedores recién nacidos permite la grabación de salida de red neuronal Respiratorio

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DOI:

10.3791/53071

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19 de noviembre de 2015

 , 
1Department of Pediatrics, Laval University

En este artículo

Resumen

El impulso respiratorio central se encuentra en el tronco encefálico. La salida motora respiratoria espontánea de un tronco encefálico aislado se registra colocando un electrodo en la cuarta raíz ventral. Este enfoque experimental es valioso para las investigaciones farmacológicas o la evaluación de los desafíos respiratorios y las manipulaciones genéticas en el comportamiento motor rítmico.

Resumen

Si bien es bien sabido que el impulso respiratorio central se encuentra en el tronco encefálico, varios aspectos de su función básica, desarrollo y respuesta a los estímulos aún no se comprenden completamente. Para superar la dificultad de acceso al tronco encefálico en todo el animal, se realiza el aislamiento del tronco encefálico y parte de la médula espinal. Esta preparación se mantiene en líquido cefalorraquídeo artificial donde se controlan y monitorean los gases, las concentraciones y la temperatura. La señal de salida de la red respiratoria se registra mediante un electrodo de succión colocado en la cuarta raíz ventral. De esta manera, los estímulos se pueden aplicar directamente sobre el tronco encefálico y el efecto se puede registrar directamente. La señal registrada está ligada a la señal inspiratoria enviada al diafragma a través del nervio frénico, y puede describirse como ráfagas (alrededor de 8 ráfagas por minuto). El análisis de estas ráfagas (frecuencia, amplitud, longitud y área bajo la curva) permite una caracterización precisa del efecto del estímulo sobre la red respiratoria. La principal limitación de este método es la viabilidad de la preparación más allá de las primeras etapas postnatales. Por lo tanto, este método se centra en gran medida en el estudio de toda la red sin las entradas periféricas en la rata recién nacida.

Introducción

La respiración es una actividad compleja y vital controlada por el cerebro, lo que permite dioxígeno (O 2) la captación y dióxido de carbono (CO 2) la eliminación. El impulso respiratorio central se genera por una compleja red situada en el tronco cerebral en ambos mamíferos 1, 2 anfibios, reptiles, aves 3 4 5 y peces. Incluso si el estudio de la respiración se puede procesar in vivo, las investigaciones mecanicistas precisas requieren el acceso directo a la red de control respiratorio. Con este fin, Adrian y Buytendijk desarrollaron una preparación goldfish reducida, en el que los electrodos colocados en el registro de la superficie del tronco cerebral el ritmo generado asociado con gill ventilación 5. Este enfoque fue posteriormente adaptada por Suzue en 1984 6 para su uso en roedores recién nacidos. La llegada de esta preparación ha dado lugar a importantes avances en neurobiología respiratorio. Dado que es relativamente simple, la técnica presentada hERE es susceptible de una amplia gama de investigaciones básicas de comportamientos motores rítmicos y sus orígenes en roedores recién nacidos.

El objetivo general de este método consiste en registrar el correlato neural de la actividad inspiratoria, un ritmo respiratorio similar llamado respiración ficticio, producida por la cadena respiratoria. Este método se puede emplear en una amplia gama de objetivos de la investigación, la orientación respuestas inspiratorios a variaciones respiratorias o farmacología en ambos de tipo salvaje y transgénicos 7 8 animales. Dado que los experimentos se llevan a cabo a baja temperatura, sin aferentes sensoriales, y en condiciones en las concentraciones de glucosa y de O 2 en el LCRa son altos, se han planteado interrogantes sobre la relevancia fisiológica de la señal grabada. Si bien existen diferencias claras entre in vivo e in vitro condiciones (por ejemplo., La frecuencia de ráfagas de inspiración) el hecho es que la presencia delos elementos centrales de la red respiratoria 6 hacen posible el estudio de un ritmo robusto asociado a una función homeostática vitales 9,10.

La razón fundamental detrás del desarrollo y el uso de esta técnica es facilitar el acceso directo a los elementos del tronco cerebral de la red respiratoria, que son difícilmente accesibles in vivo, especialmente en los recién nacidos. El tronco encefálico se coloca en condiciones estrictamente controladas: el ritmo grabado no es modulada por impulsos aferentes periféricas de los pulmones o los cuerpos carótidas, lo que permite el estudio se centre en la unidad central de la respiración en sí 11. Por lo tanto, se utiliza este acceso para aplicar estímulos y registrar la señal de salida. En contraste con pletismografía de grabaciones, el ritmo respiratorio es modulada por todos sus componentes en todo el cuerpo (por ejemplo., Distensión de pulmón, sensores químicos periféricos), por lo que es difícil de aplicar estímulos precisos.

