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Artículo de método

Ferromagnético Bare Metal stent para la captura de la célula endotelial y Retención

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DOI:

10.3791/53100

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18 de septiembre de 2015

 ,  ,  ,  , 
1Division of Engineering, Mayo Clinic, 2Division of Cardiovascular Diseases, Mayo Clinic, 3Department of Cardioangiology, ICRC, St. Anne's University Hospital, 4Mayo Clinic College of Medicine

En este artículo

Resumen

Nuestros objetivos eran para diseñar, fabricar y probar los stents ferromagnéticos para la captura de las células endoteliales. Diez stents fueron probados para la fractura y 10 más stents se ensayaron para determinar el magnetismo retenido. Finalmente, 10 stents se probaron in vitro y 8 más stents fueron implantados en 4 cerdos para mostrar la captura de células y la retención.

Resumen

Se necesita endotelialización rápida de los stents cardiovasculares para reducir la trombosis del stent y evitar la terapia anti-plaquetaria que puede reducir el riesgo de hemorragia. La viabilidad de utilizar fuerzas magnéticas para capturar y retener células endoteliales excrecencia (EOC) marcadas con nanopartículas de óxido de hierro súper paramagnéticas (SPION) se ha demostrado previamente. Sin embargo, esta técnica requiere el desarrollo de un stent mecánicamente funcional a partir de un material magnético y biocompatible seguido de in-vitro e in-vivo de pruebas para demostrar la endotelización rápida. Hemos desarrollado un stent débilmente ferromagnética de acero inoxidable de 2.205 duplex utilizando el diseño asistido por ordenador (CAD) y su diseño se refinó aún más el uso de análisis de elementos finitos (FEA). El diseño final del stent exhibió una deformación principal por debajo del límite de fractura del material durante rizado mecánico y expansión. Cien stents fueron fabricados y un subconjunto de ellos se utilizó para ensayos mecánicos, retained mediciones del campo magnético, estudios in vitro de captura celular, y los estudios in vivo de implantación. Diez stents fueron probados para su despliegue para verificar si sostenidas que prensa y la expansión del ciclo sin fallo. Otros 10 stents se magnetizan usando un imán fuerte neodimio y se midió su campo magnético retenido. Los stents mostraron que el magnetismo retenido era suficiente para capturar marcado con SPION EOC en nuestros estudios in vitro. Captura EOC SPION marcado y la retención se verificó en modelos animales grandes implantando 1 stent magnetizado y 1 no magnetizado stent de control en cada uno de 4 cerdos. Las arterias con stent se explantaron después de 7 días y se analizaron histológicamente. Los stents débilmente magnéticas desarrolladas en este estudio fueron capaces de atraer y retener a las células endoteliales SPION marcado que pueden promover la curación rápida.

Introducción

Los pacientes implantados con stents vasculares fabricados con materiales trombogénicos como el acero inoxidable, el cromo cobalto y el cromo platino, tanto stents metálicos (BMS) como stents liberadores de fármacos (DES), necesitan terapia antiplaquetaria para prevenir la formación de trombos. Los BMS se curan rápidamente, pero están sujetos a una reestenosis en etapa tardía debido a una curación incompleta. Los DES requieren tratamiento antiplaquetario a largo plazo debido al retraso en la cicatrización. El tratamiento antiagregante plaquetario administrado para evitar la trombosis como resultado de una cicatrización incompleta o tardía conduce a un mayor riesgo de sangrado y puede no ser adecuado para ciertos pacientes1,2. Un stent ideal sanará completa y rápidamente, evitando así la terapia antiagregante plaquetaria a largo plazo y la reestenosis en etapa tardía. Esta cicatrización completa solo se puede lograr si el stent se recubre rápidamente con una monocapa de células endoteliales después de la implantación. Se ha demostrado que el recubrimiento de los stents con materiales biocompatibles como el oro u otros biopolímeros mejora la resistencia a los trombos, pero ninguna de estas técnicas logró la compatibilidad sanguínea ideal como podría ser posible mediante el recubrimiento con células endoteliales3,4.

