Describimos un modelo de cultivo en 3D del epitelio mamario humano que es adecuado para estudiar la acción de las hormonas.
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Artículo de método
Un 3D Cultura Modelo sensibles a hormonas de la glándula mamaria humana epitelio
En este artículo
Resumen
Resumen
El proceso de morfogénesis epitelial mamaria está influenciado por las hormonas. El estudio de la acción hormonal sobre el epitelio mamario mediante cultivos 2D se limita a la proliferación celular y a los criterios de valoración de la expresión génica. Sin embargo, en el organismo, la morfogénesis mamaria ocurre en un entorno 3D. Los sistemas de cultivo 3D ayudan a cerrar la brecha entre el cultivo celular monocapa (2D) y la complejidad del organismo. En este trabajo describimos un modelo de cultivo en 3D del epitelio mamario humano que es adecuado para estudiar la acción de las hormonas. Utiliza la línea celular epitelial de mama humana sensible a las hormonas disponible comercialmente, T47D, y colágeno de cola de rata tipo 1 como matriz. Este modelo de cultivo 3D responde a las principales hormonas mamotrópicas: estradiol, progestinas y prolactina. La influencia de estas hormonas en la morfogénesis epitelial se puede observar después de 1 o 2 semanas de tratamiento según el criterio de valoración. Los cultivos 3D se pueden recolectar para el análisis de la morfogénesis epitelial, la proliferación celular y la expresión génica.
Introducción
A diferencia de los cultivos 2D estándar, modelos sustitutos de cultivo de células 3D permiten el estudio del comportamiento de las células epiteliales en un contexto fisiológicamente relevante, uno parecido a un tejido. culturas 3D de la glándula mamaria han ayudado a aclarar muchos aspectos del desarrollo de la glándula mamaria y la neoplasia. Sin embargo, la mayoría de los modelos de cultivo 3D disponibles actualmente no son adecuados para estudiar la acción hormonal porque las líneas de células epiteliales humanos utilizados para la tarea carecen de expresión del receptor de la hormona 6,7,9.
En este documento, se describe ....
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Protocolo
1. Preparación de los reactivos
- Se disuelve el promegestona sintético progestágeno (R5020) y 17-β-estradiol (E2) en etanol para hacer 10 -3 soluciones madre M. Disolver la prolactina en agua desionizada destilada para hacer una solución stock 1 mg / ml. Disolver el antiestrógeno ICI 182780 en DMSO para preparar una solución de stock 10 -2 M. Almacenar estas soluciones a -20 ° C durante un máximo de 6 meses.
- dextrano carbón (CD) despojado suero y medio CDFBS:
- Heat-inactivar suero fetal bovino (FBS) en un baño de agua a 57 ° durante 30 min.
Nota: Utilice sólo material de vidrio lavado con ácido durante el resto....
- Heat-inactivar suero fetal bovino (FBS) en un baño de agua a 57 ° durante 30 min.
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Resultados
La Figura 1 resume el procedimiento para la preparación de las culturas 3D sensibles a las hormonas. estructuras epiteliales se observan en preparaciones completas de los geles se cultivaron durante 2 semanas en presencia de E2 solo y en combinación con otras hormonas. Sólo las células individuales o grupos de 2-3 células están presentes cuando se añaden ninguna hormona al medio de cultivo (medio CDFBS) (Figura 2). Esta condición sirve como un control negativo.
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Discusión
Aquí, describimos un modelo de cultivo 3D sensible a las hormonas para probar la acción de las hormonas en el epitelio mamario. La respuesta a las hormonas se puede evaluar a nivel de morfología tisular, proliferación celular y expresión génica 12. Una limitación de esta técnica es que la visualización durante el período de cultivo está restringida a la microscopía óptica, ya que los cultivos se cultivan en una placa inferior de plástico. El sistema de cultivo 3D podría adaptarse a placas de fondo de vidrio pa.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos enormemente las contribuciones de redacción por Cheryl Schaeberle. Esta investigación fue apoyada por subvenciones de Avon # 02-2009-093 y 02-2011-095, y NIEHS / NIH ES 08314 a AMS. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales del Instituto Nacional de Ciencias de Salud Ambiental o de los Institutos Nacionales de Salud.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placas de cultivo de tejidos de 12 pocillos (Falcon) | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| Tubos cónicos de poliestireno de 15 ml | Fisher Scientific | 14-959-49D | |
| Carbón activado | Sigma | C-5510 | |
| Carmín Alumbre | Sigma | C1022-100G | |
| Colagenasa, Tipo 3 | Worthington | S0C11784 | |
| Microscopio confocal | Zeiss | LSM510 | Equipado con láser HeNe 633nm |
| Dextran T-70 | Abersham/Pharmacia | 17-0280-01 | |
| DMEM/F-12, HEPES, sin rojo fenol | Life Technologies | 11339-021 | Medios sin rojo de fenol para uso hormonal |
| DMEM, glucosa baja, piruvato, sin glutamina, sin rojo de fenol | Life Technologies | 11054-020 | Medios sin rojo de fenol para uso hormonal |
| 17-β-estradiol | EMD Millipore | 3301 | disuelto en etanol |
| etanol | Koptec | V1001 | |
| Hiclón | suero bovino fetal | SH30070.03 | Para su uso con hormonas, debe ser Carbón Vegetal Dextrano despojado |
| Filtros (115 ml) | Nalgene | 380-0080, 245-0045, 120-0020 | 0,88, 0,45, 0,20 micras, respectivamente |
| Formalina, 10% | Fisher Scientific | SF93-20 | |
| L-glutamina (200 mM) | Life Technologies | 25030-081 | |
| ICI 182,780 (fulvestrant) | Sigma Aldrich | I4409-25MG | disuelto en DMSO |
| Microtomo | Leica | RM2155 | |
| Medios de inclusión de tejidos | McCormick Scientific | 39502004 | |
| Penicilina | Sigma | 7794-10MU | Disuelto en 10 ml de agua destilada desionizada |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| Solución salina tamponada con fosfato pH 7.4 | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | |
| Prolactina | Sigma Aldrich | L4021-50UG | Disuelto en agua destilada desionizada |
| Promegestone | Perkin Elmer | NLP004005MG | Disuelto en etanol |
| Colágeno de cola de rata | Corning | 354236 | Los lotes pueden contener diferentes concentraciones, tenga en cuenta en consecuencia |
| Bisturí | Miltex | 4311 | |
| Procesador de tejidos de sobremesa | semicerrado Leica | TP1020 | |
| Hidróxido de sodio | Sigma Aldrich | S5881 | Prepare 1N NaOH stock |
| StaticMaster Cepillo antiestático | Pipetas | C3500 | |
| Stripette | Corning | 4101 | |
| Frascos T-25 | Corning | ||
| Casetes de Pañuelos | Fisher Scientific | 15-200-403E | |
| Wheaton Viales, Vidrio, 20 ml | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| Xileno | VWR | 95057-822 |
Referencias
- Barnes, C., et al. From single cells to tissues: interactions between the matrix and human breast cells in real time. PLoS ONE. 9, e93325(2014).
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S.
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Reimpresiones y permisos
