Artículo de método

Evaluación del comportamiento de sensibilización inducida por la cocaína y la preferencia de lugar condicionado en ratones

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DOI:

10.3791/53107

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18 de febrero de 2016

 ,  ,  , 
1Department of Psychiatry, Harvard Medical School, McLean Hospital

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo está destinado a permitir a los investigadores realizar experimentos diseñados para probar estos aspectos de la adicción utilizando los ensayos de preferencia de lugar condicionado y sensibilización conductual locomotora.

Resumen

Se cree que las experiencias gratificantes con drogas crean fuertes asociaciones contextuales y fomentan la ingesta repetida. A su vez, las exposiciones repetidas a las drogas de abuso producen alteraciones duraderas en la función cerebral de los individuos vulnerables, y estas alteraciones persistentes probablemente sirven para mantener las conductas desadaptativas de búsqueda y consumo de drogas características de la adicción/dependencia2. En los roedores, la experiencia de recompensa y las asociaciones contextuales se miden con frecuencia utilizando el ensayo de preferencia de lugar condicionado, o CPP, en el que se mide la preferencia por un contexto previamente emparejado con drogas. La sensibilización conductual, por otro lado, es un aumento en un comportamiento inducido por drogas que se desarrolla progresivamente a lo largo de exposiciones repetidas. Dado que los comportamientos sensibilizados a menudo se pueden medir después de varios meses de abstinencia de drogas, dependiendo de la dosis y la duración de la exposición inicial, se consideran correlatos observables de la plasticidad duradera inducida por la droga. Los investigadores han encontrado que estos ensayos son útiles para determinar los sustratos neurobiológicos que median los aspectos de la adicción, así como para evaluar el potencial de diferentes intervenciones para interrumpir estos comportamientos. Este manuscrito describe protocolos básicos y efectivos para la PPC en ratones y la sensibilización conductual locomotora a la cocaína.

Introducción

La investigación dirigida a comprender la adicción a las drogas utilizando modelos animales debe adoptar una variedad de enfoques para abordar cada uno de los diversos componentes que obstruyen el éxito del tratamiento, incluida la recompensa/refuerzo/motivación y la retirada y recaída, así como la persistencia general que complica aún más estos problemas en la adicción. Dado que se cree que las experiencias gratificantes asociadas con el consumo de una droga de abuso motivan el uso posterior, los estudios centrados en las asociaciones entre el contexto de la droga pueden ser particularmente útiles para comprender los mecanismos cerebrales que contribuyen al consumo y la búsqueda de drogas. Uno de estos ensayos, la preferencia de lugar condicionada (CPP, por sus siglas en inglés), es un método de alto rendimiento para comparar las diferencias de grupo en la sensibilidad a la recompensa. La interpretación tradicional de la tarea implica el condicionamiento clásico, o pavloviano, donde un estímulo condicionado (SC) se empareja con un estímulo incondicionado (SCU), y después de múltiples emparejamientos, el SC provoca el mismo comportamiento que el SCU (sin embargo, ver39,40). Teóricamente, los animales aprenden a asociar un estado interoceptivo (recompensa o aversión) con señales contextuales. A continuación, se evalúa la intensidad aversiva o apetitiva relativa del estado interoceptivo determinando la preferencia del animal por las señales contextuales. El uso del condicionamiento de lugar para medir las asociaciones entre drogas y recompensas se remonta al menos a 1957, a un estudio que utilizó morfina en ratas en un laberinto en Y3,4. En las últimas décadas, las variaciones de este método se han utilizado ampliamente para estudiar la preferencia de lugar y la aversión en roedores a diversos estímulos, y sigue siendo particularmente útil en el estudio de las asociaciones inducidas por las drogas de abuso. En la investigación de la adicción a las drogas, el ensayo se ha utilizado para evaluar las propiedades gratificantes de una serie de drogas y la contribución de diferentes sistemas cerebrales y proteínas a la recompensa de las drogas (para revisiones, ver5-7,44). Si bien existen métodos superiores para evaluar los factores que contribuyen a la adicción a las drogas, a saber, la autoadministración de drogas, la CPP es un enfoque simple y mucho más accesible para medir la función de recompensa.

