Análisis de Yersinia enterocolitica Efector translocación en las células huésped Usando beta-lactamasa Efector fusiones

Resumen

La translocación del efector a las células huésped a través de un sistema de secreción de tipo III es una estrategia de virulencia común entre las bacterias gramnegativas. Se aplicó un ensayo basado en fusión de efectores betalactamasas para el análisis cuantitativo de la translocación. En las células infectadas por Yersinia, la conversión de un indicador FRET por la betalactamasa se controla mediante microscopía de barrido láser.

Resumen

Muchas bacterias gram-negativas, incluyendo patógenos Yersinia spp. Emplean tipo III sistemas de secreción de trasladar proteínas efectoras en células diana eucariotas. Dentro de la célula huésped proteínas efectoras manipular las funciones celulares en beneficio de las bacterias. Para comprender mejor el control de la secreción de tipo III durante la interacción célula huésped, sensible y ensayos precisos para medir la translocación son obligatorios. Se describen la aplicación de un ensayo basado en la fusión de un fragmento de proteína efectora Yersinia enterocolitica (proteína externa Yersinia; YopE). Con TEM-1 beta-lactamasa para el análisis cuantitativo de la translocación El ensayo se basa en la escisión de una célula permeante FRET de colorante (CCF4 / AM) translocado por fusión beta-lactamasa. Después de la escisión del núcleo de cefalosporina de CCF4 por la beta-lactamasa, FRET de cumarina a la fluoresceína se interrumpe y la excitación de la fracción de cumarina conduce a la emisión de fluorescencia azul.Diferentes aplicaciones de este método se han descrito en la literatura destacando su versatilidad. El método permite el análisis de la translocación in vitro y también in vivo en, por ejemplo, en un modelo de ratón. La detección de las señales de fluorescencia se puede realizar utilizando lectores de placas, análisis FACS o microscopía de fluorescencia. En la configuración descrita aquí, en la translocación vitro de fusiones efectoras en células HeLa por diferentes mutantes Yersinia es supervisado por microscopía de barrido láser. Grabación de la conversión intracelular de la reportero FRET por el efector de fusión beta-lactamasa en tiempo real proporciona resultados cuantitativos robustos. Aquí mostramos los datos de ejemplares, lo que demuestra una mayor translocación por una Y. enterocolitica YopE mutante en comparación con la cepa de tipo salvaje.

Introducción

Tipo III sistemas de secreción son máquinas especializadas proteína de exportación utilizados por diferentes géneros de bacterias gram-negativas para entregar directamente proteínas efectoras bacterias codificados en las células diana eucariotas. Mientras que la maquinaria de secreción en sí está altamente conservada, conjuntos especializados de proteínas efectoras han evolucionado entre las diferentes especies bacterianas para manipular vías de señalización celular y facilitar estrategias de virulencia bacterianas específicas ^1. En caso de Yersinia, hasta siete proteínas efectoras, llamados (proteínas externas de Yersinia) Yops, se translocan al entrar en contacto la célula huésped y actuar conjuntamente para subvertir las respuestas de células inmunes tales como la fagocitosis y producción de citoquinas, es decir, para permitir la supervivencia extracelular de las bacterias ^2-4. El proceso de translocación está estrechamente controlada en las diferentes etapas ^5. Se establece que la activación primaria de la T3SS se desencadena por su contacto con el ce objetivoll ^6. Sin embargo, el mecanismo exacto de esta iniciación aún no se ha dilucidado. En Yersinia un segundo nivel de la llamada puesta a punto de la translocación se consigue altura o baja regulación de la actividad de las proteínas celulares Rho GTP vinculante Rac1 o RhoA. La activación de Rac1 por ejemplo invasina o citotóxico del factor necrosante Y (CNF-Y) conduce a una mayor translocación ^7-9, mientras que el GAP (proteína activadora de GTPasa) Función de translocado YopE abajo-regula la actividad de Rac1 y en consecuencia disminuye la translocación por un tipo de retroalimentación negativa de mecanismo de ^10,11.

