Capa por capa deposición de colágeno en dispositivos de microfluidos para microtejidos Estabilización

Resumen

La creación de microtejidos funcionales dentro de dispositivos microfluídicos requiere la estabilización de los fenotipos celulares mediante la adaptación de las técnicas tradicionales de cultivo celular a las limitadas dimensiones espaciales de los microdispositivos. La modificación del colágeno permite la deposición capa por capa de ensamblajes de colágeno ultrafinos que pueden estabilizar las células primarias, como los hepatocitos, como modelos de tejido microfluídico.

Resumen

Aunque la microfluídica proporciona un control exquisito del microambiente celular, el cultivo de células dentro de dispositivos microfluídicos se puede challenging. 3D cultivo de células en geles de colágeno tipo I ayuda a estabilizar la morfología y la función celular, que es necesaria para crear modelos de tejido microfluídico en microdispositivos. Traducir las técnicas tradicionales de cultivo en 3D para placas de cultivo de tejidos a dispositivos microfluídicos suele ser difícil debido a las limitadas dimensiones del canal. En este método, describimos una técnica para modificar el colágeno nativo tipo I para generar soluciones de colágeno policatiónico y polianiónico que se pueden usar con deposición capa por capa para crear ensamblajes de colágeno ultrafinos sobre células cultivadas en dispositivos microfluídicos. Estas finas capas de colágeno estabilizan la morfología y la función de las células, como se muestra utilizando hepatocitos primarios como célula de ejemplo, lo que permite el cultivo a largo plazo de microtejidos en dispositivos microfluídicos.

Introducción

Aunque la microfluídica permite el exquisito control del microambiente celular, cultivar células, especialmente células primarias, dentro de dispositivos microfluídicos puede ser un desafío. Se han desarrollado muchas técnicas tradicionales de cultivo celular para mantener y estabilizar la función celular cuando se cultivan en placas de cultivo de tejidos, pero a menudo es difícil traducir esas técnicas a dispositivos microfluídicos.

Una de estas técnicas es el cultivo de células sobre o intercaladas entre geles de colágeno como modelo del entorno celular fisiológico en 3D. ¹ El colágeno tipo I es una de las proteínas más utiliz....

Protocolo

1. Preparación de la solución nativa Colágeno Soluble

1. Preparar o comprar 200 mg de acidificado, soluble, colágeno tipo I a partir de colas de rata a 1-3 mg / ml utilizando protocolos estándar de aislamiento, tales como reportado por Piez et al. ¹⁵
2. Escala la cantidad de material de partida basado en el volumen final deseado de soluciones de colágeno modificado. Aproximadamente hacer de 25-30 ml de metilada y 25-30 ml de soluciones de colágeno succinilados, cada uno a 3 mg / ml, a partir de 200 mg de colágeno nativo soluble.

2. El colágeno metilación

1. Diluir 100 mg de la solución de c....

Resultados

Colágeno nativo se puede modificar mediante la metilación y la succinilación para crear soluciones de colágeno policatiónicos y polianiónicos para su uso en la deposición de capa por capa. Succinilación modifica los grupos -amino de colágeno nativo con grupos succinilo, y la metilación modifica los grupos carboxilo del colágeno nativo con un grupo metilo (Figura 1A). Estas modificaciones de las cadenas laterales de aminoácidos de la proteína colágeno alteran las curvas de valoración del pH para las solu.......

Discusión

Ultrafinos conjuntos de colágeno puro pueden ser depositados en las células cargadas o superficies de materiales utilizando deposición de capa por capa de colágenos modificados. Los resultados de este estudio demuestran que la metilación y succinilación de colágeno nativo crear soluciones de colágeno policatiónicos y polianiónicos (Figura 1) que puede ser utilizado con la técnica de capa por capa para depositar conjuntos de matriz de colágeno ultrafinas sobre las células (Figura 2) u ot.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
colágeno tipo I, cola de rata	Life Technologies	A1048301	opción para cola de rata concentrada colágeno
colágeno tipo I, cola de rata	Sigma-Aldrich	C3867-1VL	opción para cola de rata concentrada colágeno
colágeno tipo I, cola	rata EMD Millipore	08-115	opción para cola de rata concentrada colágeno
colágeno tipo I, cola de rata	%D Systems	3440-100-01	opción para cola de rata concentrada
anhídrido succínico	Sigma-Aldrich	239690-50G	reactivo de succinilación
metanol anhidro	Sigma-Aldrich	322415-100ML	reactivo de metilación
hidróxido de sodio	Sigma-Aldrich	S5881-500G	pH reactivo de precipitación
ácido clorhídrico	Sigma-Aldrich	320331-500ML	Reactivo de precipitación de pH
de rata tipo I ELISA	Chondrex	6013	opción para detectar el contenido de colágeno
kit de ensayo de hidroxiprolina	Sigma-Aldrich	MAK008-1KT	opción para detectar el contenido de colágeno
kit de ensayo de hidroxiprolina	Quickzyme Biosciences	QZBtotcol1	opción para detectar el contenido de colágeno

de R colágeno colágeno