La mayoría de los protocolos actuales para la preferencia y aversión a lugares condicionados (CPA) utilizan un aparato que permite a los roedores tener acceso a dos cámaras distintas, ya sea a través de una puerta o una cámara de conexión más pequeña. Las distinciones entre las dos cámaras a menudo se basan, como mínimo, en señales visuales y táctiles, incluido el color de la pared y la textura del piso, pero a veces incluyen otros elementos, como señales olfativas. Los diseños "sesgados" generalmente intentan revertir una preferencia innata preexistente por una cámara sobre la otra, como la que los roedores generalmente muestran para una cámara negra sobre blanca. Los diseños "imparciales" tienen como objetivo crear una preferencia a una de las dos cámaras que inicialmente eran igualmente atractivas al contrarrestar aleatoriamente la asignación a cualquiera de las cámaras dentro de un grupo. Un diseño "equilibrado" se utiliza cuando los animales muestran pequeñas preferencias, pero no prefieren, como grupo, la misma cámara. Los objetivos de este último diseño son producir 1) puntuaciones de preferencia antes de la prueba para la cámara emparejada con cocaína (eventual) que no sean significativamente diferentes entre los grupos experimentales y 2) una preferencia insignificante para la cámara emparejada con cocaína en la prueba previa, ya sea positiva o negativa8. El diseño equilibrado es ideal para su uso con las cámaras descritas, que utilizan sesgos contradictorios para el color de la pared (negro sobre blanco) y el suelo (alambre sobre barra), lo que da como resultado una distribución aproximadamente igual de pequeñas preferencias para los lados blanco y negro en diferentes animales. Los cálculos de equilibrio se describen con más detalle a continuación.

Durante el acondicionamiento, los animales son expuestos a una droga y rápidamente colocados en uno de estos dos entornos durante un período de tiempo limitado. La exposición se realiza típicamente a través de inyección intraperitoneal (i.p.) o, a veces, subcutánea (s.c.), aunque también se han desarrollado paradigmas para la autoadministración intravenosa (i.v.)9 e infusiones intracraneales38 en un aparato de preferencia de lugar. Estos emparejamientos se complementan con emparejamientos no farmacológicos (vehículos) de la misma duración realizados en la cámara opuesta, que pueden tener lugar el mismo día que los emparejamientos farmacológicos o en días separados. En general, cuando se les permite explorar el aparato después del condicionamiento, los animales pasarán más tiempo donde recibieron una droga gratificante (es decir, una que los humanos y los animales se autoadministrarán voluntariamente), mientras que evitarán un lugar donde se les administró una droga que indujo una enfermedad (por ejemplo, cloruro de litio). Varios estudios se han dedicado a optimizar las condiciones de preferencia del lugar a las diferentes drogas de abuso (para una revisión, ver7). Las dosis de cocaína (i.p.) para ratones generalmente oscilan entre 1 y 20 mg/kg, con dosis inferiores a 5 mg/kg a menudo utilizadas para analizar la alta sensibilidad en un grupo. Por lo general, se requieren dos o más emparejamientos de medicamentos para ratones adultos10, y la duración de estos emparejamientos es una consideración importante. Las dosis muy bajas de cocaína requieren un acondicionamiento inmediato y breve, probablemente porque este método captura el período más gratificante de la exposición. Los períodos de acondicionamiento tardíos o muy largos pueden resultar en no preferencia, o incluso pueden inducir aversión11,12. Aquí se presenta un método básico para obtener la preferencia de lugar condicionada a la cocaína en ratones adultos.

