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Artículo de método

Los andamios compuestos de fibras interfacial Polyelectrolyte para lanzamiento Temporalmente controlada de biomoléculas

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DOI:

10.3791/53079

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19 de agosto de 2015

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, 2Mechanobiology Institute, Singapore, National University of Singapore, 3Department of Surgery, National University of Singapore

En este artículo

Resumen

Los andamios para la ingeniería de tejidos necesitan recapitular el complejo microambiente bioquímico y biofísico del nicho celular. Aquí, mostramos el uso de fibras de complejación de polielectrolitos interfaciales como plataforma para crear andamios poliméricos compuestos de múltiples componentes con liberación bioquímica sostenida.

Resumen

Varios andamios utilizados en la ingeniería de tejidos requieren un entorno bioquímico controlado para imitar el nicho celular fisiológico. Las fibras de complejación de polielectrolitos interfaciales (IPC) se pueden utilizar para la administración controlada de diversos agentes biológicos, como fármacos de moléculas pequeñas, células, proteínas y factores de crecimiento. La simplicidad de la metodología en la fabricación de fibras IPC brinda flexibilidad en su aplicación para la entrega controlada de biomoléculas. Aquí, describimos un método para incorporar fibras de IPC en dos andamios poliméricos diferentes, polisacárido hidrofílico y policaprolactona hidrofóbica, para crear un andamio compuesto multicomponente. Demostramos que las fibras de IPC pueden incrustarse fácilmente en estas estructuras poliméricas, lo que mejora la capacidad de liberación sostenida y mejora la conservación de las biomoléculas. También creamos un andamio polimérico compuesto con señales topográficas y liberación bioquímica sostenida que puede tener efectos sinérgicos en el comportamiento celular. Los andamios poliméricos compuestos con fibras IPC representan un método novedoso y sencillo para recrear el nicho celular.

Introducción

La matriz extracelular tiene señales bioquímicas y biofísicas inherentes que dirigen los comportamientos celulares. La imitación de este microentorno fisiológico tridimensional (3D) es una estrategia ampliamente explorada para aplicaciones de medicina regenerativa e ingeniería de tejidos. Por ejemplo, tanto los sustratos de origen natural como los sintéticos se han modificado con señales topográficas como medio para imitar el entorno celular biofísico. 1 Por ejemplo, los andamios de policaprolactona (PCL) se pueden modelar fácilmente mediante la fundición sobre sustratos de PDMS estampados. 2 Sin embargo, la mayoría de los andamios sintéticos recapitulan inadecuadamente el entorno bioquímico controlado in vivo. La modificación masiva o superficial de los materiales sintéticos solo presenta señales bioquímicas para la unión celular, pero aún carece de regulación temporal de la entrega bioquímica. 3 Por lo tanto, existe la necesidad de andamios óptimos que puedan imitar el sistema de entrega bioquímica regulado temporalmente de la matriz extracelular.

Los sistemas de administración bioquímica, como las microesferas, están plagados de problemas de pérdida de bioactividad y baja eficiencia de incorporación debido a la gravedad y complejidad del proceso de síntesis de varios pasos. 4-6 Se demostró que los métodos alternativos que utilizan un método de fabricación e incorporación en un solo paso tienen un excelente potencial para crear un microambiente bioquímico favorable sin la ineficiencia concomitante en la incorporación y pérdida de bioactividad. Una solución viable es el uso de fibras de complejación de polielectrolitos interfaciales (IPC) para administrar y proteger agentes biológicos. Cuando se juntan dos soluciones acuosas de polielectrolito con carga opuesta, las fibras IPC se pueden extraer de la interfaz. Prácticamente cualquier tipo de biomolécula hidrofílica en solución acuosa se puede agregar a la solución de polielectrolito cargada negativa o positivamente, lo que facilita la incorporación de biomoléculas útiles en la fibra IPC durante el proceso de complejación. Además, este proceso solo requiere condiciones acuosas y ambientales, lo que disminuye el riesgo de pérdida de bioactividad. Con este método, se han administrado con éxito factores de crecimiento activos2,7 incluso células8,9. Además, el método simple de formación de fibras IPC permite moldear en cualquier forma u orientación. La estabilidad de dichas fibras ha sido ventajosa en su incorporación tanto en polímeros hidrófobos2 como hidrofílicos7 para crear andamios compuestos. Estos andamios compuestos con fibras IPC son beneficiosos para crear un entorno bioquímico fisiológicamente relevante, al tiempo que proporcionan un anclaje físico para las células.