Un stent puede recubrirse con células endoteliales después de la implantación atrayendo a las células progenitoras circulantes. Esta técnica de autosiembra se puede lograr mediante el uso de ligandos y anticuerpos. Pero esta técnica está limitada por el bajo número de células progenitoras endoteliales circulantes. Una estrategia prometedora es la administración de células directamente al stent inmediatamente después de la implantación durante un corto período de oclusión del flujo sanguíneo3,5. Esta estrategia requiere una técnica para capturar rápidamente las células y retenerlas en el stent incluso después de restaurar el flujo sanguíneo. Hemos desarrollado una técnica en la que se utiliza un stent magnético para atraer y retener las células endoteliales marcadas magnéticamente después de la implantación. Para lograr esto, se requiere un BMS funcional con suficientes propiedades magnéticas para capturar y retener células endoteliales marcadas magnéticamente6.

En este artículo, discutimos los métodos para diseñar, fabricar y probar un stent de acero inoxidable 2205. Los stents se diseñaron mediante CAD y FEA. Los stents fabricados se magnetizaron con un imán de neodimio y el campo magnético retenido se midió con una sonda de microsensor de magnetorresistencia. A continuación, probamos los stents para la captura de células marcadas magnéticamente en una placa de cultivo durante nuestros experimentos in vitro. Finalmente, los stents se probaron in vivo mediante el implante de stents magnéticos y no magnéticos en 4 cerdos y el análisis histológico de las arterias con stents.

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Protocolo

Todos los estudios con animales fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el Comité de Utilización (IACUC) en la Clínica Mayo.

1. Diseño y análisis de un stent de acero inoxidable 2205

  1. El diseño de un stent metálico utilizando CAD
    1. Hacer un cilindro hueco extruido seleccionando en función de 'jefe extruido / base "con el espesor de pared igual al espesor del puntal del stent.
    2. Diseñar un modelo de stent en un plano de boceto diferente tangente al cilindro extruido. Hacer la anchura del patrón plano para que coincida con la circunferencia del cilindro hueco extruido.
    3. Transfiera el patrón de diseño plano sobre el cilindro hueco utilizando la función de envoltura.
    4. Guarde la pieza en su formato original y también en formato ACIS a exportar para FEA.
  2. El análisis de elementos finitos para los modelos de stent
    1. Importe la geometría sólida guardado en formato ACIS en el módulo de parte del software de FEA para más analyses.
    2. Modelo 2 cilindros analíticos coaxialmente al stent en el modelador de parte del software FEA. El cilindro exterior tiene un diámetro inicial mayor que el diámetro de la endoprótesis para simular el rizador y el cilindro interior tiene un diámetro inicial de 1 mm para simular un globo para la inflación.
    3. Doble click en la opción 'casos' árbol del modelador de montaje para montar lo anterior dijo piezas en posiciones relativas.
    4. Utilice el módulo de la malla del software FEA, especifique el tipo de elemento como 20-nodo de elemento hexaédrica con integración reducida, especifique el tamaño del elemento, y la malla del stent.
    5. Especificar pares de contacto rígidas sin fricción entre el stent y los dos cilindros, respectivamente, en las "propiedades de interacción" del árbol del modelo.
    6. Asigne el comportamiento tensión-deformación elasto-plástico de 2.205 de acero inoxidable para el modelo de stent.
    7. Definir las condiciones de contorno para engarzar en primer lugar, el cilindro exterior de 1 mm, que simula la cRimping del stent. Retire el cilindro exterior para simular la relajación del stent engarzado. Expandir el cilindro interior a 3 mm para simular la expansión y finalmente, retirar el cilindro interior para simular retroceso del stent.
    8. Definir los parámetros de simulación, incluyendo el número de procesadores y la cantidad de memoria RAM asignados en el ítem del árbol de modelo "Análisis" y ejecutar la simulación.
    9. Una vez que la simulación es completa, abrir el archivo resultado (filename.odb) y post-proceso de los resultados para estudiar las deformaciones principales y iterativamente mejorar el diseño del stent para lograr una cepa principal de 20%, que es menor que el límite fallo del material .