Si bien el ensayo CPP es un método ideal para evaluar el aprendizaje relacionado con la recompensa y la memoria de las asociaciones entre el contexto de la droga y la droga, la sensibilización conductual es posiblemente más fácil de realizar y permite evaluar los cambios que se desarrollan durante el tratamiento repetido. También conocida como tolerancia inversa, las conductas sometidas a sensibilización se intensifican gradualmente a lo largo de las exposiciones repetidas a una droga de abuso en particular, especialmente psicoestimulantes, y se sabe que se produce una sensibilización cruzada entre algunas de estas drogas, pero no todas. Una de las primeras evaluaciones de la sensibilización locomotora inducida por la cocaína, en particular, en roedores se publicó en 197613. Varios laboratorios han demostrado que la locomoción sensibilizada es detectable mucho después del abandono de la droga, dependiendo de la duración, la ubicación y la dosis originales de la exposición14-17, y el protocolo actual se ha utilizado para detectar la sensibilización hasta 10 meses después de siete días (30 mg/kg) de tratamiento con cocaína en ratones18. La prueba se puede realizar utilizando tecnologías de fotohaz o de seguimiento de video, en aparatos de diferentes tamaños y formas, lo que facilita su realización para muchos laboratorios. La robustez, simplicidad y persistencia de la sensibilización locomotora hacen que su evaluación sea una parte ideal del examen de los mecanismos básicos de los cambios duraderos en el comportamiento inducido por drogas.

Como se amplía en la discusión, una consideración importante al realizar el ensayo de sensibilización locomotora es si el fármaco se administra en el entorno doméstico o en la jaula de prueba. Para aprovechar la fuerte sensibilización que se produce cuando la administración del fármaco se produce fuera de la jaula doméstica, este protocolo emplea este método. Sin embargo, se ha observado que cuando los animales no están adecuadamente habituados a un nuevo entorno antes de la exposición a la droga, se produce un efecto techo inducido por la novedad en el día 1, que puede enmascarar parcial o totalmente la naturaleza progresiva de la sensibilización. Es probable que esto represente efectos sinérgicos de activación locomotora del fármaco junto con la novedad, y aunque los mecanismos subyacentes a tales efectos pueden ser interesantes, el método descrito está diseñado para reducir el papel de la novedad y permitir que los efectos del fármaco se midan de forma más independiente. Si bien se espera que este método sea útil en la evaluación de otros fármacos sensibilizadores locomotores, se ha evaluado principalmente su efectividad con cocaína en ratones C57BL/6.

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Protocolo

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Hospital McLean. NOTA: El siguiente protocolo describe un enfoque único al CPP y la sensibilización del aparato locomotor, muchos detalles de los cuales se diferencian de otros protocolos de pruebas exitosas (fase oscura por ejemplo, iluminación, frente a frente a la administración intermitente consecutiva, etc.). Los novatos pueden desear comenzar con estos protocolos, o simplemente utilizarlos como guías, la adaptación de las alteraciones de la literatura basada en la pregunta experimental (s) en cuestión. Se describen métodos automáticos de medición; sin embargo, es posible utilizar medios no automatizados para cada ensayo (es decir, grabación de vídeo, la mano de puntuación).