Métodos válidos y precisos son el requisito previo para investigar cómo se regula la translocación durante la interacción célula huésped Yersinia. Muchos sistemas diferentes se han utilizado para este propósito, cada uno con ventajas y desventajas específicas. Algunos enfoques se basan en la lisis de las células infectadas pero no bacterias por diferentes detergentes seguido por análisis de transferencia Western. The inconveniente común de estos métodos es que la lisis bacteriana menor pero inevitable potencialmente contamina el lisado celular con proteínas efectoras bacterias asociadas. Sin embargo, se propusieron tratamiento de células con proteinasa K para degradar las proteínas efectoras extracelulares y uso posterior de digitonina para la lisis selectiva de las células eucariotas para minimizar este problema ^12. Es importante destacar que estos ensayos dependen crucialmente anticuerpos anti-efectoras de alta calidad, que en su mayoría no están disponibles comercialmente. Los intentos de utilizar fusiones traduccionales de las proteínas efectoras y las proteínas fluorescentes como GFP para controlar la translocación no tuvieron éxito debido probablemente a la estructura terciaria globular de las proteínas fluorescentes y la incapacidad del aparato de secreción a desplegarse antes de la secreción de ^13. Sin embargo, varias etiquetas diferentes reportero como el cya (calmodulina dependiente adenilato ciclasa) dominio de la toxina Bordetella pertussis cyclolysin ^{14 o} Flashetiqueta se utiliza con éxito para analizar la translocación. En el primer ensayo se usa la actividad enzimática de cya para amplificar la señal de la proteína de fusión intracelular, mientras que la etiqueta Flash, un tiempo muy corto de tetracisteína (4Cys) tag motivo, permite el etiquetado con el flash colorante biarsénico sin perturbar el proceso de la secreción ^15.

El enfoque aplicado aquí se informó por primera vez por Charpentier et al., Y se basa en la conversión intracelular de la transferencia de energía de resonancia Förster (FRET) colorante CCF4 por translocados efector TEM-1 beta-lactamasa fusiones ¹⁶ (Figura 1A). CCF4 / AM es un compuesto de células permeante en el que un derivado de cumarina (donante) y un resto de fluoresceína (aceptor) están unidas por un núcleo de cefalosporina. A la entrada pasiva en la célula eucariota, la no fluorescente esterificado compuesto CCF4 / AM es procesada por esterasas celulares a la CCF4 cargado y fluorescente y por lo tanto atrapadodentro de la célula. La excitación de la fracción de cumarina a 405 nm en los resultados de FRET a la fracción de fluoresceína, que emite una señal de fluorescencia verde a 530 nm. Después de la escisión del núcleo de cefalosporina por la FRET beta-lactamasa se interrumpe y la excitación de la fracción de cumarina conduce a la emisión de fluorescencia azul at460 nm. Diferentes aplicaciones de este método se han descrito en la literatura destacando su versatilidad. El método permite el análisis de la translocación in vitro y también in vivo en, por ejemplo, se utilizó la técnica en un modelo de infección de ratón para identificar las poblaciones de leucocitos específicos para la translocación in vivo ^{17-19 de.} Lectura de las señales puede llevarse a cabo utilizando lectores de placas, análisis FACS o microscopía de fluorescencia. Es de destacar que el método también ofrece la posibilidad de controlar la translocación en tiempo real mediante microscopía de células vivas durante el proceso de infección ^20,21. Aquí microscopía de fluorescencia de escaneo láser se aplicó durante readout de señales de fluorescencia, ya que proporciona mayor sensibilidad y precisión. En particular, la capacidad para ajustar la ventana de emisión con una precisión nanométrica en combinación con detectores de alta sensibilidad optimizada facilita la detección de fluorescencia y minimizar la diafonía. Además esta configuración microscopía puede ser adaptado para la monitorización en tiempo real de translocación y potencialmente permite para el análisis simultáneo de interacción huésped-patógeno a nivel celular.

En este estudio, las tasas de translocación de una Y. Se analizaron ejemplarmente enterocolitica cepa de tipo salvaje y un mutante de deleción YopE exhibiendo un fenotipo hypertranslocator ^10,11.

Protocolo

1. pico de emisión y Cross-talk Determinación (véase también la Figura 2)

1. Con el fin de determinar los picos de emisión y la cantidad de cross-talk entre el donante (cumarina derivado V450) y el aceptor (fluoresceína) colorantes, realizar análisis espectrales de células marcadas con ambos fluoróforos individuales en 405 nm de excitación.
2. Determinar un ancho de banda 10 nm dentro del pico de cada colorante que se utilizará para los canales de donante y aceptor (desde 455 hasta 465 nm y aquí 525-535 nm). Trazar la intensidad normalizada sobre la longitud de onda y calcular el porcentaje medio de diafonía del colorante donante en el canal aceptor y viceversa (Figura 2).

