Artículo de método

Ensayos pronta entrada virales para la identificación y evaluación de compuestos antivirales

31.1K vistas

⸱

DOI:

10.3791/53124

⸱

29 de octubre de 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chinese Medicine, Taipei Medical University Hospital, 2Department of Obstetrics and Gynecology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 3Department of Microbiology and Immunology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 4Division of Hematology and Oncology, Department of Internal Medicine, Taipei Medical University Hospital, 5Department of Internal Medicine, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 6Graduate Institute of Medical Sciences, College of Medicine, Taipei Medical University

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo que examina pasos específicos de la entrada viral para identificar y evaluar nuevos agentes antivirales.

Resumen

Los sistemas basados en células son útiles para descubrir agentes antivirales. La disección del ciclo de vida viral, particularmente las primeras etapas de entrada, permite un enfoque mecanicista para identificar y evaluar los agentes antivirales que se dirigen a pasos específicos de la entrada viral. En este informe, se describen los métodos para examinar la inactivación viral, la adhesión viral y la entrada/fusión viral como ensayos antivirales para tales fines, utilizando el virus de la hepatitis C como modelo. Estos ensayos deberían ser útiles para descubrir nuevos antagonistas/inhibidores de la entrada viral temprana y ayudar a ampliar el alcance de los agentes antivirales candidatos para el desarrollo posterior de fármacos.

Introducción

Las infecciones virales son una amenaza constante para la salud pública y una causa importante de enfermedades epidémicas, morbilidad y muertes en todo el mundo. Los modos específicos de control contra las infecciones virales incluyen el desarrollo de vacunas y terapias antivirales. Si bien los esfuerzos de vacunación han demostrado ser exitosos en la inmunización contra varios virus, muchos patógenos virales permanecen sin una vacuna protectora, incluidos el virus del dengue (DENV), el citomegalovirus humano (HCMV), el virus de la hepatitis C (VHC), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y el virus respiratorio sincitial (VRS)1-5. Los antivirales, por otro lado, juegan un papel importante para el manejo de estas infecciones virales cuando las vacunas profilácticas no están disponibles. Sin embargo, hasta la fecha, solo se dispone de unos pocos medicamentos antivirales autorizados y rentables en comparación con la cantidad de patógenos virales que amenazan la salud pública. Y lo que es más importante, debido al aumento de los viajes mundiales y a la rápida urbanización, la situación se ve agravada por los riesgos de brotes epidémicos derivados de infecciones víricas emergentes o reemergentes que se están introduciendo en zonas no indígenas6. Los brotes recientes causados por el virus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS), los virus de la influenza (H1N1, H5N1, H3N2 y H7N9), el DENV, el virus del Nilo Occidental (VNO), el virus del sarampión (MV), el virus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS) y el virus del Ébola6-12 son algunos de los ejemplos que reflejan la necesidad de desarrollar antivirales cuando la inmunización y/o los tratamientos no están disponibles. Además, siempre existe el riesgo potencial de generar infecciones resistentes a los medicamentos con los antivirales utilizados actualmente. Por lo tanto, el desarrollo continuo y la expansión del alcance de los antivirales para estas infecciones virales emergentes o reemergentes son necesarios para proporcionar mejores estrategias de manejo y salvaguardar la salud pública.

La mayoría de las terapias antivirales consisten en antivirales de acción directa (AAD) que se dirigen a una proteína o cofactor viral específico que media pasos importantes en el ciclo de vida viral. Por ejemplo, el análogo de nucleósido Aciclovir inhibe la ADN polimerasa del herpesvirus, los inhibidores de la proteasa Boceprevir y Telaprevir antagonizan el VHC NS3, y el Oseltamivir y el Zanamivir son inhibidores de la neuraminidasa que bloquean la liberación de partículas del virus de la gripe de las células infectadas13-15. Sin embargo, hay muy pocos inhibidores de la entrada viral autorizados, como la enfuvirtida, que se dirige a la gp41 del VIH para prevenir la fusión, y el Maraviroc, que bloquea el correceptor CCR5 del VIH, evitando así la entrada viral16. La exploración de nuevos antagonistas/inhibidores de la entrada viral podría ayudar a proporcionar terapias adicionales para uso profiláctico o terapéutico, como en combinación con otros antivirales con un mecanismo de acción diferente para controlar mejor las infecciones virales17-19.