1. preferencia de lugar condicionado

  1. Equipo y habitaciones planteamiento:
    1. Manejar ratones experimental para 1-3 min cada día, durante al menos 3-5 días antes del ensayo.
      NOTA: Nunca manejado-ratones pueden encontrar retirada de la cámara de stressful, que puede interferir con o alterar acondicionado.
    2. Obtener cuatro o más aparatos de CPP de tres cámaras, preferentemente equipados con luz de haz para la recolección de datos automatizado 18. Asegúrese de que cada cámara tiene dos cámaras más grandes, problemas de vista y al tacto-distintos que se conectan a una cámara más pequeña y neutral a través de las puertas que se pueden subir / bajar para controlar el acceso. Tapas en cada cámara deben abrir para la inserción / extracción de los ratones y ser montado con luces pequeñas, controlables individualmente (regulables) (una por cámara).
      NOTA: diseños de cámara de CPP varían y se pueden adquirir en el comercio o construidos por los investigadores. Para el diseño "equilibrada", un esquema recomendado es una cámara más grande, con paredes blancas y suelos de rejilla de alambre y el otro con paredes negras y suelo de la barra. La cámara intermedia debe tener paredes grises y suelos gris sólido de plexiglás. Para propósitos de explicación, estas cámaras serán referidos como "blanco", "negro" y "medio".Las tapas deben ser claros plexiglás. configuraciones de compartimentos alternos (una o dos cámaras) son también posibles y discutido en otra parte (ver Discusión).
    3. Configuración de la sala, ya que será durante las pruebas: ajustar o desactivar las luces del techo para el ajuste más tenue y cierre la puerta. Use un medidor de luz dentro de cada cámara y ajustar las luces de la tapa de manera que las cámaras medias son ligeramente más brillante (15-20 lux) que las cámaras en blanco y negro (6-10 lux) con el fin de disuadir a los ratones de pasar el tiempo allí.
      NOTA: Si el tiempo medio de permanencia en el medio es tanto o más que en las cámaras de color negro o blanco, aumentar aún más el contraste de iluminación se describe en el paso 1.1.3. Como alternativa, utilizar el suelo menos atractivo para el medio. (Por ejemplo, ~ 220 agujeros de 0,5 cm de diámetro, de manera uniforme espaciados en 6 x 3,5 x ¼ "plexiglás), pero evitar que esta cámara aversivo. Piloto cualquier alteración para garantizar que la disminución en el tiempo medio no se deben a la disminución de exploraciones totales (cruces) .
    4. PROGRAMA recogida de datos automatizado ( "procedimiento", Figura 1A) o recoger manualmente los datos de acuerdo con los siguientes parámetros. ensayos configurado para comenzar en el primer corte de haz en ninguna de las cámaras acondicionado. Establecer sesiones de "prueba" para estar 20 minutos en longitud y registrar el tiempo en la manga y roturas en cada cámara. Establecer sesiones de "acondicionamiento" para ser 30 minutos de largo y (opcionalmente) para medir rompe el rayo en cada cámara. Ajuste todas las luces de la cámara para iluminar durante el juicio.
    5. Preparar el volumen total de la solución de cocaína requerida para el experimento en cuestión. Disolver HCl de cocaína en 0,9% NaCl (solución salina), basando la concentración final en un volumen de inyección de 0,1 ml / 10 g de peso corporal (por ejemplo, para una dosis de 5 mg / kg, la concentración de la solución es 0,5 mg / ml). mezcla de vórtice durante 30-45 segundos, filtro estéril (0,2 micras filtros de jeringa) y se almacena a temperatura ambiente.
  2. Pruebas:
    NOTA: La línea de tiempo general de CPP es PRE-TEST, acondicionamiento ya continuación, después de la prueba. La pre-prueba puede ser separado de acondicionamiento por 1-3 días; Sin embargo, el acondicionamiento y el día posterior a las pruebas deben llevarse a cabo en días consecutivos (Figura 2A). Este tiempo debe mantenerse el mismo para todas las cohortes en el mismo experimento.
