Protocolo para tridimensional confocal morfométrico Análisis de astrocitos

Summary

Los astrocitos en el SNC cambian sus propiedades funcionales y estructurales en respuesta a estímulos dañinos. Este informe presenta un protocolo para la evaluación de la morfología tridimensional de los astrocitos en condiciones de enfermedad o después de intervenciones terapéuticas.

Abstract

Como las células gliales en el cerebro, los astrocitos tienen diversos papeles funcionales en el sistema nervioso central. En presencia de estímulos nocivos, los astrocitos modifican sus propiedades funcionales y estructurales, una condición llamada astrogliosis reactiva. Aquí, se presenta un protocolo para la evaluación de las propiedades morfológicas de los astrocitos. Este protocolo incluye la cuantificación de 12 parámetros diferentes es decir, la superficie y el volumen del tejido cubierto por un astrocito (territorio de astrocitos), todo el astrocito incluyendo sucursales, cuerpo celular y núcleo, así como la longitud total y el número de sucursales, la intensidad de la fluorescencia inmunorreactividad de los anticuerpos utilizados para la detección de astrocitos, y la densidad de astrocitos (número / 1000 m ^2). Para ello se crearon tres dimensiones (3D) imágenes microscópicas confocal, y la imagen 3D software de análisis, como se utilizó Volocity 6.3 para mediciones. Tejido cerebral de rata expuestos a beta amiloide _1-40 1-40) con o sin una intervención terapéutica para presentar el método. Este protocolo también se puede utilizar para el análisis morfométrico 3D de otras células a partir de ya sea in vivo o in vitro condiciones.

Introduction

En el sistema nervioso central saludable (CNS), los astrocitos desempeñan un papel importante en la regulación del flujo sanguíneo, el metabolismo energético, la función sináptica y la plasticidad, y el ion extracelular y neurotransmisor homeostasis ^{a 1-3.} Además, los astrocitos responden a diferentes estímulos nocivos y condiciones anormales, tales como trauma, infección, isquemia o la neurodegeneración a través de astrogliosis reactiva que se caracteriza por la hipertrofia, proliferación y remodelación funcional de astrocitos ^4,5.

Astrogliosis reactiva puede diseñar la respuesta inflamatoria y proceso de reparación....

Protocol

Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con las políticas establecidas en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (NIH) aprobadas por el Comité de Ética de Irán Universidad de Ciencias Médicas (Teherán, Irán).

1. Los animales, la cirugía y de muestras Preparaciones

NOTA: Prepare el tejido cerebral para el análisis microscópico confocal 3D.

1. Divida a los animales al azar en dos grupos: Aß _1-40: inyección (n = 8), y Aß _1-40: inyección con el tratamiento genisteína (n = 8); administrar la genisteína (10 mg / kg diluido en un vehículo tal como aceite de ricino polie....

Results

Esta sección presenta algunos ejemplos de las observaciones cualitativas y cuantitativas producidos por análisis morfométrico 3D. Para los resultados completos de los 12 parámetros mencionados anteriormente, por favor, consulte nuestra publicación anterior ^10.

Observaciones cualitativas

Los astrocitos mostraron ramas delgadas o gruesas que eran por lo general mucho tiempo en Aß _1-40 ratas inyectadas (Figura 1). Se observaron.......

Discussion

En el protocolo actual, hemos empleado morfometría confocal 3D para evaluar 12 parámetros diferentes que se asociaron con la morfología de astrocitos. Para este fin, el tejido del hipocampo de ratas con Aß _{1-40 -} se utilizaron astrogliosis inducida, con o sin pretratamiento genisteína como un agente anti-inflamatorio. Mediante el uso de imágenes en 3D y software morfométricos, hemos sido capaces de mostrar el efecto de la genisteína en astrogliosis es decir, la morfología de los astrocitos.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beta amiloide 1-40	Sigma Aldrich	79793	Mantener en -70 ° C
Genistein	Sigma Aldrich	446-72-0	mantener en -20 °
Anticuerpos policoloniales C de conejo contra la proteína ácida fibrilar glial	DAKO	Z0334
Anticuerpos IgG anti-conejo conjugados con fosfato alcalino	DAKO
	K0640
Tampón de sustrato rojo permanente líquido	DAKO	K0640
Cremophor EL	Sigma Aldrich	27963	Aceite de ricino polietoxilado - Paso 1.1
LSM 700 Microscopía de escaneo láser confocal	Carl Zeiss
Volocity 6.3	Perkin Elmer Inc.,
Análisis de imágenes 2000	Tekno Aparato
estresutáxico	óptico Stoelting
5	Software de almohadilla gráfica Inc.