La identificación de antivirales puede implicar un diseño de fármacos guiado por la estructura y una estrategia basada en el cribado de fármacos candidatos. Los métodos para evaluar la actividad antiviral de los agentes de prueba incluyen ensayos bioquímicos de la actividad enzimática y evaluación mediante sistemas basados en células20-23. En los sistemas basados en células, el ciclo de vida viral se puede diseccionar en distintas etapas de infección, como eventos de entrada (unión, fusión, desrecubrimiento), la fase de replicación (replicación del genoma viral y traducción de proteínas) y salida del virión (ensamblaje, maduración y liberación). Dado que los ensayos se pueden adaptar para investigar cada etapa específica utilizando diversas herramientas y métodos, este enfoque permite la identificación/examen de posibles antivirales candidatos con un mecanismo de acción específico dirigido a la etapa distinta analizada. Por ejemplo, para analizar el efecto del fármaco específicamente en las partículas libres del virus antes de unirse a la célula huésped, se puede realizar un "ensayo de inactivación viral". En este ensayo, se permite que el virus se incube con el fármaco de prueba y luego se diluye para valorar el fármaco antes de infectar una monocapa celular. Los pasos adicionales, como la unión viral y las etapas de entrada/fusión, también se pueden analizar individualmente, cambiando la temperatura durante la infección. Para muchos virus con envoltura, la entrada/fusión viral en la membrana de la célula huésped se facilita en gran medida a 37 °C, pero generalmente se impide a 4 °C, lo que no afecta la unión al virus24-29. Por último, el uso de virus reporteros o sistemas celulares podría facilitar estos estudios y permitir un análisis de alto rendimiento.

Anteriormente empleamos el enfoque basado en células y diseccionamos la entrada temprana de varios virus envueltos para el examen de compuestos antivirales que potencialmente antagonizan la entrada viral30,31. En este artículo, se describen los diversos métodos utilizados, incluida la inactivación viral, la unión viral y los ensayos de entrada/fusión viral.

Protocolo

Nota: Asegúrese de que todos los procedimientos relacionados con el cultivo de células y de infección por el virus se llevan a cabo en las campanas de bioseguridad certificados que sean apropiados para el nivel de bioseguridad de las muestras que se manejan. Para el propósito de describir los protocolos, la luciferasa Gaussia HCV reportero de etiquetado se usa como un modelo de virus 32. En el contexto de los resultados representativos, el ácido compuestos chebulágico (CHLA) y punicalagina (PUG) se utilizan como antivirales candidatos que se dirigen las interacciones glicoproteína viral con glicosaminoglicanos superficie celular durante la entrada viral temprana pasos 31. La heparina, que se sabe que interfiere con la entrada de muchos virus 30,31,33,34, se utiliza como un tratamiento control positivo en tal contexto. Para base de fondo en las técnicas de virología, la propagación de virus, determinación del título de virus, y la expresión de la dosis infecciosa en unidades formadoras de placa (PFU), se centran unidades formadoras (FFU), o multiplicidad de infección (MOI), el lector es repreferido para hacer referencia 35. Para ejemplos anteriores y condiciones optimizadas utilizados para los virus que se muestran en los resultados representativos, se remite al lector a las referencias 30-32,36-39, así como detalles enumerados en la Tabla 1, la Figura 1A, y la Figura 2A.

1. Cultivo Celular, Preparación Compuesto y citotoxicidad Compuesto

  1. Crece la línea celular respectiva para el sistema de infección por el virus para ser analizados (Tabla 1). Para VHC, crecer las células Huh-7.5 en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 200 U / ml de penicilina G, 200 mg / ml de estreptomicina, y 0,5 mg / ml de anfotericina B.
  2. Preparar los compuestos de ensayo y controles utilizando sus respectivos disolventes: por ejemplo, disolver CHLA y PUG en sulfóxido de dimetilo (DMSO); preparar heparina en agua bidestilada estéril. Para todas las diluciones posteriores, utilizar medios de cultivo.
    Nota: La última concentración de DMSO en los tratamientos compuesto de ensayo es menos de 1% en los experimentos; 1% de DMSO se incluye como un tratamiento de control negativo en los ensayos para la comparación.
  3. Determinar la citotoxicidad de los compuestos de ensayo (por ejemplo, chla y PUG) sobre las células para la infección viral mediante el uso de una viabilidad celular determinar reactivo tal como XTT (2,3-bis [2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil] -5-fenilamino) carbonil] -2H-tetrazolio hidróxido):
    1. Para VHC, sembrar células Huh-7.5 en una placa de 96 pocillos (1 × 10 4 células por pocillo) y se incuba a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5% O / N para obtener una monocapa.
    2. Aplicar el control de DMSO (1%) o concentraciones crecientes del compuestos de ensayo y CHLA PUG (Ex. 0, 10, 50, 100, y 500 mM) a los pocillos de cultivo por triplicado.
    3. Incubar a 37 ° C durante 72 hr, luego descarta el medio en la placa y lavar las células con 200 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS) dos veces.
    4. Añadir 100 l de assaying solución del kit de ensayo in vitro de la toxicología en basado en XTT a cada pocillo e incubar las placas a 37 ° C durante otras 3 horas para permitir la producción de formazan XTT.
    5. Determinar la absorbancia con un lector de microplacas a una longitud de onda de ensayo de 492 nm y una longitud de onda de referencia de 690 nm.
    6. Calcular el porcentaje de células supervivientes usando la siguiente fórmula: Viabilidad celular (%) = A / Como × 100%, donde "A" y "Como 'se refieren a la absorbancia de los compuestos de ensayo y el control de disolvente (ex 1% de DMSO. ) tratamientos, respectivamente. Determinar la concentración de 50% de citotoxicidad celular (CC 50) de los compuestos de ensayo a partir de un software de análisis tales como GraphPad Prism de acuerdo con el protocolo del fabricante.

