Los embriones de pez cebra ópticamente transparentes se utilizan ampliamente para estudiar y visualizar en tiempo real las interacciones entre los microorganismos patógenos y las células inmunitarias innatas. La microinyección de Mycobacterium abscessus, combinada con imágenes de fluorescencia, se utiliza para examinar las características patógenas esenciales, como la formación del cordón en los embriones de pez cebra.
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Artículo de método
Descifrar e imagen Patogénesis y Cording de
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Resumen
Resumen
Los embriones de pez cebra (Danio rerio) se utilizan cada vez más como modelo de infección para estudiar la función del sistema inmune innato de los vertebrados en las interacciones huésped-patógeno. La facilidad de obtener un gran número de embriones, su accesibilidad debido al desarrollo externo, su transparencia óptica, así como la disponibilidad de una amplia panoplia de herramientas genéticas/inmunológicas y colecciones de líneas reporteras transgénicas, En este sentido, el presente manuscrito describe el uso del pez cebra como sistema modelo in vivo para investigar la cronología de la infección por Mycobacterium abscessus. Este patógeno humano puede existir como variantes lisas (S) o rugosas (R), dependiendo de la composición de la pared celular, y su virulencia respectiva puede visualizarse y compararse en embriones y larvas de pez cebra. La microinyección de variantes fluorescentes S o R directamente en la circulación sanguínea a través de la vena caudal, conduce a infecciones crónicas o agudas/letales, respectivamente. Este sistema biológico permite la visualización y el análisis de alta resolución del papel de las cuerdas micobacterianas en la promoción de la formación de abscesos. Además, el uso de bacterias fluorescentes junto con líneas de peces cebra transgénicos que albergan macrófagos fluorescentes produce una oportunidad única para obtener imágenes multicolor de las interacciones huésped-patógeno. Este artículo describe protocolos detallados para la preparación de inóculo homogéneo de M. abscessus y para la inyección intravenosa de embriones de pez cebra para la posterior obtención de imágenes de fluorescencia de la interacción con los macrófagos. Estas técnicas abren la vía para futuras investigaciones que involucren mutantes defectuosos en la formación de cordones y se dedican a comprender cómo esto impacta en la patogenicidad de M. abscessus en un vertebrado completo.
Introducción
Abscessus Mycobacterium es un patógeno emergente que provoca un amplio espectro de síndromes clínicos en seres humanos. Estos incluyen infecciones cutáneas, así como las infecciones pulmonares crónicas severas, en su mayoría se encuentran en inmunocomprometidos y en pacientes con fibrosis quística 1,2,3,4. M. abscessus también es considerado como una de las principales especies de micobacterias de rápido crecimiento responsables de las infecciones nosocomiales y yatrogénica en los seres humanos. Por otra parte, varios informes recientes destacan la posibilidad de que M. abscessus podía cruzar la barrera sangre-cerebro y inducir l....
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Protocolo
Procedimientos experimentales pez cebra deben cumplir con los reglamentos institucionales y gubernamentales pertinentes. Para el presente estudio, los experimentos de pez cebra se realizaron en la Universidad de Montpellier, según las directrices de la Unión Europea para el manejo de animales de laboratorio (http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/home_en.htm) y aprobados bajo la referencia CEEA-LR-13007.
1. Preparación de los reactivos y microinyección Equipo
- Preparar el agua peces disolviendo 0,06 g instantánea sal del mar del océano en 1 L de agua destilada 31, entonces autoclave para esterilizar (12....
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Resultados
Aunque diversos sitios anatómicos pueden ser inyectados 32, las inyecciones de la vena caudal se utilizan a menudo para generar infección sistémica para análisis posteriores experimentos de supervivencia, incluyendo la determinación de la carga bacteriana, la actividad de la fagocitosis o la formación del cordón. Las inyecciones en los músculos de la cola se utilizan para evaluar el reclutamiento de macrófagos en el sitio de la inyección (Figura 3A). Para investigar y comparar la virulencia d.......
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Discusión
El pez cebra ha surgido recientemente como un excelente sistema modelo vertebrado para estudiar la dinámica de la infección bacteriana usando amplio campo y la imagen confocal en tiempo real 36. La combinación de suspensiones dispersas de micobacterias (protocolo 2.2), junto con los métodos de micro-inyección (protocolo 4) permite que las infecciones sistémicas, reproducibles y posterior seguimiento y visualización de la progresión de la infección con un enfoque especial en las interacciones bacterianas con m.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen a K. Kissa útil para los debates y para proporcionar lipo-clodronato y L. Ramakrishnan por el generoso regalo de pTEC27 y pTEC15 que permiten la expresión de tdTomato y Wasabi, respectivamente. Este trabajo forma parte de los proyectos de la Agencia Nacional de Investigación VII Programa Marco de la Comunidad Europea (ZebraFlam ANR-10-MIDI-009 y DIMYVIR ANR-13-BSV3-007-01) y (FP7-PEOPLE-2011-ITN) en virtud de acuerdo de subvención no. PITN-GA-2011-289209 por Marie-Curie de Formación Inicial Red FishForPharma. También queremos agradecer a la Asociación de Gregory Lemarchal y Vaincre La Mucoviscidose (RF20130500835) para la financiación de CM Dupo....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| BBL MGIT PANTA | BD Biosciences | 245114 | |
| Albúmina sérica bovina | Euromedex | 04-100-811-E | |
| Catalasa de hígado bovino | Sigma-Aldrich | C40 | |
| Difco Middlebrook 7H10 Agar | BD Biosciences | 262710 | |
| Difco Middlebrook 7H9 Caldo | BD Biosciences | 271310 | |
| Etilo 3-aminobenzoato Sal de metanosulfonato (Tricaína) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Ácido oleico | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Paraformaldehído | Delta Microscopía | 15710 | |
| Rojo de fenol | Sigma-Aldrich | 319244 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P4780 | |
| Agar | Gibco Life Technologie | 30391-023 | |
| Agarosa de bajo punto de fusión | Sigma-Aldrich | ||
| Sales marinas oceánicas instantáneas | Aquarium Systems Inc | ||
| Capilares de vidrio de borosilicato | Instrumento Sutter Inc | BF100-78-10 | 1 mm de diámetro exterior x 0,78 mm de diámetro interno |
| Dispositivo extractor de micropipetas | Sutter Instrument Inc | Extractor de micropipetas flameado/marrón p-87 | |
| Microinyector | Tritech Research | MicroINYECTOR digital, MINJ-D | |
| Pinzas | Sciences Tools inc | Dumont # M5S | |
| Puntas de microcargador | Eppendorf |
Referencias
- Brown-Elliott, B. A., Wallace, R. J. Clinical and taxonomic status of pathogenic nonpigmented or late-pigmenting rapidly growing mycobacteria. Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 716-746 (2002).
- Aitken, M. L., Limaye, A., et al.
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Reimpresiones y permisos