2. Fabricación de stent y pruebas para que prensa y Expansión

  1. Fabricación de stent
    1. Obtener los tubos de acero inoxidable de 2205 por la perforación del arma y la precisión de barras de molienda stock de material en un mecanizado de precisión empresa como Acción Precision Products en Pioneer,OH.
    2. Transfiera los tubos de tierra de precisión y el diseño del modelo del stent plana a una empresa de corte stent como Laserage Technology Corporation en Waukegan, IL de corte por láser y electropulido.
    3. Pasivar la superficie de los stents electropulido sumergiendo en un ácido fuerte (50% HCl) durante 10 min seguido de una base (10% NaHCO 3) durante otros 10 min. PRECAUCIÓN: manejar productos químicos con equipo de protección adecuado y bajo una campana de humos. Finalmente, lavar los stents con alcohol etílico y agua desionizada. Este proceso se llama decapado con ácido.
  2. Prueba de stent fabricado para prensar y expansión
    1. Unir el stent sobre un globo tríptico utilizando una mano herramienta que prensa. Sostenga el stent y el globo tríptico en la herramienta que prensa. Presione el asa para deformar radialmente el stent se doble, en el globo.
    2. Inspeccione el stent engarzado con un microscopio para engaste uniforme y cualquier señal de fallo en la estructura debidoa la deformación plástica.
    3. Expandir al diámetro de 3 mm diseñado mediante la presurización del globo tríptico con agua. Examine los stents expandidos para fracturas microscópicas y expansión uniforme.

3. Caracterización de Stent para Campo Magnético Retenido

NOTA: imán cilíndrico de 2 pulgadas de diámetro y 1 pulgada de altura se utilizó en este estudio. Los polos del imán están alineados a lo largo del eje. La densidad de superficie de flujo magnético del imán es de aproximadamente 1 T.

  1. Magnetizar los stents diametralmente o axialmente mediante un potente imán de neodimio. Sostenga el stent cerca del imán fuerte durante aproximadamente 1 min para la magnetización.
  2. Sostenga el stent en una de las caras planas con su diámetro a lo largo de las líneas de campo magnético para ser magnetizados diametralmente o sostener el stent junto a la superficie cilíndrica con su eje a lo largo de las líneas de campo magnético para magnetizar axialmente. Fiel magnética Retenidod del stent se encontró que era estable durante al menos 24 horas, pero utilizar el stent tan pronto como sea posible después de la magnetización.
  3. Montar los stents individualmente sobre mandriles de vidrio y luego montar los mandriles de vidrio en el mandril de precisión de la fijación de sondeo magnético. Microsensor sonda magnética puede ser posicionada precisamente cerca de la stent sin tocar la superficie usando el XYZ fases de montaje del dispositivo de fijación de sondeo magnética (Figura 4).
  4. Medir la lectura de referencia del microsensor magnético lejos del stent y luego medir el campo magnético retenido en la superficie del stent mediante la colocación de la sonda utilizando las etapas XYZ de la fijación de sondeo magnético.