2. Lectura de la infección viral

Nota: La lectura de la infección viral depende del sistema utilizado y virus puede implicar métodos tales como ensayos de placas o measuring señales indicadoras de virus reportero-etiquetado. El método para detectar la infección por VHC reportero basado en la actividad de informador de luciferasa se describe a continuación.

  1. Reunir los sobrenadantes de los pozos infectados y aclarar a 17.000 xg en una microcentrífuga durante 5 min a 4 ° C.
  2. Mezclar 20 l de sobrenadante de ensayo a 50 l de sustrato de luciferasa del kit de ensayo de luciferasa Gaussia y medir directamente con un luminómetro de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  3. Expresar la infectividad del VHC como log 10 de unidades relativas de luz (RLU) para la determinación de la inhibición viral (%) y calcular la concentración 50% eficaz (CE 50) de los compuestos de ensayo contra la infección por el VHC usando algoritmos de software GraphPad Prism de acuerdo con el protocolo del fabricante.

3. Inactivación Viral Ensayo

Nota: Los ejemplos de período de incubación y la dosis viral de diversos virus unare enumerados en la Figura 1A. Las concentraciones más altas del virus también pueden ser probados por el aumento de la MOI / PFU.

  1. Semilla de células en una placa de 96 pocillos de 7,5 Huh-(1 × 10 4 células por pocillo) y se incuba a 37 ° C en un incubador de CO2 5% de O / N para obtener una monocapa.
  2. Incubar los compuestos de ensayo o controles (concentraciones finales son: CHLA = 50 M; PUG = 50 M; heparina = 1,000 g / ml; DMSO = 1%) con las partículas de VHC a 37 ° C (Figura 1A, 'a largo plazo' ) en una proporción de 1: 1. Por ejemplo, para un inóculo de virus de 100 l que contiene 1 x 10 4 FFU, añadir 100 l de una dilución de trabajo 100 mM CHLA; esto produce el tratamiento CHLA a una concentración final de 50 mM.
  3. Diluir la mezcla de virus-fármaco para (ineficaz) de concentración "sub-terapéutica" de los compuestos de ensayo. Por ejemplo, la concentración ineficaz de CHLA y PUG contra el VHC está en 1 M 31; Por Consiguienteesto requiere una dilución de 50 veces de la mezcla de virus-fármaco que se puede lograr con 9,8 ml de medio basal (medio de cultivo celular con 2% de FBS).
    Nota: La dilución a la concentración sub-terapéutica impide la interacción significativa entre los compuestos de ensayo y la superficie de la célula huésped y permite el examen del efecto del tratamiento en los viriones libres de células. Tenga en cuenta que esta dilución depende de la respuesta a la dosis antiviral de los compuestos de ensayo frente a la infección viral en particular, y se determina antes de realizar este ensayo en particular 31.
  4. Para la comparación, mezclar el virus con los compuestos de ensayo y de inmediato diluir (sin período de incubación) a la concentración sub-terapéutica antes de la infección (Figura 1A, 'corto plazo').
  5. Añadir 100 l de la mezcla de HCV-fármaco diluida sobre el 7,5-Eh monocapa celular (la cantidad de virus se encuentra ahora en 1 x 10 2 FFU; MOI final = 0,01) e incubar durante 3 horas a 37 ° C para permitir viraladsorción.
  6. Tras la infección, eliminar el inóculo diluido y lavar suavemente los pocillos con 200 l de PBS dos veces.
    Nota: Realizar los lavados con cuidado para evitar el levantamiento de las células.
  7. Aplicar 100 l de medio basal a cada pocillo e incubar a 37 ° C durante 72 hr.
  8. Analizar la infección resultante sometiendo a ensayo el sobrenadante para la actividad de luciferasa como se describe en '2. Lectura de la infección viral '.

4. Ensayo Adjunto Viral

Nota: Los ejemplos de período de incubación y la dosis viral para varios virus se enumeran en la Figura 2A, el "Anexo". Las concentraciones más altas del virus también pueden ser probados por el aumento de la MOI / PFU.