En este estudio, mostramos un método para incorporar fibras de IPC en un andamio hidrófilo e hidrofóbico con topografía para la liberación controlada de biomoléculas activas. Como prueba de concepto, incorporamos fibras de IPC fabricadas a partir de quitosano y alginato en el hidrogel hidrofílico de pululano-dextrano biocompatible, no inmunogénico y no antigénico o en el andamio hidrofóbico de policaprolactona biocompatible.

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Protocolo

1. Preparación de Soluciones Polyelectrolyte

  1. Purificar quitosano, como se detalla en Liao et al. Brevemente, crear un 1% (w / v) de solución de quitosano en 2% (v / v) de filtro de ácido acético y vacío usando papel de filtro de grado 93. Neutralizar el filtrado usando NaOH 5 M hasta que el pH se estabilizó a 7. Centrifugar el quitosano precipitado a 1200 xg durante 10 min. Decantar el sobrenadante y añadir agua desionizada para lavar el quitosano. Repetir la etapa de centrifugación y lavado dos veces más. Congelar el quitosano precipitado a -80 ° C y se liofiliza O / N para obtener la forma purificada. Guarde quitosano purificada en un armario deshumidificado.
  2. Pesar 1 g de quitosano purificado en una placa de cultivo de tejido estéril. Coloque el quitosano en el cultivo de tejidos plato tan cerca como sea posible a la lámpara UV en la cabina de seguridad biológica y exponer a luz UV durante 15 min. Con unas pinzas estériles, coloque el quitosano esterilizados en un recipiente de vidrio. Disolver quitosano utilizando filtró 0.15M ácido acético a una concentración final entre 0,5% y 1% (w / v).
  3. Pesar 0,1 g de sal sódica del ácido algínico y disolver en 10 ml agua desionizada (DDI) de agua destilada para obtener un 1% (w / v) solución. Mezclar la sal sódica del ácido algínico durante al menos 2 horas en el mezclador de vórtice para asegurar la disolución completa. Se filtra la solución de alginato a través de filtro de jeringa de 0,2 micras. Guarde la solución de alginato a 4 ° C.
  4. Reconstituir factores recombinantes humanas de crecimiento como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) o beta - factor de crecimiento nervioso (NGF), según lo recomendado por el fabricante.

2. Dibujo de Fibras IPC

  1. Mezclar proteínas, factores de crecimiento u otras biomoléculas en 10-20 l alícuota de la solución de polielectrolito que tiene una carga neta similar. Las moléculas biológicas con carga negativa (por ejemplo, albúmina de suero bovino [BSA]) net deben mezclarse con la solución de alginato. Las moléculas biológicas con carga positiva neta (por ejemplo, VEGF) se deben mezclar consolución de quitosano.
  2. Coloque pequeñas alícuotas (10-20 mu l) de quitosano y alginato en una superficie plana y estable que está cubierta con parafilm. Las gotitas de quitosano y alginato deben ser colocados en estrecha proximidad pero no en contacto uno con el otro.
  3. Ligeramente moje cada punta en un par de pinzas en las gotitas de quitosano y alginato. Traiga las gotitas de polielectrolitos juntos pellizcando los fórceps. Cuando las gotas entran en contacto uno con el otro, tire lentamente el fórceps verticalmente hacia arriba para extraer la fibra IPC desde la interfaz de las dos gotas (figura 1A).
  4. Coloque con cuidado el extremo de la fibra IPC dibujado en la pinza en un colector, como un andamio polimérica plana colocada sobre un mandril giratorio (véase la sección 3 y 4). Girar el mandril a una velocidad fija de 10 mm / seg para permitir la formación de fibras uniforme y beadless IPC. El aumento de la velocidad de dibujo las fibras IPC formar perlas, lo que provocará una liberación por reventamiento de incorporadoterminación de fibra bioquímica y prematura. 10
  5. Para determinar la eficiencia de incorporación, recoger todos los líquidos restantes quedan en el Parafilm diluyendo con 500 l de 1X tampón fosfato salino (PBS). Mida el contenido de proteína o factor de crecimiento en el residuo a través de ensayo BCA (para BSA), ELISA (por VEGF y NGF) o un ensayo apropiado para detectar biomolécula incorporado.

