Interacciones intravital microscopía de leucocitos endoteliales y plaquetas de leucocitos en mesenterial venas en ratones

Resumen

Esta aplicación simplificada de la microscopía intravital de las venas del mesenterio en ratones se puede utilizar en diferentes modelos de inflamación para observar las interacciones leucocito-endotelial y plaqueta-leucocito.

Resumen

Microscopía intravital es un método que se puede utilizar para investigar diferentes procesos en diferentes regiones y vasos en los animales vivos. En este protocolo, se describe la microscopía intravital de venas mesenterio. Esto se puede realizar en un corto período de tiempo con resultados reproducibles que muestran interacciones leucocito-endotelial in vivo. Se describe un entorno inflamatoria después del desafío LPS del endotelio. Sin embargo, en este modelo se puede aplicar diferentes tipos de afecciones inflamatorias, como la bacteriana, química o biológica e investigar la administración de fármacos y sus efectos directos sobre el animal vivo y su impacto en el reclutamiento de leucocitos. Este protocolo se ha aplicado con éxito a un número de diferentes tratamientos de ratones y sus efectos sobre la respuesta inflamatoria en los vasos. En este documento, se describe la visualización de los leucocitos y plaquetas mediante el etiquetado con fluorescencia éstos con rodamina 6G. Además, cualquier formación de imágenes específico puede ser performed usando dirigidos moléculas marcadas con fluorescencia.

Introducción

El propósito de este protocolo es para describir una técnica simplificada de la microscopía intravital de las venas mesenterio en ratones vivos para la observación directa de las interacciones leucocito-endotelial y de leucocitos de plaquetas bajo condiciones inflamatorias.

Microscopía intravital fue desarrollado para estudiar las interacciones leucocito-endotelial in vivo en condiciones inflamatorias ^1,2, que no es trivial pero importante para la comprensión de reclutamiento de leucocitos inflamatoria y función. El método se describe en este protocolo fue desarrollado en base a las publicaciones previamente publicados. Similar a la visualización de la incorporación de plaquetas en un trombo crece ³ y en paralelo a lo que se ha publicado a principios ^4, una vena mesenterio exteriorizada es examinado por microscopía de luz transmitida. Hay varios otros modelos de la microscopía intra vitales tales como el músculo cremáster de ratas ⁵ o el hígado del ratón y ratas ^6.

Microscopía intravital de vena mesenterio se ha desarrollado y aplicado en los estudios previos por varios grupos. Hemos utilizado esta técnica para observar las diferencias en el reclutamiento de leucocitos entre los ratones de tipo salvaje y hydroxylase1 triptófano (TPH1) - / - ratones, que son deficientes de la serotonina no neuronal y comparado los resultados a ratones cuyos serotonina plaquetaria se farmacológicamente empobrecido por largo plazo aplicación de la recaptación de serotonina un inhibidor de la fluoxetina ^7. También hemos examinado las interacciones leucocito-endotelial después del tratamiento con fluoxetina aguda ^8.

En este protocolo nos centramos en la microscopía intravital de venas mesenterio, ya que este modelo se puede realizar de forma rápida, y permite mediciones válidas de las interacciones leucocito-endotelio y plaquetas de leucocitos. Esto es mucho más difícil y lleva mucho tiempo en la microscopía intravital de otros órganos, como los huesos, el hígado, la piel o músculo cremáster. El modol se describe aquí es ideal para la evaluación reproducible de la interacción célula-célula inflamatoria después de challengeing con un estímulo inflamatorio, como la inyección intraperitoneal de lipopolisacárido.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con la ley de protección animal Alemán (TierSchG). Los ratones fueron alojados y manipulen de conformidad con las buenas prácticas de los animales según la definición de FELASA (www.felasa.eu/guidelines.php) y el cuerpo nacional de bienestar animal de GV-SOLAS (www.gv-solas.de/index.html). El comité de bienestar de los animales de la Universidad de Friburgo, así como las autoridades locales (Regierungspräsidium Freiburg) aprobaron todos los experimentos con animales.

1. Manejo de Animales, Preparación e inducción de la inflamación

1. Utilice 4-6 semanas de edad ratones machos con un rango de peso de 16 a 20 g. Nota: Si los ratones son más viejos o más pesado que presentan exceso de grasa que rodea el vaso, lo que limita la observación microscópica.
2. Esterilizar todas las herramientas y mesa microscopio antes de la cirugía.
3. Inyectar 20 mg / kg de LPS (lipopolisacárido) por vía intraperitoneal 4 horas antes de la microscopía en el ratón vivo para inducir una inflamm bacterianaación.
4. Precalentar una solución salina al 0,9% en un baño de agua a 37 ° C para humidificar la cámara de plástico y el tejido mesenterio.
5. Anestesiar al ratón con inyección intraperitoneal de ketamina (100 mg / kg) y xilazina (5 mg / kg) justo antes de que el procedimiento de microscopía. Anestesia alternativos se pueden utilizar, por ejemplo, 2% de inhalación de isoflurano. Confirmar anestesia adecuada por la pérdida de la respuesta a la estimulación refleja (dedo del pie o de la cola pellizco con una presión firme).
6. Depilar el abdomen usando una máquina de afeitar y quitar el pelo suelto con una gasa saturada con etanol al 70%.
7. Aplique un ungüento veterinario en los ojos del ratón para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia.