  1. Semilla de células en una placa de 96 pocillos de 7,5 Huh-(1 × 10 4 células por pocillo) y se incuba a 37 ° C en un incubador de CO2 5% de O / N para obtener una monocapa.
  2. Pre-enfriar las monocapas de células en placas a 4 ° C for 1 hr.
  3. Co-tratamiento de las células con inóculo HCV (MOI = 0,01) y compuestos o controles de ensayo (concentraciones finales son: CHLA = 50 M; PUG = 50 M; heparina = 1,000 g / ml; DMSO = 1%) a 4 ° C durante 3 hr. Por ejemplo, para un inóculo de virus de 90 l que contiene 1 x 10 2 FFU, añadir 10 l de una dilución de trabajo 500 mM CHLA; esto produce el tratamiento CHLA a una concentración final de 50 mM y una infección por el VHC a MOI = 0,01 en la monocapa de células.
    Nota: Es importante llevar a cabo el experimento a 4 ° C, ya que permite la unión del virus, pero se opone a la entrada que se produce de manera más eficiente a 37 ° C. Realizar la adición de compuestos de virus y de prueba en el hielo y la incubación subsiguiente en un refrigerador 4 ° C para asegurar que la temperatura se mantiene a 4 ° C.
  4. Eliminar el sobrenadante y lavar suavemente la monocapa de células con 200 l de helado de PBS dos veces.
    Nota: Realizar los lavados con cuidado para evitar el levantamiento de las células <./ li>
  5. Aplicar 100 l de medio basal a cada pocillo e incubar a 37 ° C durante 72 hr.
  6. Analizar la infección resultante sometiendo a ensayo el sobrenadante para la actividad de luciferasa como se describe en '2. Lectura de la infección viral '.

5. Viral Entry / ensayo de fusión

Nota: Ejemplo de períodos de incubación y dosis viral para varios virus se enumeran en "Entrada / Fusión 'Figura 2A. Las concentraciones más altas del virus también pueden ser probados por el aumento de la MOI / PFU.

  1. Semilla de células en una placa de 96 pocillos de 7,5 Huh-(1 × 10 4 células por pocillo) y se incuba a 37 ° C en un incubador de CO2 5% de O / N para obtener una monocapa.
  2. Pre-enfriar las monocapas de células en placas a 4 ° C durante 1 hora.
  3. Infectar las células con HCV (MOI = 0,01) a 4 ° C durante 3 hr. Por ejemplo, utilice un inóculo de virus 100 l que contiene 1 x 10 2 FFU.
    Nota: Realice el adición del inóculo viral en hielo y la incubación subsiguiente en un refrigerador 4 ° C para mantener la temperatura a 4 ° C, la cual permite la entrada de unión pero no viral.
  4. Eliminar el sobrenadante y lavar suavemente las monocapas de células con 200 l de helado de PBS dos veces.
    Nota: Realizar los lavados con cuidado para evitar el levantamiento de las células.
  5. Tratar los pocillos con los compuestos de ensayo o controles (concentraciones finales son: CHLA = 50 M; PUG = 50 M; heparina = 1,000 g / ml; DMSO = 1%) y se incuba a 37 ° C durante 3 hr. Por ejemplo, añadir 10 l de una dilución de trabajo 500 M CHLA a 90 l de los medios de comunicación, mezclar y tratar los pozos; esto produce el tratamiento CHLA a una concentración final de 50 mM.
    Nota: El cambio de 4 ° C a 37 ° C ahora facilita el evento de entrada / fusión viral y por lo tanto permite la evaluación del efecto de los compuestos de ensayo 'en este paso particular.
  6. Aspirar el sobrenadante que contiene el fármaco y quitar no internalizadovirus extracelulares ya sea por lavado con 200 l de tampón citrato (citrato de sodio 50 mM, cloruro de potasio mM 4, pH 3,0) o PBS. Aplicar 100 l de medio basal antes de la incubación a 37 ° C durante 72 hr.
  7. Analizar la infección resultante sometiendo a ensayo el sobrenadante para la actividad de luciferasa como se describe en '2. Lectura de la infección viral '.

Resultados

En la Figura 1, se realizó el "ensayo de inactivación viral 'para examinar si dos compuestos naturales CHLA específica y PUG podrían inactivar los virus con envoltura diferentes en el estado libre de células y prevenir la infección subsiguiente. La respuesta a la dosis antiviral y la citotoxicidad de estos compuestos se han determinado antes de realizar el estudio mecanicista 31. Los virus fueron pre-tratados con los compuestos de ensayo y después las mezclas de virus a los fármacos se diluyeron a concentraciones sub-terapéuticas antes de la inoculación sobre la respectiva monocapa de células para cada sistema de virus. Como se muestra en la Figura 1, tanto CHLA y PUG aparecieron para interactuar con los viriones libres de células, dando lugar a efectos irreversibles que protegían la monocapa de células de la infección subsiguiente. Los dos compuestos de ensayo alcanzan alrededor de 100% de inhibición contra HCMV, VHC y DENV-2, mientras que un 60 - 80% de bloque se observó contra MV y RSV. Estos resultados Suggest que CHLA y PUG tienen impacto directo sobre estas partículas virales libres al inactivar ellos y neutralizando su infectividad.