    1. Prueba durante la fase de luz de los animales utilizando el mismo aparato para cada animal en todos los días.
    2. Cada día de ensayo (es decir, ensayos y días de acondicionamiento), mover los ratones a la antesala de comportamiento y permitir que se queden sin problemas en sus jaulas durante 1-1,5 horas antes de la prueba. Elija un lugar donde los ratones se pueden mover rápidamente de su jaula al aparato, con una interrupción mínima, cuando comience el juicio. Encienda todos los equipos de manera que cualquier ruido asociado con la prueba (por ejemplo, los ventiladores de los equipos) están presentes.
    3. Limpiar a fondo cada aparato (paredes interiores, pisos y bandejas) con asma leve, alcohol, glicol-éter o base de amoníaco toallitas desinfectantes antes y después de cada ratón (utilice el same tipo de limpiador durante todo el experimento). No os olvidéis de pisos inferiores.
    4. Comprobar que las luces de la sala se establecen apropiadamente (apagado o atenuadas) al comienzo de cada día.
    5. Proceder con la siguiente función de si se trata de una "prueba" o día de "acondicionamiento":
      1. En el juicio los días 1 y 6 (es decir, el pre y post-test), colocan las puertas inter-cámara en la posición abierta (Figura 2B).
      2. Cargar el programa informático "prueba" e introducir los ID de origen animal (Figura 1A), a continuación, emita el comando start (Figura 1B), en su caso.
      3. Suavemente menor cada ratón al de en medio de su aparato asignado, frente a la pared del fondo, y cerrar suavemente la tapa. Una vez que todas las cámaras se cargan, dejar la sala de pruebas y minimizar el ruido.
      4. Dejar los ratones dentro de cada aparato hasta que las pruebas para todos los ratones han cerrado / finalizado (Figura 1C). datos de los ensayos de exportación.
    6. Justo antes o después de la prueba previa, pesan los animales. Utilice estos valores para realizar los cálculos de dosis durante el acondicionamiento.
    7. Con el fin de prepararse para ensayos de condicionamiento, el cálculo de pre-test "preferencia" de cada ratón para las cámaras en blanco y negro por el tiempo de permanencia en cada uno de ellos desde el otro (es decir, "negro blanco menos" y "blanco, menos negro" restando; véase la figura 3, las columnas 9 y 10).
    8. Dado que los ratones con fuertes preferencias iniciales hacen difícil equilibrio, establecer un límite aceptable para las puntuaciones de preferencia (por ejemplo, <33% del tiempo total del ensayo) y excluir a los ratones que lo supere a partir de cálculos. Utilice un límite liberal (<66% del tiempo total del ensayo) para maximizar la inclusión cuando es probable que el desgaste después de completar la prueba (por ejemplo, debido a fuera de objetivo manipulaciones quirúrgicas).
      NOTA: Los ratones que superan el límite todavía se pueden probar, con un intento de mantener sus preferencias antes de la prueba equilibrada. Más tarde, tratones stos pueden ser excluidos del análisis, si es necesario, para equilibrar las puntuaciones antes de la prueba. Si sesgos antes de la prueba extremos (es decir,> 800 seg) afectan de manera desproporcionada a un grupo, considere la alteración de los ambientes de acondicionamiento y / o usando otros ensayos.
    9. Elija la cámara de negro o blanco como el espacio de la droga-apareamiento para cada ratón, mientras tanto la suma de las correspondientes puntuaciones de preferencia antes de la prueba dentro de cada grupo con las siguientes prioridades en mente:
      NOTA: Tenga cuidado de equilibrar las puntuaciones entre los grupos dentro de cada cohorte, así como a través de las cohortes anteriores.
      1. Realiza las sumas para todos los grupos como equivalentes como sea posible.