3. Fabricación de Compuesto de hidrogel Cadalso de pululano-dextrano (PD) Polisacárido y Fibras IPC

  1. Fabricación marco pululano sacrificio para la recolección de fibra IPC
    1. Pesar polisacárido pululano y mezclar con agua desionizada destilada (DDI) agua para crear un 20% (w / v) solución acuosa. Mezclar la solución de pululano O / N para asegurar la homogeneidad.
    2. Reparto de 15 g de solución de pululano en un 10 cm de diámetro de cultivo de tejidos de poliestireno (TCPS) plato. Secar la solución de pululano O / N a 37 ° C. Cortar las películas de pululano en 7mm x 7 mm marcos cuadrados.
  2. Preparación de solución de polisacárido pululano-dextrano
    1. Crear un 30% (w / v) solución de los polisacáridos pululano y dextrano (3: 1 ratio) en agua DDI. Mezclar O / N para asegurar la homogeneidad de la solución de polisacárido. Añadir lentamente en bicarbonato de sodio a la solución de polisacárido para lograr una concentración final de 20% (w / v). Mezclar O / N para asegurar la homogeneidad de la solución. Guarde la solución de polisacárido a 4 ° C.
  3. Recogida de fibras IPC en marco pululano
    1. Fije el bastidor pululano sacrificial (sección 3.1) utilizando una pinza. Pegar la pinza de cocodrilo y el marco de pululano en el extremo del mandril giratorio con cinta adhesiva recubierta de plástico. Girar el mandril con el marco fijada a una velocidad constante de 10 mm / seg. El marco de pululano se puede fijar sobre el mandril giratorio en orientaciones deseadas.
  4. Dibuje las fibras IPC utilizando un par de pinzas (sección 1) y ATTACh al final elaborado de las fibras del IPC sobre el marco pululano rotativo. Dibuje las fibras IPC a una velocidad constante. Al llegar a la terminal de la fibra de IPC, secar el constructo O fibras sobre bastidor / N a temperatura ambiente.
  5. Incorporación de fibras IPC en andamio hidrogel PD
  6. Para reticular cada gramo de solución de pululano dextrano, añadir 100 l de 11% (w / v) de sodio trimetafosfato solución acuosa y 100 l de hidróxido de sodio 10M. 7 Mezclar la solución a 60 rpm utilizando una placa agitadora durante 1 a 2 min. Después de la adición de trimetafosfato de sodio y el hidróxido de sodio, la solución de polisacárido se reticular casi inmediatamente. Vierta la solución de polisacárido viscoso en la construcción fibras sobre bastidor para incrustar totalmente las fibras del IPC. Incubar las fibras pululano-dextrano-IPC combinados (PD-IPC) a 60 ° C durante 30 minutos para formar una andamios compuestos químicamente reticulado (Figura 1B).
  7. PRECAUCIÓN: Siga el paso 3.3.2 en la campana de extracción y el uso de equi protección adecuadopo como ácido acético es un corrosivo e inflamable.
  8. Para inducir la formación de poros en el andamio PD-IPC, sumergir todo el andamio en 20% (w / v) de ácido acético durante 20 min.
  9. Retire los reactivos que no han reaccionado por lavado andamios-PD IPC en 1X PBS durante 5 min con agitación a 100 rpm. Repita este paso 2 veces.
  10. Retire el exceso de PBS y congelar inmediatamente los andamios-PD IPC a -80 ° CO / N. Liofilizar los andamios de al menos 24 horas antes de su uso en cualquier ensayos de liberación o bioactividad controladas.