2. Cirugía

1. Esterilizar el abdomen utilizando etanol al 70%. Este método no es un método estéril y podría ser letal al final del experimento.
2. Realice una laparotomía media: Abra la piel del abdomen usando pequeñas, pinzas curvas y pequeñas tijeras. Identificar el epivasos gastrical y abrir el peritoneo en la región de la línea alba, para proteger a los vasos.
3. Aplicar unas pocas gotas de solución salina precalentada en la cavidad abdominal para mantener el tejido húmedo.
4. Leucocitos y plaquetas de la etiqueta fluorescente mediante la inyección de 50 l rodamina 6G (1 mg / ml) retro-orbital tal como se describe antes ^9,10.
5. Exteriorizar un bucle de lugar ileumand en una placa de Petri con un diámetro de 10 cm y asegúrese de mantener el tejido húmedo aplicando la 37 ° C precalentado solución salina (0,9%) cada dos minutos.

3. Microscopia intravital

1. Coloque el ratón debajo del microscopio y traer la vena mesenterio con un diámetro de 200 a 300 micras en el centro de la vista. Elija un recipiente sin entorno de grasa visible.
2. No toque los recipientes mesenterio evitando así la estimulación del endotelio. Maneje el bucle íleon cautela.
3. Visualizar las interacciones célula endotelial de sangrecon un microscopio invertido o en posición vertical y una cámara usando un software de microscopio. Record sangre interacciones célula-endotelial de 1 min en 4 venas diferentes por ratón.
4. La eutanasia el ratón por dislocación cervical después de la finalización de los experimentos de imagen.

4. Análisis

1. Llevar a cabo el análisis fuera de línea y cegado para todos los parámetros. Llevar a cabo análisis utilizando cualquier programa de software adecuado.
2. Confirme condiciones estables y interindividually comparables flujo sanguíneo en alta resolución de tiempo de cine-clips (velocidad de fotogramas máxima) se centraron en el flujo de glóbulos intraluminal.
3. Cuantificar el número de leucocitos de rodadura. Para ello trazar una línea vertical a través de la vena y contar todos los leucocitos que cruzan esta línea en 1 min.
4. Determinar la velocidad de laminación midiendo el tiempo una sola leucocitos necesita pasar una distancia de 50 m, mientras que de forma estable a rodar sobre el endotelio. Para ello, dibuja dos líneas verticales en una distancia de 50 m tediante la vena.
   1. Mida el tiempo de un leucocito representante deberá obtener de una línea a la other.Calculate la velocidad de los leucocitos al dividir 50 micras a través del tiempo necesario (m / s).
5. Medir la adhesión de leucocitos en un campo de 0,04 mm ^2. Para ello, dibuja un cuadrado con la longitud lateral de 200 micras en la vena.
   1. Cuente los leucocitos adherentes firmes, definidos como ningún movimiento visible durante 30 segundos, dentro de este cuadrado.
6. Cuente el número de plaquetas con destino a uno de los leucocitos de cuantificar las interacciones de las plaquetas de leucocitos.

Resultados

Una visión general de la configuración experimental descrito en este protocolo se muestra en la Figura 1. Se muestra un ratón con un íleon de bucle exteriorizada y sus vasos, que se puede observar en la microscopía intravital. La Figura 2 muestra cierto grado de activación en los animales no tratados debido a el procedimiento en sí. Pero no hay casi ninguna de rodadura lenta o la adhesión firme de los leucocitos en comparación con los ratones tratados con LPS. Figura 2 ...

Discusión

Aquí se describe la preparación y el rendimiento de la microscopía intravital de las venas mesenterio de ratones in vivo. Este método nos da la oportunidad de observar las interacciones leucocito-endotelial y plaquetarios endotelial ¹¹ directamente en el organismo vivo.

Como una respuesta temprana a la inflamación del endotelio se activa e interactúa con los leucocitos y las plaquetas que resulta en la rodadura, la adherencia y la transmigración ^12. Pero leucoc...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Rodamina 6G	Sigma-Aldrich	989-38-8
Lipopolisacáridos de Escherichia coli 055:B5	Sigma-Aldrich	L2637