En la Figura 2, el apego y ensayos de entrada / fusión se llevaron a cabo para explorar el efecto de CHLA y PUG en contra de estos principios de los acontecimientos relacionados con la entrada-virales de HCMV, VHC, DENV-2, MV, y RSV. Tanto CHLA y PUG impidieron efectivamente la unión de los virus investigados en la célula huésped respectiva, como se muestra por la inhibición de la infección viral resultante (Figura 2, el "Anexo ': barras de color gris claro). El efecto inhibidor sobre la fijación del virus por ambos compuestos era similar contra HCMV (Figura 2B), HCV (Figura 2C), DENV-2 (Figura 2D), y RSV (Figura 2F), que van desde 90 hasta 100%. Por otro lado, PUG parecía ser más eficaz que CHLA contra MV de unión (Figura 2E), con la tasa de inhibición de la two compuestos que varían entre 50 - 80%. La heparina tratamiento de control, que es conocido para bloquear la entrada de muchos virus, también inhibió la unión de HCMV, DENV-2, RSV, ad MV, pero fue menos eficaz contra el VHC. La subsiguiente 'ensayo de entrada / fusión viral' examinó si CHLA y PUG mantuvieron su actividad durante la fase de entrada de virus / fusión (Figura 2, 'Entrada / Fusión': barras de color gris oscuro). Una vez más, tanto CHLA y PUG se observaron perjudicar efectivamente el paso de entrada / fusión viral de los virus examinados (Figura 2 B - F), produciendo un 50 - efecto protector del 90% en la respectiva monocapa celular. La heparina también inhibe potentemente la entrada / fusión de DENV-2 y las infecciones por VRS, pero fue menos eficaz contra HCMV, VHC y MV (<40% de inhibición en promedio).

Virus Tipo de la célula
HCMV HEL
VHC Huh-7.5
DENV-2 Vero
MV CHO-SLAM
RSV HEp-2

Tabla 1:. Tipo de célula huésped para la infección viral El tipo celular utilizado para cada sistema de la infección viral se describe en los resultados representativos se indica. Los detalles adicionales con respecto a las células se pueden encontrar en la referencia 31.

figure-results-1
Figura 1. Inactivación de infecciones virales por el CHLA compuestos de ensayo y PUG Diferentes virus se trataron con los compuestos de ensayo durante un período largo. (Se incubaron durante 1.5 - 3 horas antes de la titulación; barras de color gris claro) o corto período de tiempo (inmediatamente diluido; gris oscuro bares) a 37 ° C antes de una dilución a concentraciones sub-terapéuticación y posterior análisis de la infección en las respectivas células de acogida. (A) Esquema del experimento (que se muestra a la izquierda) con la concentración de virus final (PFU / pocillo o MOI), período de incubación del virus con la droga a largo plazo (i), y el tiempo de incubación posterior (ii) indicado para cada virus en el cuadro a la derecha. Los análisis para (B) HCMV, (C) del VHC, (D) DENV-2, (E) MV, y (F) de RSV se indican en cada panel adicional. Los resultados se representan frente al tratamiento de control negativo DMSO para la infección por virus y los datos mostrados son las medias ± error estándar de la media (SEM) de tres experimentos independientes. Esta cifra se ha modificado de la referencia 31. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2. Evaluación de las actividades antivirales de la CHLA compuestos de ensayo y PUG contra la fijación del virus y la entrada / fusión. (A) El procedimiento experimental, la concentración de virus (PFU / pocillo o MOI), y el tiempo de adición y el tratamiento con los compuestos de prueba (i, ii, iii) se presentan para cada virus en los esquemas y las tablas asociadas. En el análisis de la fijación del virus (barras de color gris claro), las monocapas de diferentes tipos de células fueron pre-refrigerados a 4 ° C durante 1 hr, a continuación, co-tratado con los respectivos virus y compuestos de ensayo a 4 ° C (1,5 - 3 h; i) antes de lavar los inóculos y los compuestos de ensayo para su posterior incubación (37 ° C; ii) y el examen de la infección por virus. En la entrada del virus / análisis de fusión (barras gris oscuro), monocapas de células sembradas se pre-refrigerada a 4 ° C durante 1 hora y después se estimularon con los virus respectivos a 4 ° C durante 1,5 - 3 h (i). Las células fueron entonceslavada y tratada con los compuestos de ensayo durante un periodo de incubación adicional (ii) durante el cual la temperatura se cambió a 37 ° C para facilitar el evento de entrada / fusión viral. Al final de la incubación, los virus extracelulares fueron retirados por cualquiera de tampón citrato (pH 3,0) o lavados con PBS y las células se incubaron adicionalmente (iii) para el análisis de la infección por virus. Resultados para (B) HCMV, (C) del VHC, (D) DENV-2, (E) MV, y (F) de RSV se indican en cada panel adicional. Los datos se representan frente al tratamiento de control negativo de la infección por el virus de DMSO y se presentan como medias ± SEM de tres experimentos independientes. Esta cifra se ha modificado de la referencia 31. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