4. Fabricación de Andamios Compuesto de PCL y Fibras IPC

PRECAUCIÓN: El diclorometano es un material peligroso. Utilice la campana de humos y equipo de protección personal al manipular diclorometano.

  1. Creación de sustratos PDMS prístinas y estampados
    1. Crear un polidimetilsiloxano prístina (PDMS) de sustrato elastomérico con un trozo de TCPS de dimensión deseada utilizando el proceso de litografía blanda. Crear pattePDMS rned sustratos mediante el uso de métodos litográficos suaves estándar en poli (metacrilato de metilo) plantillas con la topografía deseada. 12
  2. La fabricación de sacrificio marco PCL para la recolección de fibra IPC
    1. Pesar PCL y disolver en diclorometano para crear un 0,9% (w / v) solución. Por cada 1 cm 2 área del sustrato PDMS, la caída de 500 l de solución PCL 0,9%. Permitir todo el disolvente diclorometano se evapore completamente en la campana de humos. Repetir el proceso de fundición 0,9% PCL para espesar la película hasta el grosor deseado. Retire la película PCL secado del sustrato PDMS. Crear un agujero en el marco de PCL utilizando un golpeador de dimensiones adecuadas. 2
  3. El cobro de las fibras del IPC en el marco de PCL
    1. Fije el bastidor PCL sacrificial con el agujero (de 4.2.1) en una pinza. Pegue la pinza sobre el mandril de rotación mediante el uso de cinta adhesiva recubierta de plástico. Conecte el extremo del trazado de la fibra del IPC en el fram PCLe antes de iniciar la rotación a una velocidad constante de 10 mm / seg (sección 2). Tras el final de dibujo fibra IPC, secar la fibra sobre bastidor constructo O / N a 4 ° C.
  4. Incorporación de fibra sobre bastidor construir en el sustrato PCL con dibujos
    1. Caída de 500 l de solución PCL 0,9% sobre el sustrato PDMS para crear una base de PCL prístina o modelado, según se requiera. Reparto de múltiples capas de solución PCL 0,9% para obtener un andamio con el espesor deseado. Permitir todo el disolvente diclorometano se evapore completamente en la campana de humos.
    2. Coloque la construcción de fibra sobre bastidor (sección 4.3.1) en la parte superior de la base de PCL. Añadir solución PCL 0,9% en los de fibra sobre bastidor construir varias veces para obtener el espesor deseado e incrustar totalmente las fibras de la CIP, la fabricación de un armazón de material compuesto PCL-IPC (Figura 1C).

5. Medición de la liberación de agentes biológicos del compuesto IPC Andamios

  1. Coloque compuesta PD-IPC oAndamios PCL-IPC y autónomos fibras IPC por separado en una placa de 24 pocillos.
  2. Sumerja el andamio y autónomos fibras IPC con 500 l de PBS 1X. Incubar las muestras a 37 ° C. Recoger PBS en diversos puntos temporales (medios de liberación) y reemplazar con 500 l de PBS 1X.
  3. Medir la cantidad de proteína o factor de crecimiento en los medios de liberación usando un ensayo de BCA (BSA), ELISA (VEGF y NGF) u otro ensayo apropiado para calcular el perfil de liberación acumulativo para la biomolécula incorporado.