      2. Realiza las sumas tan cerca de cero como sea posible (es decir, elegir el lado preferido para algunos ratones y el lado no preferido para los demás). Si una suma cercana a cero es imposible para cualquier grupo dado, volver a ajustar todos los demás para asemejarse a la mejor calificación total para el grupo limitando, a favor del grupo ligeramente negativo sobre resumepositivo.
      3. En la medida de lo posible, mantener las asignaciones de negro frente al blanco y prefieren a los cámaras no preferidos para emparejamientos de drogas, incluso dentro de cada grupo.
      4. Como no siempre es posible cumplir los objetivos anteriores, corregir cualquier desviación de lo que se oponen consideraciones de equilibrio en las cohortes posteriores; Sin embargo, tratar de evitar la producción de cohortes con muy diferentes preferencias promedio antes de la prueba.
    10. En Acondicionado Días 2-5, colocar puertas inter-cámara en la posición cerrada (Figura 2C).
    11. Preparar las jeringas individuales con la cocaína (Días 2 y 4) o solución salina (días 3 y 5) la solución, tal como se describe en el paso 1.1.5 y en base a los pesos corporales medidos al pre-test.
      NOTA: La dosis debe ser elegido con respecto a las expectativas experimentales, las consideraciones mencionadas en la introducción, y los efectos potenciales de suelo y techo. A menudo es mejor para llevar a cabo experimentos independientes usando al menos dos dosis diferentes.
    12. Load "cID de animales onditioning "programa de ordenador y ENTER (Figura 1A), a continuación, emita el mandato inicial (figura 1B), en su caso.
    13. Pescuezo e inyectar cada ratón (ip), inmediatamente disminución de los mismos en la cámara de negro o blanco adecuado de su aparato asignado frente a la pared del fondo, a continuación, cierre suavemente la tapa. Una vez que todas las cámaras se cargan, dejar la sala de pruebas y minimizar el ruido.
    14. Eliminar los ratones de su cámara tan cerca de exactamente 30 min como sea posible (es decir, la primera ratones se retiran de sus cámaras, mientras que otros ratones son todavía acondicionado). Retirar los animales lo más silenciosamente posible, sin introducir ruido.
  3. Análisis estadístico:
    1. Elija un método de análisis. De cualquier momento reste gastado en el lado solución salina-emparejado durante el post-test del tiempo empleado en el lado de la cocaína-emparejado durante el post-test (cocaína - solución salina, seg) o utilizar el tiempo pasado en la cámara se combina con las drogas después de la pruebamenos el tiempo previo a la prueba de permanencia en la cámara se combina con las drogas.
      NOTA: si se utiliza el primer método, también gráficos de líneas trama de tiempo medio de permanencia en el centro, cámaras con solución salina y se combina con las drogas durante los pre y post-test para cada grupo. En comparación con el pre-test, post-test debe mostrar un mayor tiempo en el lado emparejado con las drogas y la disminución del tiempo de permanencia en el lado salina apareadas (véase la Figura 6, parte inferior y Discusión para la explicación).
    2. Dependiendo de la naturaleza y el número de grupos que se comparan, utilizar un t-test, de una o dos vías ANOVA, según el caso, posiblemente con análisis post-hoc, para analizar cualquiera de las puntuaciones de resta presentadas anteriormente.
      NOTA: Los resultados de preferencia de cocaína tienden a ser variable, y, además, pueden ser negativos (es decir, indican la aversión hacia el lado emparejado con la sustancia). Los ratones que muestran la aversión no deben ser eliminados (a menos que sean valores estadísticos atípicos), ya que este resultado es normal y probablemente importante para determinar las diferencias entre groups. Espera necesitar tamaños de muestra de 12 a 30 animales por grupo, dependiendo del tamaño del efecto del tratamiento.