2. Preparación de Y. enterocolitica cepas de células Infección Cultura

1. Utilice las siguientes cepas: WA-314-PMK óvulos (WA-314 transformada con los plásmidos PMK-bla ^{17 y} PMK-ova ^17, respectivamente) y WA-314ΔYopE PMK-bla (WA-314ΔYopE transformadas con el plásmido PMK-bla ¹⁷⁾
2. Al menos dos días antes de la infección por Y. racha enterocolitica cepas WA-314 PMK-óvulos, WA-314 PMK-bla y WA-314ΔE PMK Bla-de crio existencias en placas de agar LB que contenían los antibióticos necesarios (kanamicina para WA-314 PMK-bla y WA-314 PMK-ova ; kanamicina y tetraciclina para WA-314ΔE PMK-bla) y crecer O / N a 27 ° C. Posteriormente mantener las placas durante hasta una semana a 4 ° C.
3. Un día antes de la infección inocular 3 ml de medio LB que contienen los antibióticos necesarios con una colonia de las cepas respectivas e incubar O / N a 27 ° C en un agitador a 180 rpm.
4. En el día de la infección inocular 2 ml del cultivo O / N en 40 ml de medio LB fresco sin antibióticos y se incuba durante 90 min a 37 ° C en un agitador a 180 rpm para inducir la expresión del sistema de secreción de tipo III.
5. Transfiera las culturas en un tubo adecuado y mantener las culturas en hielo oa 4 ° Cde ahora en adelante. Centrifugar los cultivos durante 10 minutos a 5000 xg y 4 ° C.
6. Resuspender el sedimento bacteriano en 2-3 ml de PBS helado. Diluir la suspensión bacteriana a una concentración de 8 x 10 ⁸ ufc / ml mediante el uso de un espectrofotómetro. Determinar la densidad óptica correspondiente individualmente. Mantenga esta suspensión en hielo hasta que la infección de las células HeLa.

3. Las células HeLa Chapado

1. Un día antes de semilla de infección de 1,5 x 10 ⁴ células HeLa en 200 l DMEM que contenía 10% de suero inactivado por calor fetal de ternera (FCS) en pocillos de una placa de 96 pocillos y cultivar en _un incubador de CO2 al 5% a 37 ° C. Semillas tres pozos para cada cepa (tres tiempos de incubación diferentes).

4. Infección de células HeLa y cargar con CCF4

1. Infectar las células HeLa mediante la adición de 3,5 l de la suspensión bacteriana a medio y mezclar pipeteando suavemente el medio dos veces. Permitir que las bacterias se sedimentan ena las células a una MOI (fracción de infección) de alrededor de 100 bacterias por célula. Para un curso de tiempo de inicio infecciones a -90 min, -60 min y -30 min y se incuba a 37 ° C en _un incubador de CO2 al 5% hasta 0 min para lograr un punto final común.
2. Cuando se ha completado la incubación, aspirar cuidadosamente el medio sin la eliminación de las células HeLa y añadir 50 l de PBS que contenía 20 mg / ml de cloranfenicol para detener la expresión de efectores y probenecid 2,5 mM para reducir la exportación de CCF4.
3. En este punto, la transferencia de la placa de 96 pocillos en la platina del microscopio y definir los lugares adecuados para su posterior análisis en cada pocillo. Termine este paso dentro de 10 minutos (para los detalles de la adquisición de ver sección 5.1).
4. Por pocillo, añadir 70 l de solución de CCF4 / AM de carga (solución de 0,24 l A, 1,2 l solución B, 18,56 l solución C (solución A, B, y C, siempre dentro de kit / AM carga CCF4) y 50 l de PBS (que contienen 20 g / ml de cloranfenicol y probenecid 2,5 mM) usando un multi pipette e incubar durante 5 min a TA. A partir de ahora el trabajo sin interrupciones.
5. Aspirar la solución de carga y añadir 100 l de PBS que contenía 20 mg / ml de cloranfenicol y probenecid 2,5 mM usando un multi pipeta. A continuación, traslado rápido de la placa de 96 pocillos en la platina del microscopio y comenzar la adquisición dentro de los 10 min de la aspiración de la solución de carga.