En este informe se describieron los métodos para identificar y evaluar compuestos antivirales basados en un enfoque mecanicista de disección de los eventos tempranos de entrada viral. Específicamente, los ensayos nos permitieron examinar el efecto de los compuestos de prueba sobre las partículas de virus libres, la unión viral y la entrada/fusión viral. Se implementaron pasos críticos para evaluar claramente el efecto del fármaco en la etapa específica de la entrada viral temprana. Por ejemplo, en el "ensayo de inactivación viral", la dilución de la mezcla de virus y fármaco a una concentración subterapéutica evita una interacción significativa entre el compuesto de prueba y la superficie de la célula huésped al "valorar" el fármaco. Esto asegura que el efecto inhibidor observado en la infección posterior de la célula huésped se deba a una interacción directa entre el compuesto de prueba y los viriones libres de células, en lugar de un efecto del compuesto de prueba en la membrana de la célula huésped o en las moléculas asociadas a la membrana, incluidos los receptores virales30. Del mismo modo, el cambio de temperatura entre 4 °C (que permite la unión del virus pero no la entrada) y 37 °C (que facilita la entrada/fusión del virus) en el "ensayo de unión viral" y el "ensayo de entrada/fusión viral" es crucial para determinar el efecto del compuesto de prueba en cada uno de estos eventos específicos. Esto es factible debido a la sensibilidad a la temperatura de los virus envueltos durante estos pasos de la infección24-29. Por lo tanto, es importante que los ensayos se realicen a la temperatura indicada para garantizar la precisión de los resultados; por ejemplo, realizando el experimento en hielo para mantener a 4 °C y colocando la muestra directamente en una incubadora a 37 °C para el cambio de temperatura. Además, el uso de controles negativos (por ejemplo, disolvente DMSO para la preparación de fármacos) y positivos (por ejemplo, tratamiento con heparina) también ayuda a establecer aún más la precisión de los ensayos. La utilidad y aplicabilidad de estos métodos se ha demostrado en muchos estudios antivirales26,30,31,40,41. Tenga en cuenta que, si bien la heparina se incluye como control para los tres ensayos en el contexto de los resultados representativos, generalmente bloquea la unión inicial del virus en lugar del paso de fusión/entrada posterior (como se refleja en los datos de la Figura 2). También se podrían usar controles adicionales, como anticuerpos neutralizantes dirigidos contra el virus (para el ensayo de inactivación viral), anticuerpos que enmascaran los receptores de la superficie celular para el virus (para el ensayo de unión viral) e inhibidores de la fusión de membrana (para el ensayo de fusión/entrada viral).

Los ensayos descritos en este informe, que son específicos de las primeras etapas de la infección viral, son útiles en términos de aplicación como pruebas secundarias para caracterizar el mecanismo de acción de los fármacos candidatos de los exámenes primarios que generalmente se dirigen a la infección viral de manera más amplia. Alternativamente, también podrían incorporarse en las pruebas de detección primarias si se buscan específicamente inhibidores de la entrada viral temprana, incluidos los agentes inactivadores del virus, los antagonistas de la unión viral y los inhibidores de la entrada/fusión viral. En este caso, su uso permite un análisis de detección más centrado y preciso para la identificación de candidatos antivirales específicos del mecanismo, lo que, a su vez, aceleraría el desarrollo posterior de fármacos.

El uso de ensayos basados en células para identificar agentes antivirales proporciona varias ventajas importantes en comparación con los ensayos bioquímicos, incluida la revelación de posibles efectos fuera del objetivo (como la citotoxicidad) y la adición de relevancia fisiológica a la bioactividad de los agentes de prueba42. Estas cuestiones son consideraciones importantes para decidir si un agente candidato es valioso para su continuación en fases posteriores del desarrollo de fármacos. De manera similar, los ensayos específicos de entrada viral temprana descritos en este informe permiten examinar el efecto del fármaco en la etapa de entrada viral distinta a nivel celular, y más específicamente en el contexto de una infección viral auténtica in vitro. Por lo tanto, los resultados obtenidos de dichos ensayos ayudarían a predecir mejor la eficacia antiviral de los compuestos de prueba y también a identificar efectos no deseados fuera del objetivo contra la célula huésped. Sin embargo, una limitación potencial es que un ensayo basado en células in vitro puede no reflejar completamente el paso de entrada in vivo real en el contexto de una infección viral natural. No obstante, los ensayos presentados en este protocolo sirven como plataforma analítica para la identificación y evaluación basadas en mecanismos de nuevos agentes antivirales.