En unaewborn rata, el protocolo consiste en registrar la cuarta señal ventral raíz en un tronco cerebral aislada y una médula espinal truncado, mantenido en el fluido cerebro-espinal artificial (ACSF). El ritmo generado por los preparativos de la médula espinal, tronco cerebral se compone de ráfagas lentas individuales que están vinculados a la señal inspiratoria 9. Preparaciones de cordón-tronco cerebral médula aislados se pueden grabar fácilmente en ratas desde el primer día postnatal 0-4 (P0 - P4) 7. Este enfoque se utiliza comúnmente para evaluar la respuesta hipóxica de la red respiratoria, y también la respuesta a la hipercapnia, acidosis o drogas. Un protocolo de hipoxia aguda se presenta aquí. Esta estimulación se obtiene por la captación de O 2 en el LCRa; este enfoque se utiliza comúnmente para evaluar la tolerancia y la capacidad de respuesta a insultos hipóxicas. El protocolo induce una depresión ritmo desde el primer minuto hasta el final de la exposición a la hipoxia (Figura 1) 12. Esta depresión se inviertedurante el post-hipóxica 12 de recuperación. Respecto al diseño experimental, es importante darse cuenta de que el puente de Varolio, situados en la parte rostral del tronco cerebral, tiene una acción inhibidora sobre el generador de ritmo 8. Por lo tanto, los preparativos de la plena tronco cerebral y médula espinal rostral muestran un menor ritmo. La inclusión de la protuberancia en la muestra aislada de la grabación se determina de acuerdo con el objetivo del experimento 13; el estudio de la influencia pontina en la red bulbo raquídeo requeriría grabaciones con y sin el puente de Varolio para comparar los resultados 14. Por otra parte, una de las ventajas de esta técnica es la posibilidad de ampliar la parte rostral de la preparación para incluir mesencefálico y / o regiones diencefálicas 15,16, por lo que es posible evaluar el efecto de estas regiones en la red respiratoria-ponto medular.

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Protocolo

Este método requiere el uso de sujetos animales, se admiten por el Comité de Ética Animal de la Universidad Laval (protocolo # 2012-170).

1. Instalación y Preparación

  1. Soluciones
    1. Preparar soluciones madre aCSF de acuerdo con las siguientes recetas 7,17. Otras recetas con variaciones de concentración están disponibles en la literatura. Soluciones tienda de valores a 4 ° C durante hasta un mes.
      1. Solución de sal: añadir 75,39 g de NaCl (129 mM final); 2,5 g de KCl (3,35 mM final); 0,81 g de NaH2PO4 (0,58 mM final); 2,33 g de MgCl2 (1,15 mM final); 1,85 g de CaCl2 (1,26 mM). Disolver en 800 ml de agua destilada luego llenar a 1 l con agua destilada.
      2. Solución de bicarbonato: añadir 17,65 g de NaHCO 3 (21 mM final). Disolver en 900 ml de agua destilada y luego llenar hasta 1 L con agua destilada. Las variaciones de la concentración de bicarbonato resultarán en variaciones de pH.
      3. Solución de glucosa: añadir 54,06g de glucosa (30 mM final). Disolver en 400 ml de agua destilada y luego llenar hasta 500 ml con agua destilada.
    2. Preparar LCRa por dilución de 100 ml de solución de sal, 100 ml de solución de bicarbonato, y 50 ml de solución de glucosa en 1 L de agua destilada. Almacenar a 4 ° C hasta su uso.
    3. Preparar un electrodo de vidrio calentando y estirando un tubo de vidrio hasta que se rompe. Lijar la punta antes de su uso. El electrodo se puede reutilizar tantas veces como el tiempo que se mantiene limpio.
  2. Configuración experimental
    Nota: Los datos de configuración se presentan en la Figura 2.
    1. Encienda el amplificador, promediador, sistema de adquisición de datos, control de temperatura y de la bomba en movimiento. Compruebe la amplificación de la señal (ganancia = 10.000), la filtración (de bajo umbral, 10 Hz; umbral alto, 5 kHz), y la tasa de muestreo de la conversión de analógico a digital de la señal en bruto (2,5 kHz).
    2. Llene una botella con LCRa y la burbuja con carbógeno (95% O 2 , 5% de CO 2). Inducir un bubbled- y se calentó-LCRa flujo en la cámara de grabación (volumen de 5 ml) a 4 ml / min. Mantener la temperatura en la cámara de registro a 26 (± 1) ° C. pH debe ser 7,4 en estas condiciones estándar.
    3. Mantenga 50 ml de RT y carbógeno-burbujear LCRa en una jeringa de 50 ml, cerca de la cámara de disección.
    4. Encienda el ordenador e inicie el software de grabación.

