Artículo de método

Capa por capa deposición de colágeno en dispositivos de microfluidos para microtejidos Estabilización

DOI:

10.3791/53078

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29 de septiembre de 2015

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1Center for Engineering in Medicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Shriners Hospitals for Children-Boston

En este artículo

Resumen

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La creación de microtejidos funcionales dentro de dispositivos microfluídicos requiere la estabilización de los fenotipos celulares mediante la adaptación de las técnicas tradicionales de cultivo celular a las limitadas dimensiones espaciales de los microdispositivos. La modificación del colágeno permite la deposición capa por capa de ensamblajes de colágeno ultrafinos que pueden estabilizar las células primarias, como los hepatocitos, como modelos de tejido microfluídico.

Resumen

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Aunque la microfluídica proporciona un control exquisito del microambiente celular, el cultivo de células dentro de dispositivos microfluídicos se puede challenging. 3D cultivo de células en geles de colágeno tipo I ayuda a estabilizar la morfología y la función celular, que es necesaria para crear modelos de tejido microfluídico en microdispositivos. Traducir las técnicas tradicionales de cultivo en 3D para placas de cultivo de tejidos a dispositivos microfluídicos suele ser difícil debido a las limitadas dimensiones del canal. En este método, describimos una técnica para modificar el colágeno nativo tipo I para generar soluciones de colágeno policatiónico y polianiónico que se pueden usar con deposición capa por capa para crear ensamblajes de colágeno ultrafinos sobre células cultivadas en dispositivos microfluídicos. Estas finas capas de colágeno estabilizan la morfología y la función de las células, como se muestra utilizando hepatocitos primarios como célula de ejemplo, lo que permite el cultivo a largo plazo de microtejidos en dispositivos microfluídicos.

Introducción

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Aunque la microfluídica permite el exquisito control del microambiente celular, cultivar células, especialmente células primarias, dentro de dispositivos microfluídicos puede ser un desafío. Se han desarrollado muchas técnicas tradicionales de cultivo celular para mantener y estabilizar la función celular cuando se cultivan en placas de cultivo de tejidos, pero a menudo es difícil traducir esas técnicas a dispositivos microfluídicos.

Una de estas técnicas es el cultivo de células sobre o intercaladas entre geles de colágeno como modelo del entorno celular fisiológico en 3D. 1 El colágeno tipo I es una de las proteínas más utilizadas para aplicaciones de biomateriales debido a su ubicuidad en la matriz extracelular, abundancia natural, sitios de unión celular robustos y biocompatibilidad. 2 Muchas células se benefician del cultivo 3D con colágeno, incluidas las células cancerosas3,45, las células endoteliales microvasculares6 y los hepatocitos7, entre otras. Si bien el uso de geles de colágeno es fácil en formatos abiertos, como placas de cultivo de tejidos, las dimensiones limitadas del canal y la naturaleza cerrada de los dispositivos microfluídicos hacen que el uso de líquidos que gelifican sea poco práctico sin bloquear todo el canal.

Para superar este problema, combinamos la técnica de deposición capa por capa8 con modificaciones químicas de soluciones de colágeno nativo para crear ensamblajes de colágeno ultrafinos sobre células cultivadas en dispositivos microfluídicos. Estas capas pueden estabilizar la morfología celular y funcionar de manera similar a los geles de colágeno y se pueden depositar en las células en dispositivos microfluídicos sin bloquear los canales con matriz polimerizada. El objetivo de este método es modificar el colágeno nativo para crear soluciones de colágeno policatiónico y polianiónico y estabilizar las células en cultivo microfluídico mediante el depósito de ensamblajes delgados de matriz de colágeno en las células. Esta técnica se ha utilizado para estabilizar la morfología y función de los hepatocitos primarios en dispositivos microfluídicos. 9

Aunque se ha informado previamente de la deposición capa por capa con polielectrolitos naturales y sintéticos10 para cubrir hepatocitos en cultivo en placa11,12 y como capa de siembra para hepatocitos en dispositivos microfluídicos13,14, este método describe la deposición de una capa de colágeno puro encima de los hepatocitos, imitando las técnicas de cultivo de colágeno en 3D. En este protocolo, utilizamos hepatocitos como células de ejemplo que se pueden mantener utilizando capas de colágeno 3D. Los muchos otros tipos de células que se benefician del cultivo 3D en colágeno pueden beneficiarse de manera similar del cultivo después de la deposición capa por capa de un ensamblaje de matriz de colágeno ultrafino.