5. barrido láser microscopía y análisis de datos

1. Adquisición de imágen
   1. Establecer las condiciones de formación de imágenes de una manera de maximizar el número total de fotones y minimizar fototoxicidad, photobleaching y cross-excitación.
      1. En un moderno microscopio láser confocal de barrido, utilice un alto objetivo de inmersión apertura numérica 20X, abrir el agujero de alfiler del detector de 2,5 unidades Airy (es decir, seccionamiento óptico gran angular), elija de alta sensibilidad GaAsP Detectores con donante y aceptor canales simultáneamente activas, profundidad de 8 bits , ~ 750 nm tamaño de píxel, 3 veces promediado marco y ExcitE con 10% de un láser de diodo de 405 nm.
      2. Para garantizar la correcta cuantificación establecer la ganancia del detector de ambos canales en el mismo valor y evitar los píxeles saturados.
         Nota: En este caso, las ganancias se establecen en 150%.
   2. Asegúrese de inmersión continua por medio de difusión de la inmersión hasta el fondo de los pozos, por ejemplo, con una jeringa de 1 ml, y evitar la captura de burbujas de aire.
   3. Activar la luz transmitida y encontrar un campo representante de vista en todos los pozos. Utilice una etapa automática calibrada correctamente y marcar la posición en el software.
   4. Después de la eliminación de la placa para la tinción (ver sección 4.3), vuelva a insertar la placa y añadir un peso en la parte superior para evitar la deriva focal. Revise las posiciones guardadas con el modo de escaneo láser y ajustar el enfoque y la posición lateral correctamente.
   5. Ajuste el lapso de tiempo de 2 minutos, la duración de 2 horas y comenzar la adquisición.
2. Cuantificación de imagen (ejemplos se dan para Bitplane Softwson tales como Imaris)
   1. Importe el conjunto de datos en un software que permite a los cálculos aritméticos de matrices de píxeles. Para ello, arrastrar y soltar el archivo de origen que contiene tanto el donante como el canal aceptor en el icono del software.
   2. Reste el fondo en ambos canales usando el mismo desplazamiento. Para ello, haga clic en Menú y luego haga clic en Imagen> Tratamiento> Base Resta. Seleccione cada canal e introduzca el valor basal.
   3. Corregir el sangrado a través del canal de donante (Ch1) en el canal aceptor (CH2) con el factor de corrección f pre-determinado (véase 1.1), la creación de un nuevo canal:
      Ch2 '= CH2 - Ch1 * f
      NOTA: Una purga a través del aceptor en el canal de donante no fue detectable por encima del nivel de ruido.
      1. Haga clic en Menú> Procesamiento de Imágenes> Canal Aritmética y entrar abs (CH2- (ch1 * 0,33)). Posteriormente eliminar Canal 2 haciendo clic en Menú> Editar> Borrar Canales. Asegúrese de que elpurga a través del canal aceptor corregida queda como nuevo canal 2. Opcional: Cambie el canal de color del gris al color original, vaya a Menú> Propiedades Editar> Imagen. Seleccione el canal 4> asignada color> Color Base y cambiarlo a, por ejemplo, verde.
   4. Crear un nuevo canal con la siguiente operación para determinar el coeficiente relativo FRET:
      Ch3 = Ch2 '/ (Ch1 Ch2 +')
      1. Vaya a Menú> Procesamiento de Imágenes> Canal Aritmética y entrar ch2 ./ (CH1 + CH2)
   5. Para la visualización correcta del canal de FRET en una imagen de 8 bits, crear un cuarto canal:
      Ch4 = 255 * Ch3
      1. Vaya a Menú> Procesamiento de Imágenes> Canal Aritmética y escriba 255 * ch3. Cambie el color de canal por ir a Menú> Propiedades Editar> Imagen. Seleccione el canal 4> asignada color> Color Cuadro Archivo> Jet.
   6. Aplicar un filtro de mediana de 3x3 a los canales CH3 y CH4 that reducirá el ruido en las imágenes. Para ello, haga clic a Menú> Procesamiento de Imágenes> Suavizar> La mediana de filtro. Seleccione ambos canales y aplicar un tamaño de filtro "3x3x1".
   7. Para la cuantificación de señales celulares, detectar las células de CH4 configurando adecuadamente el desplazamiento y filtrar las estructuras por tamaño para excluir estructuras demasiado pequeñas.
      1. Seleccione el Surpass Ver y haga clic en el icono de "Añadir nuevas superficies". Definir los parámetros del algoritmo de detección en la ventana de la superficie. Para un procesamiento más rápido, activar el dos casillas de verificación "Segmento solamente una zona de interés" y "toda imagen del proceso, finalmente". Definir la región de interés mediante la edición de sus dimensiones.
      2. Seleccione el canal 4 como canal de origen y establecer el umbral Umbral> Sustracción de fondo (Contraste Local) y ajuste de diámetro a 10 micras. Ajuste el umbral de intensidad mínima manualmente a 0 y el umbral máximo a la intensificación máximadad. Filtre las estructuras por área y establecer el valor mínimo a, por ejemplo, 187 μm². Termine la detección superficie.
   8. Extraer los valores medios de intensidad de la fluorescencia del donante (Ch1) y el coeficiente de FRET relativa (CH3) y sus desviaciones estándar en la entidad celular. Para ello, vaya a las propiedades de la superficie. Cambiar el aspecto de las estructuras mediante la selección de superficies Estilo / Calidad> Superficie. Seleccione todas las estructuras haciendo clic en la ficha filtros. Unificar las estructuras detectadas por ir al proceso de selección> Unify. Exportar las estadísticas de superficie a MS Excel haciendo clic en la pestaña de estadísticas> Exportar Estadísticas de archivo.
   9. Trazar estos valores a través del tiempo. Identificar el intervalo de 10 min de máxima pendiente del incremento de fluorescencia del canal de donantes para cada condición como un parámetro razonable para representar la cantidad de efector translocado. Calcular la pendiente m = Δ como la intensidad de fluorescencia del donante / tiempo Δ (min).