2. Disección

  1. Pesar y determinar visualmente el sexo del animal (los machos tienen un ano-genital distancia más larga, mientras que las hembras tienen una distancia ano-genital corta; machos genitales son a menudo oscuro, mientras que los genitales femeninos son de color rosa).
  2. Anestesiar al roedores recién nacidos por una de las siguientes opciones: crioanestesia (sumergir completamente el animal en hielo durante 4 - 5 min 18), inyección (equitensine a 4 ml / kg) 19 o la inhalación de anestésicos volátiles (isoflurano 20 o éter 21). Confirm un plano adecuado de anestesia por la ausencia de un reflejo retirada de la pata.
  3. Colocar el animal en el banco, la cara ventral hacia abajo. Sección la parte rostral de la cabeza coronalmente con un bisturí en el nivel de bregma (visible a través de la piel y el cráneo). Realice este paso inmediatamente después se anestesia el animal.
  4. Sección coronal del cuerpo con un bisturí en virtud de los miembros anteriores.
  5. Quite la piel, los músculos, los tejidos grasos y víscera con tijeras y alicates quirúrgicos y delgadas. Desde los huesos son suaves a esta edad, tenga cuidado de no dañar el sistema nervioso. Realice este paso en el banquillo.
  6. Colocar la preparación en la cámara de disección. Utilice la LCRa almacenado en la jeringa para oxigenar la preparación. A partir de este punto hasta el final de la grabación, usar un microscopio.
  7. En la cara dorsal de la preparación, corte el cráneo y las vértebras de la rostral a la parte caudal lo largo del eje medio con tijeras y pinzas quirúrgicas y delgadas. Abra el cráneo cortey vértebras para exponer el tejido nervioso. Utilice la LCRa strored en la jeringa para oxigenar la preparación.
  8. Con los alicates, quite la membrana aracnoide, un tejido delgado que cubre la superficie del tejido nervioso. Conserve la piamadre y los vasos sanguíneos contra el tejido nervioso. Utilice la LCRa almacenado en la jeringa para oxigenar la preparación.
  9. Colocar la preparación con el dorsal boca abajo, y cuidadosamente hacer caer el tronco del encéfalo y la médula espinal mediante la reducción de los nervios y el tejido conectivo con las tijeras mientras mantiene la preparación en su lugar. Un enfoque dorsal también es posible. Mantener las raíces y los nervios el mayor tiempo posible. Retire los huesos para aislar el tronco del encéfalo y la médula espinal. Utilice la LCRa almacenado en la jeringa para oxigenar la preparación.
  10. Retire el cerebelo y el restante estructuras rostrales seccionando con el bisturí. Utilice la LCRa almacenada en la aguja para oxigenar la preparación.
  11. Opcionalmente dependiendo de experimendiseño tal, retire el puente con el bisturí por una sección anterior de la corona a la arteria cerebelosa inferior 22. Tenga en cuenta que el mantenimiento de todo el puente se ralentizará el ritmo en ratas y totalmente inhibirla en ratones. Las preparaciones que incluyen sólo la parte caudal de la protuberancia muestran una actividad respiratoria como con una frecuencia estable a la raíz C4.

3. Grabación

  1. Colocar la preparación en la cámara de grabación, ventral hacia arriba. Fijar la preparación con alfileres en la parte más baja de la médula espinal y el rostral-la mayor parte del tronco cerebral.
  2. Usando una jeringa vinculado al electrodo por su aguja, inducen una depresión en el electrodo (diámetro de la punta de vidrio: 150-225 micras) tirando de la jeringa de pistón, con el fin de llenar parcialmente el electrodo con LCRa.
  3. El uso de un micromanipulador, colocar cuidadosamente el electrodo cerca de una de las cuartas raíces ventrales. Otras raíces ventrales también podrían presentar una actividad respiratoria como (e.g., nervio craneal XII, C1 raíz ventral).
  4. Inducir una depresión en el depósito de electrodo a través de la jeringa tirando del émbolo con el fin de aspirar suavemente el rootlet nervio. A continuación, mueva con cuidado el electrodo para aplicar contra la médula espinal.
    Nota: Lo ideal sería que el tamaño de la rootlet coincide con el tamaño de la abertura del electrodo y por lo tanto crea un sello entre los compartimentos internos y externos del electrodo. Desde amplificadores diferenciales se utilizan comúnmente para tales grabaciones, cualquier abertura entre el interior del electrodo y la cámara de grabación reduce la calidad de la señal y hace que sea difícil eliminar el ruido de fondo.
  5. Inicie la grabación.
  6. Graba el ritmo producido por la preparación en condiciones de normoxia (es decir, LCRa burbujeó con carbógeno: 95% O 2 y 5% de CO 2) durante al menos 20 min para determinar los parámetros basales de la preparación.
  7. Cambie la perfusión de LCRa carbógeno-burbujear aLCRa estímulo (es decir, burbujeado con 95% N 2 y 5% de CO 2 para el estímulo hipoxia) durante 15 min. Alterar duración de la exposición dependiendo del protocolo experimental. Anote la duración de la exposición en la grabación y animal hoja de datos. Utilice tubos de acero inoxidable entre la botella LCRa y la cámara siempre que sea posible para evitar la difusión del gas al exterior del tubo.
  8. Cambie la perfusión de nuevo a norma LCRa carbógeno-burbujear durante al menos 15 minutos para una grabación de recuperación. Anota esto en la grabación y animal hoja de datos.
  9. Finalice la grabación.