El desarrollo de virus reporteros o sistemas de células reporteras para cuantificar la cantidad de infección viral ha facilitado enormemente el cribado y la evaluación de compuestos antivirales basados en células. Los ejemplos incluyen el uso de virus recombinantes portadores de un gen indicador o por medio de líneas celulares humanas recombinantes que contienen un gen indicador impulsado por el promotor específico del virus31,43. En este informe, la infección por VHC marcado con luciferasa se puede monitorear fácilmente cuantificando la señal indicadora, lo que facilita el análisis de datos. Al incorporar estas útiles herramientas basadas en reporteros, los primeros ensayos de entrada viral descritos aquí se pueden adaptar esencialmente a un formato de alto rendimiento para el cribado basado en mecanismos de bibliotecas de moléculas pequeñas.

En conclusión, se describió un protocolo para ensayos que diseccionan la entrada viral temprana como un medio para identificar y evaluar compuestos antivirales específicos del mecanismo. Dichos ensayos serían útiles para descubrir nuevos antagonistas/inhibidores de la entrada viral y ayudarían a ampliar el alcance de los agentes antivirales para su desarrollo como tratamientos profilácticos y/o terapéuticos.

Divulgaciones

Los autores declaran que no existen intereses contrapuestos.

Agradecimientos

Este estudio cuenta con el apoyo financiero del Hospital Universitario Médico de Taipei (102TMU-TMUH-19) y el Ministerio de Ciencia y Tecnología de Taiwán (MOST103-2320-B-038-031-MY3).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
DMEMGIBCO11995-040
FBSGIBCO26140-079
Penicilina-EstreptomicinaGIBCO15070-063
Anfotericina BGIBCO15290-018
DMSOSigmaD5879
Kit de ensayo de toxicología in vitro,SigmaTOX2
basado en XTTPBS pH 7.4 GIBCO10010023
Microcentrífuga Thermo Scientific89087-320
Kit
BioLux GaussiaNew England BiolabsE3300L     
LuminómetroPromegaGloMax-20/20
Citrato de sodio, dihidratadoSigma71402
Cloruro de potasioSigmaP5405
Lector de microplacas de ensayo de luciferasa Thermo Scientific 75002420

