Métodos para inhibir bacteriana Pyomelanin Producción y determinar el correspondiente aumento en la sensibilidad al estrés oxidativo

Resumen

La producción de piomelanina bacteriana resulta en una mayor resistencia al estrés oxidativo y a la virulencia. Informamos sobre las técnicas que se pueden utilizar para determinar la inhibición de la producción de piomelanina y analizar el aumento resultante en la sensibilidad al estrés oxidativo en las bacterias, así como determinar la concentración mínima inhibitoria (MIC) del antibiótico.

Resumen

La piomelanina es un pigmento extracelular de color marrón rojizo producido por varias especies bacterianas y fúngicas. Este pigmento se deriva de la vía del catabolismo de la tirosina y contribuye a aumentar la resistencia al estrés oxidativo. La producción de piomelanina en Pseudomonas aeruginosa se reduce de manera dependiente de la dosis mediante el tratamiento con 2-[2-nitro-4-(trifluorometil)benzoil]-1,3-ciclohexanediona (NTBC). Describimos un método de titulación que utiliza múltiples concentraciones de NTBC para determinar la concentración del fármaco que reducirá o suprimirá la producción de piomelanina en las bacterias. El método de valoración tiene un resultado fácilmente cuantificable, una reducción visible en la producción de pigmento con el aumento de las concentraciones de fármacos. También describimos un método de placa de microtitulación para analizar la concentración mínima inhibitoria (CMI) de antibióticos en bacterias. Este método utiliza un mínimo de recursos y puede ampliarse fácilmente para probar varios antibióticos en una placa de microtitulación para una cepa de bacterias. El ensayo MIC se puede adaptar para probar los efectos de los compuestos no antibióticos en el crecimiento bacteriano en concentraciones específicas. Finalmente, describimos un método para probar la sensibilidad bacteriana al estrés oxidativo mediante la incorporación de H₂O₂ en placas de agar y la detección de múltiples diluciones de bacterias en las placas. La sensibilidad al estrés oxidativo está indicada por las reducciones en el número y tamaño de las colonias para las diferentes diluciones en placas que contienen_H2O2 en comparación con un control sin_H2O2. El ensayo de placa puntual de estrés oxidativo utiliza un mínimo de recursos y bajas concentraciones de_H2O2. Es importante destacar que también tiene una buena reproducibilidad. Este ensayo de placa puntual podría adaptarse para probar la sensibilidad bacteriana a varios compuestos mediante la incorporación de los compuestos en placas de agar y la caracterización del crecimiento bacteriano resultante.

Introducción

Pseudomonas aeruginosa es una bacteria Gram negativa que produce una variedad de pigmentos, incluida la piomelanina, un pigmento marrón rojizo que ayuda a proporcionar protección contra el estrés oxidativo^1-4 y se une a una variedad de compuestos, incluidos los antibióticos aminoglucósidos^5-7. La producción de piomelanina está causada por un defecto en la vía del catabolismo de la tirosina^4,8, ya sea a través de deleciones o mutaciones del gen que codifica la homogentisa 1,2-dioxigenasa (HmgA)^1,9 o a través de desequilibrios en las diversas enzimas de la vía¹⁰. El homogentizado se acumula debido a la inac....

Protocolo

1. Preparación de medios de cultivo, antibióticos, y 2- [2-nitro-4- (trifluorometil) benzoil] -1,3-ciclohexanodiona (NTBC)

1. Hacer caldo LB (1% triptona, extracto de levadura 0,5%, 0,25% de NaCl en H ₂ O) y alícuota en volúmenes apropiados. Esterilizar en autoclave. Almacenar a temperatura ambiente.
2. Hacer 100 ml de LB agar (1% triptona, extracto de levadura 0,5%, 0,25% de NaCl, 1,5% de agar en H ₂ O) en matraces de 250 ml. Esterilizar en autoclave y almacenar a temperatura ambiente. Asegúrese de que el agar se derrita antes de verter en placas.
   NOTA: Los frascos que contienen 100 ml de agar LB producirá 4 platos. La can....

Resultados

Titulaciones NTBC

Las titulaciones NTBC se utilizaron para determinar si NTBC fue capaz de reducir la producción de pyomelanin en P. aeruginosa, y también identificar la concentración de NTBC que elimina o reduce la producción pyomelanin para uso en ensayos adicionales. Es posible que haya variaciones en los niveles de pyomelanin producido en diferentes repeticiones, pero las tendencias generales permanecer constante. El ensayo de valoración NTBC también podría ser modifica.......

Discusión

El método de titulación de NTBC descrito en este protocolo permitirá al usuario determinar si NTBC puede reducir o eliminar la producción de piomelanina en bacterias y determinar la concentración de NTBC requerida. El paso más crítico en el ensayo de valoración de NTBC es determinar el rango de concentraciones de NTBC que se utilizarán en el ensayo. Diferentes cepas de P. aeruginosa tienen diferentes sensibilidades a NTBC, y las cepas de laboratorio pueden ser más sensibles a NTBC que los aislados clínicos^1.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2-[2-nitro-4-(trifluorometil)benzoil]-1,3-ciclohexanediona (NTBC)	Sigma-Aldrich	SML0269-50mg	También llamado nitisinona.  Soluble en DMSO.
H2O2	Sigma-Aldrich	216763-100ML	30 % en peso en H2O.  Estabilizado.
Gentamicina	Oro Bio	G-400-100	Soluble en H2O.  Filtro esterilizante.
Kanamicina	Fisher Scientific	BP906-5	Soluble en H2O.  Filtro esterilizante.
Tobramicina	Sigma-Aldrich	T4014-100MG	Soluble en H2O.  Filtro esterilizante.