4. Análisis estadístico

  1. A partir de la señal integrado, calcular la frecuencia como el número de ráfagas por minuto (expresado en ráfagas / min), la amplitud como la diferencia entre la línea de base y el pico de la ráfaga (expresado en mV), la duración de la ráfaga como la duración desde el principio hasta el final de la ráfaga (expresado en s), el área de ráfaga como el área bajo la curve de la ráfaga de la señal integrada (expresado en mV · s) (Figura 3).
  2. Calcular la frecuencia, amplitud, duración de la ráfaga y la zona de la explosión bajo normóxico (línea de base), hipóxica (estímulo) y post-hipóxico condiciones (post-estímulo) de recuperación como el promedio de los últimos 5 minutos de las grabaciones para cada condición. No analizar la primera porción de cada condición porque hay un retraso entre la conmutación de la perfusión y LCRa homogeneización en la cámara de grabación.
  3. Expresar entonces estímulo (es decir, la hipoxia) y post-estímulo (es decir, post-hipóxicas) los valores de recuperación en porcentaje de los valores de línea de base para la grabación correspondiente. Exprese los resultados como medias ± SD

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Resultados

Como se ha mencionado en la introducción, una de las ventajas más importantes de esta técnica es el acceso directo al tronco encefálico para aplicar diversos estímulos. Como ejemplo, la hipoxia se aplicó aquí. Figura 1. AB muestra una grabación protocolo completo, con ambas condiciones de normoxia e hipóxicas. 1.CE Figura muestra el ritmo en condiciones de normoxia registrado (es decir, LCRa burbujeó con 95% O 2 y 5% CO 2 a 26 ° C). Como se ha demostrado a...

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Discusión

La cuantificación precisa de la actividad respiratoria puede ser un reto. De hecho, la respiración es una función que puede ser tanto automática y voluntaria, y que se modula en función del entorno, las necesidades del cuerpo, el estado emocional y el comportamiento. La ventaja de esta técnica es el aislamiento de los elementos neurales responsables de producir el comando respiratorio. Por lo tanto, los registros electrofisiológicos de preparaciones de médula espinal y del tronco cerebral-pletismografía son técnicas com...

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Divulgaciones

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos ni conflictos de intereses que divulgar.

Agradecimientos

Los autores agradecen sinceramente a los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (MOP 130258 y a la Fundación Star para la Investigación en Salud Infantil, junto con la Fundación Molly Towell, por la provisión del centro de investigación y el apoyo financiero. Los autores también agradecen sinceramente al Dr. Kinkead Richard por la revisión de manuscritos y sus consejos.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
SylgardSigma Aldrich761036-5EAUso bajo el capó
NaClBioshop SOD002
KClBioshopPOC888
CaCl2BioshopCCL444
MgCl2BioshopMAG510
NaHCO3BioshopSOB999
NaH2PO4BioshopSPM306
D-glucosaBioshopGLU501
CarbogenLinde343-02-0006 
Controlador de temperaturaWarner Instruments, Hamden, CT, EE. UU.TC-324B
Electrodo de succiónA-M Systems, Everett, WA, EE. UUmodelo 573000
Amplificador diferencial de CAA-M Systems, Everett, WA, EE. UU. modelo 1700
Promedio móvilCWE, Ardmore, PA, EE. UU. modelo MA-821
Sistemade adquisición de datosDataq Instruments, Akron, OH, EE. UU. modelo DI-720
LabChart softwareADInstruments, Colorado Springs, CO, EE. UU.
Software de prismaGraphpad, La Jolla, CA, EE. UU
Cámara de disecciónLa caja de plástico (por ejemplo, una caja de Petri) servirá
Cámara de grabaciónBase casera
Kanetec, Bensenville, IL, EE. UU
. . . MB Micromanipulador World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, EE. UU. Base Kite-R Kanetec, Bensenville, IL, EE. UU. Bomba peristáltica MB Gilson, Middleton, WI, EE. UU. Jaula de Faraday MINIPULS 3 Computadora casera

Referencias

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