4. Estudios captura de células magnéticas

  1. La obtención de células, etiquetado con SPION y tinción con colorante fluorescente
    1. Derivar las células endoteliales excrecencia (EOC) de sangre periférica porcina como se describe en 5,7. Cultura en un matraz T-75 until aproximadamente el 80% de confluencia (5x10 6 a 8x10 6 células).
    2. Sintetizar SPIONs como magnetita diámetro de 10 nm (Fe 3 O 4) núcleo rodeado por 50 nm de espesor de poli (láctico-co-glicólico) (PLGA) shell como se describe en el 8,9.
    3. Incubar la EOC derivada con SPION a una concentración de 200 g / ml de medio de cultivo celular durante 16 horas a 37 ° C
    4. Aspirar el medio de cultivo celular suavemente. Lave suavemente las células mediante la adición de 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) al matraz, balanceo, y aspirar el PBS.
    5. Teñir las células con tinte fluorescente (CM-Dil) para la visualización durante los experimentos. Esto se realiza según las instrucciones del fabricante mediante la adición del colorante a 10 ml de medio de cultivo celular a una concentración de 5 l / ml y la incubación con las células durante 30 min a 37 ° C.
    6. Se lavan las células con PBS como en el paso 4.1.4 e incubar con 3 ml de solución de tripsina-EDTA 0,25% durante 5 min a 37 ° C alevantar las células del matraz.
    7. Transferir la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml, con parte superior de PBS, y se centrifuga a 500 xg durante 5 min para formar un sedimento celular.
    8. Vuelva a suspender el sedimento celular en PBS a una concentración de 1-2x10 6 células / ml y mezclar bien con la pipeta dentro y fuera del tubo cónico varias veces.
  2. Los estudios in vitro de células
    1. Diseñar y fabricar (por ejemplo, la impresión 3D) en un accesorio sencillo para sujetar el stent justo por encima de la superficie de un cubreobjetos de vidrio.
    2. Desmagnetice un stent utilizando un degausser electromagnética o magnetizar un stent diametralmente o axialmente usando un imán fuerte neodimio.
    3. Pipetear la EOC SPION marcado suspendido en PBS en el plato que contiene los stents de control axialmente magnetizados o diametralmente magnetizadas o no magnetizadas. Imagen de los stents con EOC suspendido en PBS inmediatamente para la fluorescencia utilizando un microscopio de fluorescencia invertida.
5. En vivo Los estudios en animales

  1. La implantación del stent
    1. Dibuja sangre periférica de 4 cerdos Yorkshire sanos - un peso aproximado de 50 kg - 3 semanas antes de la implantación de stent, respectivamente, y la cultura EOC como se describe en 5,7.
    2. Administrar la medicación antiplaquetaria comenzando 3 días antes de la cirugía (aspirina 325 mg y clopidogrel 75 mg al día).
    3. En el día de la implantación del stent, anestesiar a los cerdos con intramuscular Telazol, xilazina y atropina (5 / 2-3 / 0,05 mg / kg, respectivamente) como se indica en las directrices para el cuidado de los animales y el uso institucionales aplicables.
    4. Intubar y colocar el cerdo en la inhalación de 1-2,5% anestesia isoflurano.
    5. Afeitarse la región del cuello ventral del cerdo y llevar a cabo el procedimiento en condiciones estériles generales.
    6. Implante 1 magnetizado y 1 stent no magnetizado en la arteria coronaria derecha (CD) utilizando la técnica de cateterismo cardíaco normal.
      1. Catheterización de los animales debe ser realizado por un cardiólogo intervencionista entrenado. Acceder a la arteria carótida derecha con una vaina francés 9.
      2. Canular la arteria coronaria diana y se inyecta un medio de contraste yodado para obtener imágenes de fluoroscopia.
      3. Coloque un alambre guía estándar de 0,014 pulgadas coronaria en la arteria. Avance el balón y el stent usando este cable guía y desplegar el stent en un vaso de diámetro 3-3,5 mm.
    7. Ocluir el flujo de sangre dentro de la RCA proximal a los stents implantados usando un globo sobre el alambre y entregar aproximadamente 2x10 6 EOC autólogo marcado con SPION suspendido en 4 ml de PBS a través del catéter central durante un período de 2 min.
    8. Restablecer el flujo sanguíneo a la RCA después de 2 min de la oclusión adicional.
    9. Traslado al animal a la sala de recuperación y vigilar de cerca al animal hasta que se haya recuperado la conciencia.
    10. Continuar para administrar medicamentos anti-plaquetas (aspirina 325 mg y clopidogrel 75 mg) después de la operación hasta el sacrificio.
  2. Stent explante y la histología
    1. La eutanasia a los animales 7 días después de la cirugía por primera anestesiar al animal como se ha explicado anteriormente y luego administrar por vía intravenosa una dosis letal de pentobarbital sódico (100 mg / kg) según las pautas de cuidado de animales y uso institucional aplicables.
    2. Quirúrgicamente cosechar los segmentos arteriales con stent. Fijar las arterias explantadas en tampón de formalina al 10% durante un mínimo de 30 min. Deje las muestras en tampón de formol para su posterior análisis histológico.
    3. Externalizar la muestra fijada a las instalaciones capaces de realizar la histología con stents metálicos. Durante este tratamiento, las muestras se incrustan en metacrilato de metilo, seccionada, y se analizaron histológicamente usando técnica de tinción de Mallory con tinción de azul de Prusia para partículas de hierro.