2. Sensibilización Locomotor

  1. Equipo y habitaciones Set-Up
    1. Obtener una matriz PHOTOBEAM 4 x 8 (X x Y) (dimensiones exteriores 11.5 "x 20"). La construcción de una cámara de techo abierto de plexiglás negro (dimensiones interiores 22 1/6 "x 13 ¾" x 9 3/8 ") para albergar la matriz (Figura 4A).
    2. Preparar la sala de pruebas de manera que una luz roja (techo o pared) se puede utilizar durante la prueba.
    3. Preparar las sesiones del programa separados para ensayos de habituación y la inyección diaria.
      1. Ensayos Conjunto de habituación para estar entre 30-60 min ensayos y de inyección para estar entre 60 a 120 min (Figura 5B). La longitud recomendada para cada uno es de 60 min. Mantenga duración del ensayo consistente a través de múltiples cohortes dentro del mismo experimento.
      2. ensayos configurado para comenzar a recording sobre el primer corte de haz que se produce después de que la señal de inicio se ha iniciado (Figura 5B). Para el ensayo de inyección, ajuste la señal de arranque para que las cajas se pueden iniciar de forma individual (no al unísono), si es posible.
      3. Set rompe el rayo que deben registrarse en definidos por el usuario "contenedores", preferiblemente de 5 minutos cada uno (Figura 5B).
    4. Preparar el volumen total de la solución de cocaína requerida para el experimento en cuestión. Disolver HCl de cocaína en 0,9% NaCl (solución salina), basando la concentración final en un volumen de inyección de 0,1 ml / 10 g de peso corporal (por ejemplo, para una dosis de 5 mg / kg, la concentración de la solución es 0,5 mg / ml). mezcla de vórtice durante 30-45 segundos, filtro estéril (0,2 micras filtros de jeringa) y se almacena a temperatura ambiente.
  2. Pruebas
    NOTA: La fase inicial de la prueba tiene una duración de 10-11 días consecutivos. Los ratones reciben dos pruebas diarias: habituación (sin inyección) y la inyección. Administrar solución salina durante los tres primeros afnuestros días (véase la discusión de la importancia de la habituación solución salina), y la cocaína para los próximos siete utilizando la misma dosis (por ejemplo., 15 mg / kg / día).
    1. Cada día, se aclimate ratones en sus jaulas a la antesala de comportamiento durante 30 minutos a 1 hora.
    2. Preparar claras jaulas limpias vivienda estándar-ratón de tamaño de acrílico con una capa extremadamente delgada de material limpio (por ejemplo, astillas de pino), de manera que no photobeams oscuros, en su caso (Figura 4 C + D).
    3. Coloque jaulas contra el eje Y de la matriz PHOTOBEAM cerca de un extremo, de modo que cinco vigas están espaciados uniformemente a lo largo de su longitud. Vigas de eje X no se utilizan en esta prueba (Figura 4C y D).
    4. Tome a los ratones de su jaula, en orden aleatorio, pescuezo y pesarlos. Retire cada ratón desde el barco pesa por la base de su cola (con soporte) y el lugar directamente en su jaula locomotora asignada. Cubrir cada jaula con una tapa de filtro estándar superior.
    5. Preparar las jeringas individuales wITH solución salina o solución de cocaína, tal como se describe en el paso 2.1.7, basado en el peso corporal del día actual. Comience con una dosis de 15 ó 20 mg / kg, y considerar un segundo experimento utilizando una dosis más alta o más baja (véase la discusión de los factores relevantes).
    6. Una vez que las pruebas de habituación han terminado para todas las jaulas, cargue el programa de inyección.
    7. Uno a la vez, eliminar los ratones de su jaula de ensayo, pescuezo y dar su inyección (ip). Antes de devolver el ratón a su jaula de prueba, iniciar rápidamente la señal de inicio de la jaula (Figura 5C, abajo).
    8. Después de todos los ensayos de inyección han terminado, los ratones regresar a sus jaulas y su sala de la vivienda.
    9. Si se desea, permitir que los ratones a sufrir una serie de tiempos de espera y los retos de drogas, tales como las siguientes: misma dosis que, un medio de la dosis original, de doble dosis, a continuación, solución salina, lo que permite siete días antes de la exposición misma dosis y seis y cincuenta y siete días antes de cada desafío adicional. Sea cual sea la elección de los retos, mantenin periodos de abstinencia similares a través de las cohortes dentro de un experimento.
      NOTA: Si la dosis inicial es alta (por ejemplo, 30 mg / kg o más), el doble de la dosis debe ser omitido o reemplazado con una dosis más baja. El reto solución salina revela cualquier activación locomotora condicionado por el medio ambiente cocaína-emparejado solo, y en el proceso, la cantidad de locomoción sensibilizado que es dependientes de la cocaína (véase la discusión).
  3. Análisis estadístico
    1. Elige la parte (s) de cada ensayo que se utilizó para el análisis. La mayoría de la locomoción inducida por cocaína en roedores se produce dentro de la primera inyección de drogas ~ 15-30 min después. En función de las variables que intervienen, considere el análisis de la locomoción acumulativa para múltiples ventanas de tiempo (por ejemplo, los primeros 15, 30, 60 y / o 120 min) o centrarse en segmentos independientes de la prueba.
    2. Utilizando el marco de tiempo elegido, sumar los descansos de haz para cada animal por día para los ensayos de habituación y de inyección por separado y luego unaverage las sumas para cada grupo. Parcela medias y los errores estándar de la media (SEM) en un gráfico lineal sobre todos los días. Como tratamientos pueden alterar la forma en ratones responden a la droga temprano y / o tarde en cada ensayo diario, también trazar rompe promedio de haz grupo por bin 5-min en el curso de cada ensayo diario.
      NOTA: Trazado de los promedios diarios de actividad para los ensayos de habituación y de inyección (por ejemplo, en primer lugar 15 min) hace que parezca artificialmente que la locomoción es humedecido por la inyección de solución salina, pero recuerda que la actividad tiene (lo más probable) se redujo a este nivel a finales de habituación cada día .
    3. Analizar salinos y tratamiento de la drogadicción días consecutivos por separado utilizando medidas repetidas (RM) ANOVAs que tiene el factor intra-sujetos de día / hora y que incluye cualquier factor inter-sujetos en el diseño, según el caso. Use un t-test o ANOVA de un factor para investigar las diferencias de grupo en el Día 1 de la cocaína (exposición aguda), y un ANOVA multivariado para los desafíos. Cuando sea apropiado, siga significance con pruebas post-hoc o univariante ANOVA.