6. La siembra de células en compuestos Andamios IPC para probar bioactividad de Agentes Biológicos Liberadas

  1. Esterilizar los andamios compuestos liofilizados PD-IPC o PCL-IPC utilizando luz UV en la cabina de seguridad biológica durante al menos 20 min.
  2. Usar técnicas de cultivo celular estándar para obtener una suspensión celular de 2 x 10 5 células en medios de crecimiento 200 l. Semillas de la suspensión celular concentrada en los andamios compuestos. After 20 min, recarga el volumen de medio de cultivo para sumergir totalmente los andamios.
  3. Medir la actividad celular a través de técnicas estándar, tales como ensayo de actividad de Alamar azul metabólica, ensayo de crecimiento de neuritas PC12 o inmunofluorescencia.

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Resultados

En este artículo, hemos tratado de crear los andamios compuestos con fibras de IPC para la liberación sostenida de diversas biomoléculas. Características de las biomoléculas utilizados en este estudio se encuentran en la Tabla 1. IPC fibras se incrustaron primero en un hidrogel hidrófilo PD para crear un armazón de material compuesto PD-IPC (Figura 1B). Molécula Modelo BSA fue probado primero para determinar la viabilidad de utilizar un armazón de material compuesto para la liberación c...

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Discusión

IPC fibras se forman por la interacción de dos polielectrolitos con cargas opuestas. El proceso utiliza la extracción del complejo desde la interfaz de los polielectrolitos, facilitando un proceso de autoensamblaje para la formación de fibras estable. El mecanismo de formación de la fibra IPC asegura que cualquier biomolécula añadió en un polielectrolito cargado de manera similar se puede incorporar durante el proceso de complejación. 10,11 A la inversa, la adición de una biomolécula en el polielectrolito de ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Investigación de Singapur administrada por uno de sus Centros de Investigación de Excelencia, el Instituto Mecanobiología, Singapur. MFAC con el apoyo de la Agencia para la Ciencia, Tecnología e Investigación (Singapur) y la Agencia Nacional de Investigación (Francia) el programa conjunto con el número 1122703037. BKKT proyecto es apoyado por el Instituto Mecanobiología. Agradecemos al Sr. Daniel HC Wong para la prueba de lectura del manuscrito y la Sra Amanecer JH Neo para ayudar en la producción de vídeo.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Pululano Hayashibara Inc, Okayama, Japón: Peso molecular (MW): 200 kDa. Este material es pululano de grado farmacéutico que se utiliza para fabricar marcos de pululano y andamios PD-IPC.
DextranoSigma AldrichD1037MW 500 kDa. Este material ya no es producido por Sigma Aldrich. La alternativa sugerida es el número de catálogo 31392 (Sigma Aldrich). Este material se utiliza para fabricar andamios PD-IPC.
Bicarbonato de sodio Sigma AldrichS5761El bicarbonato de sodio debe añadirse lentamente a la solución de polisacárido pululano-dextrano. La adición rápida de bicarbonato de sodio dará lugar a la precipitación.
Trimetafosfato de sodioSigma AldrichT5508Este producto químico es higroscópico y debe almacenarse en el gabinete de deshumidificación. La solución acuosa de trimetafosfato de sodio siempre debe prepararse fresca.
Hidróxido de sodioSigma AldrichS5881Este material es peligroso y debe manipularse con el equipo de protección adecuado, como guantes de nitrilo.
ChitosanSigma Aldrich448877MW 190-310 kDa. Grado de acetilación del 75% al 85%. La purificación del quitosano es necesaria para crear fibras IPC estables.
Ácido acéticoMerckPuede ser reemplazado por otro tipo de marca. Este material es corrosivo e inflamable. Se debe usar equipo de protección como protector facial, guantes de nitrilo, bata de laboratorio y cubierta de zapatos cuando se manipule este producto químico en la campana extractora.
Ácido algínico sal sódica de algas pardas, baja viscosidadSigma AldrichA2158Disolver en agua durante la noche. Filtrar a través de estéril 0.2  y micro; m filtro de jeringa antes de usar. Almacenar a 4 °C.