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Resultados

Diseño de stent iterativo basado en FEA (Figura 1) mostró un stent que puede engarzado y ampliar con una cepa principal de 20%, que es menor que la deformación última 30%. Que prensa y ensayo de expansión (Figura 2) no mostraron signos de fractura. Fotos del stent deformado mostraron buen acuerdo con deformaciones FEA calculados y también imágenes de microscopía no mostraron fracturas (Figura 3). Como era de esperar de las mediciones del campo magnético retenidas ...

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Discusión

Hemos desarrollado un stent magnética que puede funcionar como un stent de metal desnudo y puede atraer a las células endoteliales SPION marcado. En estudios previos relacionados con stents magnéticos, los investigadores han utilizado níquel stents recubiertos comerciales y bobinas o mallas hechas de materiales magnéticos debido a la falta de disponibilidad de un stent ferromagnético 5,10-14. Otros grupos también han utilizado la naturaleza paramagnética de stents de acero inoxidable 304-grado disponibles en ...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Tyra Witt, Cheri Mueske, Brant Newman y el Dr. Peter J. Psaltis, MBBS, PhD por sus valiosas contribuciones. Este estudio contó con el apoyo financiero del Fondo Europeo de Desarrollo Regional – FNUSA-CICR (No. CZ.1.05/1.100/02.0123), Subvención para el Desarrollo Científico de la Asociación Americana del Corazón (AHA #06-35185N), Institutos Nacionales de Salud (T32HL007111) y el Fondo de Innovación de Grainger – Fundación Grainger.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2205 Acero inoxidableCarpenter Technology CorporationBarra redonda material de stock
AbaqusDassault systemsSoftware
AtropineMedicamento de prescripción.
ClopidogrelNombre comercial: Plavix. Medicamento recetado.
CM-DiILife TechnologiesV-22888Sondas moleculares, Eugene, OR
Medio de crecimiento endotelial-2LonzaCC-3162
Herramienta de prensado manualIngeniería de bloquesM1-RMC
Ácido clorhídrico (HCl)Sigma AldrichMFCD00011324PRECAUCIÓN: use el equipo de protección y el mango debajo de la campana extractora
Anestesiacon isofluranoPiramal Cuidados Críticos, Inc. 
Alcohol etílicoSigma AldrichMFCD00003568
Imán de NdFeB de 2" de diámetro x 1" de espesorIncreíbles imanesD1000PDisco magnético magnetizado axialmente con polos en caras planas
GloboSe puede utilizar cualquier globo tríptico de la OTW disponible en el mercado
Solución salina tamponada con fosfatoLife Technologies10010-023Comúnmente conocido como
PBS Bicarbonato de sodio (NaHCO3)Sigma AldrichMFCD00003528
Pentobarbital sódicoZoetisNombre comercial: Sleepaway (26%), FatalPlus, Beuthanasi. La sustancia controlada solo debe ser solicitada por un vehículo con licencia
SolidWorksDassault SystemsSoftware
MicroMagneitcs Sensible SolutionsSonda larga STJ-020 microsensor
SPIONMayo ClinicNanopartículas sintetizadas internamente (Ref: Lee, S. J. et al. Nanopartículas de óxidos férricos magnéticos encapsulados con poli(D,L latido-co-glicólido) y sus aplicaciones al agente de contraste para imágenes por resonancia magnética. J Magn Magn Mater 272, 2432-2433, doi:DOI 10.1016/j.jmmm.2003.12.416 (2004))
TelazolZoetisSustancia controlada que debe ser solicitada únicamente por un veterinario autorizado
Tripsina EDTALife Technologies25200-056Gibco, Grand Island, NY
XylazineBayer Animal HealthNombre comercial: Rompun. La sunstance controlada debe ser ordenada solo por un veterinario con licencia
tríptico Over-The-Wire Micro sensor

Referencias

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