Artículo de método

Microentornos-Sandwich como para aprovechar Celulares / Materiales Interacciones

DOI:

10.3791/53090

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4 de agosto de 2015

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1Center for Biomaterials and Tissue Engineering, Universitat Politècnica de València, 2Division of Biomedical Engineering, School of Engineering, University of Glasgow, 3Biomedical Research Networking Center in Bioengineering, Biomaterials and Nanomedicine (CIBER-BBN)

En este artículo

Resumen

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El siguiente protocolo describe el procedimiento para ensamblar cultivos tipo sándwich que se utilizarán como etapa intermedia entre los entornos celulares bidimensionales (2D) y tridimensionales (3D). Los sistemas diseñados pueden tener aplicaciones en ensayos de microscopía, biomecánica, bioquímica y biología celular.

Resumen

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El cultivo celular se ha llevado a cabo tradicionalmente en sustratos bi-dimensional (2D) donde las células se adhieren utilizando receptores ventral a la superficie del biomaterial. Sin embargo, en vivo, la mayoría de las células están completamente rodeados por la matriz extracelular (ECM), lo que resulta en un (3D) la distribución tridimensional de los receptores. Esto puede provocar diferencias en el exterior, en las vías de señalización y por lo tanto en el comportamiento celular.

Este artículo muestra que la estimulación de los receptores de las células dorsales ya adheridos a un sustrato 2D superponiendo una película de un nuevo material (una cultura de sándwich) provoca cambios importantes con respecto a las culturas 2D estándar. Además, la excitación simultánea de los receptores de ventral y dorsal se desplaza el comportamiento celular más cerca de la que se encuentra en entornos 3D. Además, debido a la naturaleza del sistema, una cultura de sándwich es una herramienta versátil que permite el estudio de diferentes parámetros en células / material de interacciones, por ejemplo, la topografía, la rigidez y diferentes recubrimientos de proteínas en ambos los lados ventral y dorsal. Por último, dado que las culturas-sándwich como se basan en sustratos 2D, varios procedimientos de análisis ya desarrollados por las culturas 2D estándar se puede utilizar normalmente, la superación de los procedimientos más complejos necesarios para sistemas 3D.

Introducción

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Tradicionalmente, el cultivo celular se ha llevado a cabo en sustratos bidimensionales (2D), aunque la mayoría de los microambientes celulares in vivo tienen una naturaleza tridimensional (3D). Este entorno 2D antinatural desencadena cambios en el comportamiento celular como una forma de auto-adaptación a un mundo plano, lo que afecta directamente el destino celular 1,2. Por lo tanto, los resultados obtenidos en cultivos de células 2D no siempre son reproducibles in vivo. Esto ha favorecido el desarrollo de nuevos sistemas de cultivo relevantes que buscan ofrecer condiciones más fisiológicas similares a obtener más conocimientos sobre cua....

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Protocolo

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1. Producción de dorsales Sustratos

  1. La producción de una película plana de PLLA por colada solvente.
    1. El trabajo en una campana de humos para preparar una solución de 2% (w / v) PLLA en cloroformo (2 g PLLA en 100 ml de cloroformo) por agitación a temperatura ambiente (RT) hasta que se disuelva completamente (3 hr aproximadamente).
    2. Coloque las arandelas en una placa de Petri de vidrio.
      Nota: Use arandelas de acero inoxidable con un diámetro interior de 10,5 mm (ligeramente menor que el diámetro de la muestra ventral) de manera que la arandela se coloca en la parte superior del sustrato ventral. Otros materiales tales como politetra....

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Resultados

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La estimulación de los receptores dorsales dentro de la cultura de sándwich provoca cambios en la morfología celular, la adhesión celular y las vías de señalización intracelular (por ejemplo, quinasa de adhesión focal, FAK) 10-12. Como un ejemplo, fibroblastos cultivados dentro del sistema de sándwich sobreexpresa la integrina subunidad α 5 en comparación con el 2D, como se ha observado para otros cultivos 3D 15,16.

Destino celular es altamente depen.......

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Discusión

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Hoy en día, la cultura 3D es un tema importante para la industria farmacéutica y biotecnológica, así como la investigación en biología celular, incluyendo el cáncer y células madre. Como consecuencia de ello se han desarrollado varios sistemas de cultivo 3D. Desafortunadamente, las diferencias entre los sistemas 3D suelen dar lugar a un comportamiento celda diferente, lo que dificulta la comprensión del destino celular. Además, los procedimientos experimentales no suelen ser tan sencillo como para los sistemas de cultiv.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Se reconoce el apoyo de ERC a través de HealInSynergy (306990) y el programa FPU AP2009-3626.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ploy(ácido láctico)NatureWorks4042DReactivo
Cubreobjetos (12 mmØ)Marienfeld631-0666Equipo
CloroformoScharlabCL0200Reactivo
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)Sigma105228Reactivo
Jeringa (1 ml)Henke Sass Wolf4010-200V0Equipo
Bomba de jeringaNew Era Sistemas de bombaNE1000Equipo
Fuente de alimentación de CC de alto voltajeequiposserie dealto voltaje Glassman
Hucoa-Herlö s3111Equipo
Campana de flujo laminarTelstarAV30/70Equipo
Fibronectina HumanaSigmaF2006Reactivo
RNeasy Micro KitQiagen74004Reactivo
Microscopio invertidoLeica MicrosystemsDMI 6000Equipo
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Reactivo
AlbúminaSigma-AldrichA7409Reactivo
Tween 20Sigma-AldrichP2287Reactivo
Incubadora de FC de la

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci. 125 (Pt 13), 3015-3024 (2012).
  2. Weiss, P. Rev. Mod. Phys. 31 (1), 11-20 (1959).
  3. Ruffner, H., Lichtenberg, J.

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Etiquetas

Cultivo tipo s ndwichEstimulaci n ventral dorsalRecubrimiento de prote nasSustrato de PLLAEnsayo de cicatrizaci n de heridasImagen en vivoInmunofluorescenciaExtracci n celularReorganizaci n de la MEC

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