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Protocolo

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1. Preparación de la solución nativa Colágeno Soluble

  1. Preparar o comprar 200 mg de acidificado, soluble, colágeno tipo I a partir de colas de rata a 1-3 mg / ml utilizando protocolos estándar de aislamiento, tales como reportado por Piez et al. 15
  2. Escala la cantidad de material de partida basado en el volumen final deseado de soluciones de colágeno modificado. Aproximadamente hacer de 25-30 ml de metilada y 25-30 ml de soluciones de colágeno succinilados, cada uno a 3 mg / ml, a partir de 200 mg de colágeno nativo soluble.

2. El colágeno metilación

  1. Diluir 100 mg de la solución de colágeno nativo, se acidificó (2-3 pH) a una concentración de 0,5 mg / ml de hielo agua estéril fría y mantener la solución en hielo para evitar la gelificación.
  2. Ajustar el pH de la solución de colágeno 9-10 con unas pocas gotas de NaOH 1 N y se agita a TA durante 30 min. Observe el precipitado de colágeno, haciendo que la solución a enturbiarse.
  3. Centrifugar la solución de colágeno precipitado a 3000 × g durante 25 min. A, precipitado similar a un gel claro debe ser visible en el fondo de los tubos. Aspirar y desechar correctamente el líquido sobrenadante.
  4. Resuspender el precipitado de colágeno en 200 ml de metanol con HCl 0,1 N y permitir que la reacción de metilación que se produzca con agitación a TA durante 4 días. El colágeno no se disuelve, sino que debe romperse en pedazos muy pequeños visibles que harán que la solución turbia.
  5. Después de la metilación, centrifugar la solución a 3000 × g durante 25 min para sedimentar el colágeno metilado. Aspirar y desechar el sobrenadante de metanol acidificado.
  6. Se disuelve el colágeno metilado en 25 ml de PBS estéril, dando una concentración de aproximadamente 3 mg / ml, con pipeteo repetido, y filtrar la solución a través de un filtro de células de 60 micras. Ajustar el pH de la solución a 7.3 a 7.4 utilizando 20 l incrementos de 1 N NaOH.
  7. Evaluar la concentration de la solución utilizando un kit ELISA colágeno rata comercial o kit de ensayo de hidroxiprolina. Diluir la solución a 3 mg / ml con PBS estéril.
  8. Esterilizar la solución de colágeno metilado transfiriéndolo a una botella de vidrio con un tapón de rosca, capas cuidadosamente 3 ml de cloroformo en la parte inferior de la botella, deje la botella para establecer O / N a 4 ° C, y luego asépticamente retirar y almacenar la la capa superior, que es el colágeno metilado.
  9. Guarde la solución a 4 ° C para su uso dentro de 1 mes.

3. El colágeno Succinilación

  1. Diluir la otra 100 mg de la solución de colágeno nativo, se acidificó (2-3 pH) a una concentración de 0,5 mg / ml de hielo agua estéril fría y mantener la solución en hielo para evitar la gelificación.
  2. Ajustar el pH de la solución de colágeno 9-10 con unas pocas gotas de NaOH 1 N y se agita a TA durante 30 min. El colágeno debe precipitar, haciendo que la solución a enturbiarse.
  3. Disolver 40 mg de succinic anhídrido (0,4 mg por mg de colágeno) en 10 ml de acetona (1/20 el volumen de la solución de colágeno). Lentamente (en aproximadamente 0,5 ml incrementos) añadir esta mezcla a la solución de colágeno con agitación mientras se monitorea continuamente el pH. Mantener el pH por encima de 9,0 mediante la adición de 1 o 2 gotas de 1 N NaOH como el pH se aproxima a 9,0.
  4. Continuar agitar a TA durante 120 min después de añadir todo el anhídrido succínico en acetona. Observe la solución a quedar claro como el colágeno succinilado disuelve. Compruebe periódicamente el pH para asegurarse de que permanece por encima de 9,0.
  5. Ajustar el pH de la solución a 4,0 con 20 l de HCl incrementos de 1 N. Observe la solución turbia de nuevo, como el colágeno succinilado precipita.
  6. Después de la succinilación, centrifugar la solución a 3000 × g durante 25 min para sedimentar el colágeno succinilado. Aspirar y desechar el sobrenadante acidificadas con anhídrido succínico sin reaccionar.
  7. Se disuelve el colágeno succiniladoen 25 ml de PBS estéril, dando una concentración de aproximadamente 3 mg / ml, con pipeteo repetido, y filtrar la solución a través de un filtro de células de 60 micras. Ajustar el pH de la solución a 7.3 a 7.4 utilizando 20 l incrementos de 1 N NaOH.
  8. Evaluar la concentración de la solución utilizando un kit ELISA rata colágeno comercial o kit de ensayo de hidroxiprolina. Diluir la solución a 3 mg / ml con PBS estéril.
  9. Esterilizar la solución de colágeno succinilado transfiriéndolo a una botella de vidrio con un tapón de rosca, capas cuidadosamente 3 ml de cloroformo en la parte inferior de la botella, deje la botella para establecer O / N a 4 ° C, y luego asépticamente retirar y almacenar la la capa superior, que es el colágeno succinilado.
  10. Guarde la solución a 4 ° C para su uso dentro de 1 mes.