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Resultados

Los resultados representativos del ensayo de CPP se muestran en la Figura 6 utilizando ratones de tipo salvaje C57BL / 6N a aproximadamente nueve semanas de edad. El diseño del estudio fue un factorial mixto 2 x 3, con una variable dentro de los sujetos de prueba (pre y post) y una inter-sujetos variables de tratamiento (solución salina y la cocaína 5 y 10 mg / kg). Una RM ANOVA mostró una interacción significativa entre la prueba y tratamiento (F 2,20 = 3,68, p <0,05), lo que fue interpre...

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Discusión

Este protocolo demuestra métodos para preferencia de lugar condicionado y sensibilización locomotor, cada uno de los cuales puede ser utilizado por el laboratorio de promedio para evaluar los aspectos de la plasticidad de comportamiento inducido por fármacos. Como con la mayoría de las pruebas de comportamiento, hay consideraciones dignas adicionales más allá del protocolo básico. En primer lugar, cada una de estas técnicas puede ser concebido como teniendo dos fases, la inducción y la expresión. "Inducción" c...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Karen Dietz y Shari Birnbaum para la entrada anterior sobre las consideraciones de diseño de comportamiento y Lauren Peca para obtener ayuda con las pruebas de comportamiento. Los autores también reconocen el generoso apoyo de la Fundación Simons (Iniciativa de Investigación del Autismo Fundación Simons concesión de CAQ), el NIDA (DA008277, DA027664, y DA030590 a CWC, F32DA027265 a LNS y F32DA036319 a RDP), la Fundación de Investigación FRAXA y Eleanor y Miles Programa de becas de la orilla (apoyo de becas para LNS), y el Programa de becas John Kaneb (apoyo de becas para MT).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Clorhidrato de cocaína USPMallinckrodt Pharmaceuticals0406-1520La compra y el uso (sustancia controlada de la Lista II) con fines de investigación requieren cumplimiento y licencia de acuerdo con las leyes estatales y federales.
Preferencia de lugar condicionada,  Aparato de tres compartimentos con puertas manuales y luces para MouseMed-Associates Inc.MED-CPP-MS & MED-CPP-3013Nuestro laboratorio ha utilizado estas cajas; sin embargo, hay muchas cajas alternativas disponibles y aceptables.
PAS-Home Cage Activity Monitoring Photobeam Arrays SanDiego Instruments2325-0223 & 7500-0221Nuestro laboratorio alberga estos arrays dentro de cámaras hechas a medida, como se describe en el texto. Hay alternativas disponibles.
Toallitas desdesinfectantes desechables Sani-ClothPDI13872

Referencias

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