Albúmina sérica bovinaquímico SinopharmDisolver en PBS estéril y filtrar usando 0.2 y micro; m Filtro de jeringa antes de usar. 
kit de ensayo BCAPierce23225Este kit se utilizó para medir la liberación de BSA de andamios PD-IPC.
Factor de crecimiento endotelial vascular recombinante humanoR& D systems293-VEDisuelva el factor de crecimiento en una solución de heparina al 0,2% hasta una concentración final de 5  mg/ml.
Sal de Heparina Sódica de PorcinoSigma AldrichH3393Esto puede ser reemplazado por otro tipo de marca. Disolver la sal de heparina en agua estéril a una concentración final del 1% y filtrar a través de 0,2 µ m Filtro de jeringa antes de usar. 
Células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC)LonzaC2517AEste tipo de célula primaria se utilizó en el ensayo para determinar la bioactividad del VEGF después de la liberación de los andamios PD-IPC.
Alamar azulLife TechnologiesDAL1025Se utiliza para medir la actividad metabólica de las células. Incubar el azul de Alamar con células y mantener en condiciones estándar de cultivo celular durante 2 a 4 horas. Mida la absorbancia a 570 nm para determinar la reducción porcentual del azul de Alamar, que se correlaciona con la actividad de la célula.
Liofilizador ScanVac CoolsafeLabogene7.001.200.060Este es un liofilizador no programable que funciona a -105 a -110   °C. Esto puede ser reemplazado por otros liofilizadores de laboratorio estándar.
Policaprolactona (PCL)Sigma Aldrich181609MW 65 kDa. Sigma Aldrich ya no lo fabrica. Esto puede ser reemplazado por el número de catálogo Sigma Aldrich 704105.
DiclorometanoSigma Aldrich V800151Puede ser reemplazado por otro tipo de marca. Este material es peligroso y debe manipularse en la campana extractora. Se debe usar equipo de protección en todo momento cuando se manipule este producto químico.
Polidimetilsiloxano (PDMS; 184 Kit de elastómero de silicona)Dow Corning(240)4019862El kit de elastómero viene con base de polímero y reticulante. La mezcla de la base de polímero y el reticulante en diferentes proporciones dará como resultado una rigidez diferente del PDMS.
Factor de Crecimiento Beta-Nervioso Recombinante Humano (NGF)R& Sistemas D256-GFReconstituido en agua desionizada estéril hasta una concentración final de 100  y micro; g⁠/⁠ml. Alícuota y almacenamiento en -20 ° C hasta su uso.
Células madre mesenquimales humanas (hMSC)CambrexEste tipo de célula se utilizó en el ensayo para determinar el efecto sinérgico del NGF y la nanotopografía.
Células de feocromocitoma PC12 de rata ATCCEste tipo de célula se utilizó en el ensayo de excrecimiento de neuritas para determinar la bioactividad del NGF. Después de la exposición a los medios de liberación con NGF, mida el número de células con extensiones de neuritas y normalice al número total de células.
Papel de filtro de grado 93WhatmanZ699675Se utiliza para la purificación del quitosano después de su precipitación con hidróxido de sodio a pH 7.
Centrífuga de cuchara oscilanteEppendorf5810RPara ser utilizada durante la purificación de quitosano con una velocidad de 1.200 x g.
Motor con mandril que gira a velocidad constanteRhymebusRM5EEl motor se utiliza para la fabricación de fibras IPC en bastidor pululano o PCL.
Solución salina tamponada con fosfatoFirstBaseSterilize a través de filtración (0.2 y micro; M) y autoclave.
Placa de poliestireno para cultivo de tejidos de 10 mm de diámetro (TCPS)GreinerLa placa TCPS se utiliza para la fundición de marcos de pululano.
Kit ELISA VEGF humanoR& D systemsDVE00El kit ELISA se utiliza para la detección de VEGF en el medio de liberación.
Kit ELISA NGF humanoR& D systemsDY256El kit ELISA se utiliza para la detección de NGF en el medio de liberación.
Cinta adhesiva recubierta de plásticoBel-Art 9040336La cinta adhesiva se utiliza para pegar de forma segura la pinza de cocodrilo al mandril giratorio
Reactivo

Referencias

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