4. Verificación de las modificaciones del colágeno

  1. Preparar muestras de 1 ml de cada una de las soluciones de colágeno nativo, metilados, y succinilados y diluir a una concentration de 0,1 mg / ml con agua pura estéril para la titulación de iones hidrógeno. Además diluir el tampón de al menos 1.000 veces mediante diálisis frente a agua a través de un punto de corte de 10 kDa membraneusing 3 cambios de la solución durante al menos 4 h cada uno.
  2. Ajustar el pH de las soluciones a 7,3 con pequeñas cantidades de NaOH y HCl. Uso de pH 7,3 como una referencia arbitraria, realice ion hidrógeno titulación en cada una de las muestras como se describe por Tanford 16 para crear curvas de valoración para las soluciones de colágeno nativo, metilados, y succinilada.
  3. Trazar el cambio de pH por volumen de ácido añadido en comparación con el número de iones H + por molécula unida. El rango de pH alto "amino" debe mostrar un cambio en el colágeno succinilado hacia el punto neutro (una pérdida de grupos amina), y el rango de pH bajo "carboxilo" debería mostrar un desplazamiento hacia la izquierda en el colágeno metilado (una pérdida de grupos carboxilo ) y un desplazamiento hacia la derecha en el colágeno succinilado (una ganancia en el grupo carboxilos), en comparación con el colágeno nativo.
  4. Evaluar la eficacia de la reacción de succinilación mediante la determinación del% de grupos amino en el colágeno nativa se sustituye por succinilación utilizando el método colorimétrico del ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico (TNBA), siguiendo protocolos estándar 17,18.

5. La fabricación de dispositivos de microfluidos y la siembra de células

  1. Fabricar dispositivos de microfluidos utilizando métodos estándar 9. Utilice réplica de moldeo de PDMS de SU-8 maestros en el silicio definido usando fotolitografía para crear cámaras de cultivo de células de microfluidos con 100 m de altura, 0,4-1,5 mm de ancho, y 1 hasta 10 mm canales largos para el crecimiento celular.
  2. Use un limpiador de plasma para oxidar las superficies del dispositivo y un portaobjetos de vidrio, y luego presione juntos para bonos. Después de esterilizar el dispositivo por la exposición a la luz UV durante al menos 30 min, llenar la cámara con 50 mg / ml de fibronectina en PBS estéril y se incuba a 37 ° C durante 45 min.
  3. Sembrar el dispositivo con las células, tales como la rata primaria o hepatocitos humanos, que requieren un gel de colágeno para la estabilización de fenotipo o estado de diferenciación. Utilizamos 20 l de recién aisladas hepatocitos de rata primaria 7,19 o disponibles comercialmente hepatocitos primarios humanos criopreservados sembradas a 14 × 10 6 células / ml por dispositivo.
  4. Permita que las células se unan a 04.06 horas, y luego se lavan a cabo las células no unidas y reemplazar los medios de chapado con medio de crecimiento. Incubar O / N para garantizar la difusión de célula completa y crear una monocapa confluente de células.