Referencias

  1. Munier, C. M., Andersen, C. R., Kelleher, A. D. HIV vaccines: progress to date. Drugs. 71, 387-414 (2011).
  2. Rothman, A. L. Immunity to dengue virus: a tale of original antigenic sin and tropical cytokine storms. Nat Rev Immunol. 11, 532-543 (2011).
  3. Sung, H., Schleiss, M. R. Update on the current status of cytomegalovirus vaccines. Expert Rev Vaccines. 9, 1303-1314 (2010).
  4. Torresi, J., Johnson, D., Wedemeyer, H. Progress in the development of preventive and therapeutic vaccines for hepatitis C virus. J Hepatol. 54, 1273-1285 (2011).
  5. Wright, M., Piedimonte, G. Respiratory syncytial virus prevention and therapy: past, present, and future. Pediatr Pulmonol. 46, 324-347 (2011).
  6. Christou, L. The global burden of bacterial and viral zoonotic infections. Clin Microbiol Infect. 17, 326-330 (2011).
  7. Cascio, A., Bosilkovski, M., Rodriguez-Morales, A. J., Pappas, G. The socio-ecology of zoonotic infections. Clin Microbiol Infect. 17, 336-342 (2011).
  8. Grais, R. F. Measles vaccination in humanitarian emergencies: a review of recent practice. Confl Health. 5, 21(2011).
  9. Gautret, P. Emerging viral respiratory tract infections-environmental risk factors and transmission. Lancet Infect Dis. 14, 1113-1122 (2014).
  10. Sampathkumar, P. Middle East respiratory syndrome: what clinicians need to know. Mayo Clin Proc. 89, 1153-1158 (2014).
  11. Burd, E. M. Ebola Virus: a Clear and Present Danger. J Clin Microbiol. 53, 4-8 (2015).
  12. Bishop, B. M. Potential and Emerging Treatment Options for Ebola Virus Disease. Ann Pharmacother. , (2014).
  13. Arduino, P. G., Porter, S. R. Oral and perioral herpes simplex virus type 1 (HSV-1) infection: review of its management. Oral Dis. 12, 254-270 (2006).
  14. Mitrasinovic, P. M. Advances in the structure-based design of the influenza A neuraminidase inhibitors. Curr Drug Targets. 11, 315-326 (2010).
  15. Soriano, V. Directly acting antivirals against hepatitis C virus. J Antimicrob Chemother. 66, 1673-1686 (2011).
  16. Haqqani, A. A., Tilton, J. C. Entry inhibitors and their use in the treatment of HIV-1 infection. Antiviral Res. 98, 158-170 (2013).
  17. Melby, T., Westby, M. Inhibitors of viral entry. Handb Exp Pharmacol. , 177-202 (2009).
  18. Vanderlinden, E., Naesens, L. Emerging antiviral strategies to interfere with influenza virus entry. Med Res Rev. 34, 301-339 (2014).
  19. Antoine, T. E., Park, P. J., Shukla, D. Glycoprotein targeted therapeutics: a new era of anti-herpes simplex virus-1 therapeutics. Rev Med Virol. 23, 194-208 (2013).
  20. Pawlotsky, J. M., Chevaliez, S., McHutchison, J. G. The hepatitis C virus life cycle as a target for new antiviral therapies. Gastroenterology. 132, 1979-1998 (2007).
  21. Beyleveld, G., White, K. M., Ayllon, J., Shaw, M. L. New-generation screening assays for the detection of anti-influenza compounds targeting viral and host functions. Antiviral Res. 100, 120-132 (2013).
  22. Kilianski, A., Baker, S. C. Cell-based antiviral screening against coronaviruses: developing virus-specific and broad-spectrum inhibitors. Antiviral Res. 101, 105-112 (2014).
  23. Caillet-Saguy, C., Lim, S. P., Shi, P. Y., Lescar, J., Bressanelli, S. Polymerases of hepatitis C viruses and flaviviruses: structural and mechanistic insights and drug development. Antiviral Res. 105, 8-16 (2014).
  24. Frey, S. Temperature dependence of cell-cell fusion induced by the envelope glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 69, 1462-1472 (1995).
  25. Tscherne, D. M. Time- and temperature-dependent activation of hepatitis C virus for low-pH-triggered entry. J Virol. 80, 1734-1741 (2006).
  26. Madan, R. P. Molecular umbrellas: a novel class of candidate topical microbicides to prevent human immunodeficiency virus and herpes simplex virus infections. J Virol. 81, 7636-7646 (2007).
  27. Haywood, A. M., Boyer, B. P. Time and temperature dependence of influenza virus membrane fusion at neutral pH. J Gen Virol. 67 (Pt 12), 2813-2817 (1986).
  28. Haywood, A. M., Boyer, B. P. Sendai virus membrane fusion: time course and effect of temperature, pH, calcium, and receptor concentration). Biochemistry. 21, 6041-6046 (1982).
  29. Wang, G., Hernandez, R., Weninger, K., Brown, D. T. Infection of cells by Sindbis virus at low temperature. Virology. 362, 461-467 (2007).
  30. Lin, L. T. Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread. J Virol. 85, 4386-4398 (2011).
  31. Lin, L. T. Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry. BMC Microbiol. 13, 187(2013).
  32. Marukian, S. Cell culture-produced hepatitis C virus does not infect peripheral blood mononuclear cells. Hepatology. 48, 1843-1850 (2008).
  33. Baba, M., Snoeck, R., Pauwels, R., de Clercq, E. Sulfated polysaccharides are potent and selective inhibitors of various enveloped viruses, including herpes simplex virus, cytomegalovirus, vesicular stomatitis virus, and human immunodeficiency virus. Antimicrob Agents ChemotheR. 32, 1742-1745 (1988).
  34. Barth, H. Cellular binding of hepatitis C virus envelope glycoprotein E2 requires cell surface heparan sulfate. J Biol CheM. 278, 41003-41012 (2003).
  35. Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. Principles of Virology. , 3rd edn, ASM Press. (2008).
  36. Brown, M. G. Dramatic caspase-dependent apoptosis in antibody-enhanced dengue virus infection of human mast cells. J Leukoc Biol. 85, 71-80 (2009).
  37. Huang, Y., Cyr, S. L., Burt, D. S., Anderson, R. Murine host responses to respiratory syncytial virus (RSV) following intranasal administration of a Protollin-adjuvanted, epitope-enhanced recombinant G protein vaccine. J Clin Virol. 44, 287-291 (2009).
  38. Isaacson, M. K., Compton, T. Human cytomegalovirus glycoprotein B is required for virus entry and cell-to-cell spread but not for virion attachment, assembly, or egress. J Virol. 83, 3891-3903 (2009).
  39. Leonard, V. H., et al. Measles virus blind to its epithelial cell receptor remains virulent in rhesus monkeys but cannot cross the airway epithelium and is not shed. J Clin Invest. 118, 2448-2458 (2009).
  40. Ciesek, S. The green tea polyphenol, epigallocatechin-3-gallate, inhibits hepatitis C virus entry. Hepatology. 54, 1947-1955 (2011).
  41. Lin, L. T. Saikosaponin b2 is a naturally occurring terpenoid that efficiently inhibits hepatitis C virus entry. J Hepatol. 62, 541-548 (2015).
  42. Atkins, C., Evans, C. W., White, E. L., Noah, J. W. Screening methods for influenza antiviral drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 7, 429-438 (2012).
  43. Zhang, J. Identification of novel virus inhibitors by influenza A virus specific reporter cell based screening. Antiviral Res. 93, 48-54 (2012).

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Virus de la hepatitis Cinactivaci n viraladhesi n viralfusi n viralreportero de luciferasaprueba de citotoxicidadincubaci n de cultivos celulareslavado con PBS
Ensayos pronta entrada virales para la identificación y evaluación de compuestos antivirales
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.