Resultados

Para demostrar la capacidad del método descrito para analizar cuantitativamente efector translocación en las células diana, se estudiaron dos cepas de Yersinia con diferentes cinéticas de translocación: Y. enterocolitica cepa de tipo salvaje WA-314 (serogrupo O8, que alberga el plásmido de virulencia pYVO8 ²²⁾ y su derivado WA-314ΔYopE (WA-314 albergar pYVO8ΔYopE ^23). Trabajos anteriores mostraron que Y. mutantes que carecen enterocolitica exhibición YopE funcion...

Discusión

Estamos aquí, aplicado con éxito un ensayo basado TEM-1 reportero beta-lactamasa para el análisis cuantitativo de la translocación efector por Y. enterocolitica. Muchas variaciones diferentes de esta técnica sensible, específico y relativamente sencillo han sido descritos en la literatura. En este estudio de microscopía de barrido láser se llevó a cabo para la detección más sensible y precisa de las señales de fluorescencia. Específicamente, la corrección para la diafonía entre el donante y aceptor de ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
LB-Agar	Roth	X969.2
LB-Medio	Roth	X968.2
Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato	Sigma-Aldrich	D8662-500ML
Placa de 96 pocillos (negro, fondo transparente)	Greiner Bio One	655087
DMEM, alto contenido de glucosa, suplemento GlutaMAX, piruvato	Gibco/Life Technologies	31966-047
Probenecid	Sigma-Aldrich	P8761-25G
LiveBLAzer FRET-B/G Kit de carga con CCF4-AM	Life Technologies	K1095
Lectina de Triticum vulgaris (trigo) FITC conjugado	Sigma-Aldrich	L4895	Se utiliza para la determinación de emisiones máximas y diafonía
V450 Rat anti-Mouse CD8a	BD Bioscience	560469	Se utiliza para la determinación de emisiones máximas y diafonía
Aceite de inmersión Immersol W	Zeiss	444969-0000-000 Índice de	refracción = 1.3339 @ 23 °
Microscopio de barrido láser confocal C TCS SP5 II	Leica microsystems		2x Detectores GaAsP-Hybrid, espectrómetro de 4 canales, divisor de haz óptico acusto, platina XY motorizada, orificio ajustable, objetivo 20X HC PL APO CS IMM/CORR, 405  láser de diodo nm 50  mW
Imaris 7.6 software	Bitplane		Plugins incluidos ImarisXT y MeasurementPro
MatLab compilador runtime	MathWorks
Prism 5	GraphPad