6. Capa por capa deposición de colágeno

  1. En una campana de cultivo de tejidos de flujo laminar, preparar volúmenes suficientes de soluciones de colágeno metilado y succiniladas para 10 aplicaciones de cada solución por dispositivo, así como unos pocos ml de medio. Mantenga las soluciones en hielo. Utilizamos 20 l (10-15 veces el volumen total del dispositivo) de colágeno por capa por dispositivo.
  2. Seratrapando con la solución (policatiónica) metilado, rubor los dispositivos con 20 l de metilado y luego se alternan succinilado soluciones de colágeno, esperando 1 minuto entre cada aplicación. Limpie el dispositivo con un total de 10 veces por solución, que deben tener aproximadamente 20 min. Trabajar rápidamente para minimizar la cantidad de tiempo que las células son sin medios de comunicación.
  3. Observe colágeno acumular lentamente a la entrada / salida en función de su tamaño. Si la resistencia a los aumentos de flujo de fluidos, a eliminar el dispositivo una vez o dos veces con los medios de comunicación, y luego continuar en capas.
  4. Después de aplicar todas las capas, enjuagar el dispositivo dos veces con medio fresco y volver a la incubadora. Dependiendo del tipo celular, los cambios morfológicos extracelulares inducidas por la matriz, tales como aumento de la polarización en los hepatocitos, deben ser visibles dentro de unas pocas horas.
  5. Preparar los dispositivos representativos para microscopía electrónica de transmisión utilizando métodos estándar 9 para verificar la presencia de una matriz de colágenomontaje en la parte superior de las células cultivadas.

7. Estabilización del fenotipo celular y función

  1. Image la morfología celular, la viabilidad, y la polaridad usando métodos estándar para el tipo de célula. Para los hepatocitos, recoger imágenes de más de 14 días mediante microscopía de fase, la tinción LIVE / DEAD para la viabilidad, y el tinte CMFDA para polarización apical para demostrar los efectos de la deposición de colágeno.
  2. Para la morfología celular, lave el dispositivo través de la entrada mediante una pipeta con 20 l de PBS para enjuagar, inyectar 20 l de PBS, y la imagen el dispositivo mediante microscopía de contraste de fase.
  3. Para la tinción LIVE / DEAD, lave el dispositivo a través de la entrada mediante una pipeta con 20 l de PBS para enjuagar, inyectar 20 l de solución de tinción LIVE / DEAD con DAPI preparó siguiendo las instrucciones del fabricante, se incuba durante 30 minutos a 37 ° C, enjuague el dispositivo de nuevo con 20 l de PBS, y la imagen el dispositivo mediante microscopía de fluorescencia.
  4. Para canali bilistinción culi, a eliminar el dispositivo a través de la entrada mediante una pipeta con 20 l de PBS para enjuagar, inyecte 20 l de 2 solución de tinción M CMFDA con DAPI preparados según las instrucciones del fabricante, se incuba durante 30 minutos a 37 ° C, enjuague el dispositivo nuevo con 20 l de PBS, y la imagen al dispositivo utilizando microscopía de fluorescencia.
  5. Recoge los medios gastados y medir productos metabólicos celulares en los puntos de tiempo apropiados durante la duración cultivo para determinar la función de las células. Para los hepatocitos, medir la cantidad de albúmina y urea en los medios gastados.
  6. Realizar análisis funcionales de punto final en las propias células, tales como la evaluación de los niveles de actividad de la enzima, tinción de anticuerpos, o análisis de ARN. Para los hepatocitos, inducir y medir la actividad de las enzimas del citocromo P450 o la fase II de conjugación enzima glutatión S-transferasa.

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Resultados

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Colágeno nativo se puede modificar mediante la metilación y la succinilación para crear soluciones de colágeno policatiónicos y polianiónicos para su uso en la deposición de capa por capa. Succinilación modifica los grupos -amino de colágeno nativo con grupos succinilo, y la metilación modifica los grupos carboxilo del colágeno nativo con un grupo metilo (Figura 1A). Estas modificaciones de las cadenas laterales de aminoácidos de la proteína colágeno alteran las curvas de valoración del pH para las solu...

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Discusión

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Ultrafinos conjuntos de colágeno puro pueden ser depositados en las células cargadas o superficies de materiales utilizando deposición de capa por capa de colágenos modificados. Los resultados de este estudio demuestran que la metilación y succinilación de colágeno nativo crear soluciones de colágeno policatiónicos y polianiónicos (Figura 1) que puede ser utilizado con la técnica de capa por capa para depositar conjuntos de matriz de colágeno ultrafinas sobre las células (Figura 2) u ot...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud, incluyendo una subvención del consorcio de sistemas microfisiológicos del Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales (UH2TR000503), una beca postdoctoral Ruth L. Kirschstein National Research Service Award (F32DK098905 para WJM) y el premio Camino a la Independencia (DK095984 para AB) del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
colágeno tipo I, cola de rataLife TechnologiesA1048301opción para cola de rata concentrada colágeno
colágeno tipo I, cola de rataSigma-AldrichC3867-1VLopción para cola de rata concentrada colágeno
colágeno tipo I, colarata EMD Millipore08-115opción para cola de rata concentrada colágeno
colágeno tipo I, cola de rata%D Systems3440-100-01opción para cola de rata concentrada
anhídrido succínicoSigma-Aldrich239690-50Greactivo de succinilación
metanol anhidroSigma-Aldrich322415-100MLreactivo de metilación
hidróxido de sodioSigma-AldrichS5881-500GpH reactivo de precipitación
ácido clorhídricoSigma-Aldrich320331-500MLReactivo de precipitación de pH
de rata tipo I ELISAChondrex6013opción para detectar el contenido de colágeno
kit de ensayo de hidroxiprolinaSigma-AldrichMAK008-1KTopción para detectar el contenido de colágeno
kit de ensayo de hidroxiprolinaQuickzyme BiosciencesQZBtotcol1opción para detectar el contenido de colágeno
de R colágeno colágeno

Referencias

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  1. Pedersen, J. A., Swartz, M. A. Mechanobiology in the third dimension. Ann Biomed Eng. 33 (11), 1469-1490 (2005).
  2. Glowacki, J., Mizuno, S. Collagen scaffolds for tissue engineering. Biopolymers. 89 (5), 338-344 (2008).
  3. Vescio, R. A., et al. In vivo-like drug responses of human tumors growing in three-dimensional gel-supported primary culture. PNAS. 84, 5029-5033 (1987).
  4. Chandrasekaran, S., Guo, N. -h, Rodrigues, R. G., Kaiser, J., Roberts, D. D. Pro-adhesive and chemotactic activities of thrombospondin-1 for breast carcinoma cells are mediated by α3β1 integrin and regulated by insulin-like growth factor-1 and CD98. J Biol Chem. 274 (16), 11408-11416 (1999).
  5. Chen, S. S., et al. Multilineage differentiation of rhesus monkey embryonic stem cells in three‐dimensional culture systems. Stem Cells. 21 (3), 281-295 (2003).
  6. Whelan, M. C., Senger, D. R. Collagen I initiates endothelial cell morphogenesis by inducing actin polymerization through suppression of cyclic AMP and protein kinase A. J Biol Chem. 278 (1), 327-334 (2003).
  7. Dunn, J. C., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Long-term in vitro function of adult hepatocytes in a collagen sandwich configuration. Biotechnol Prog. 7 (3), 237-245 (1991).
  8. Decher, G. Fuzzy Nanoassemblies: Toward Layered Polymeric Multicomposites. Science. 277, 1232-1237 (1997).
  9. McCarty, W. J., et al. A novel ultrathin collagen nanolayer assembly for 3-D microtissue engineering: Layer-by-layer collagen deposition for long-term stable microfluidic hepatocyte culture. TECHNOLOGY. 2 (01), 67-74 (2014).
  10. Swierczewska, M., et al. Cellular response to nanoscale elastin-like polypeptide polyelectrolyte multilayers. Acta Biomater. 4 (4), 827-837 (2008).
  11. Kim, Y., Larkin, A. L., Davis, R. M., Rajagopalan, P. The design of in vitro liver sinusoid mimics using chitosan-hyaluronic acid polyelectrolyte multilayers. Tissue Eng Pt A. 16 (9), 2731-2741 (2010).
  12. Larkin, A. L., Rodrigues, R. R., Murali, T., Rajagopalan, P. Designing a Multicellular Organotypic 3D Liver Model with a Detachable, Nanoscale Polymeric Space of Disse. Tissue Eng Pt C. 19 (11), 875-884 (2013).
  13. Kidambi, S., et al. Patterned Co‐Culture of Primary Hepatocytes and Fibroblasts Using Polyelectrolyte Multilayer Templates. Macromol Biosci. 7 (3), 344-353 (2007).
  14. Janorkar, A. V., Rajagopalan, P., Yarmush, M. L., Megeed, Z. The use of elastin-like polypeptide-polyelectrolyte complexes to control hepatocyte morphology and function in vitro. Biomaterials. 29 (6), 625-632 (2008).
  15. Piez, K. A., Eigner, E. A., Lewis, M. S. The Chromatographic Separation and Amino Acid Composition of the Subunits of Several Collagens*. Biochemistry. 2 (1), 58-66 (1963).
  16. Tanford, C. The interpretation of hydrogen ion titration curves of proteins. Adv Protein Chem. 17, 69-165 (1962).
  17. Cayot, P., Tainturier, G. The quantification of protein amino groups by the trinitrobenzenesulfonic acid method: a reexamination. Anal Biochem. 249 (2), 184-200 (1997).
  18. Kakade, M. L., Liener, I. E. Determination of available lysine in proteins. Anal Biochem. 27 (2), 273-280 (1969).
  19. Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).

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