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Artículo de método

Imágenes del tráfico intracelular de APP con GFP fotoactivable

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DOI:

10.3791/53153

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17 de octubre de 2015

 , 
1Department of Physiology and Pharmacology, Robarts Research Institute, Western University, 2Department of Clinical Neurological Sciences, Western University

En este artículo

Resumen

Mientras se estudia de forma relativamente fácil el transporte de proteínas de superficie celular, visualizando el tráfico de proteínas intracelulares es mucho más difícil. Aquí, utilizamos construcciones que incorporen buenas prácticas agrarias fotoactivable y demostrar un método para seguir con precisión la proteína precursora de amiloide del aparato de Golgi compartimentos río abajo y siga su aclaramiento.

Resumen

Beta-amiloide (Aß) es el constituyente principal de las placas seniles que se encuentran en los cerebros de pacientes con enfermedad de Alzheimer. Aß se deriva de la escisión secuencial de Proteína Precursora de Amiloide (APP) por β y gamma-secretasas. A pesar de la importancia de Aß a la patología AD, la localización subcelular de estas divisiones no está bien establecida. El trabajo en nuestro laboratorio y otros implican el sistema endosomal / lisosomal en el procesamiento de APP después de la internalización de la superficie celular. Sin embargo, el tráfico intracelular de APP es relativamente poco estudiada.

Mientras que las proteínas de la superficie celular son modificables a muchas técnicas de etiquetado, no hay métodos simples para seguir el tráfico de proteínas de la membrana del Golgi. Para ello, hemos creado construcciones APP que fueron etiquetadas fotoactivable GFP (paGFP) en el C-terminal. Después de la síntesis, paGFP tiene baja fluorescencia basal, pero puede ser estimulado con 413 nm luz to producir una fluorescencia de color verde fuerte y estable. Al utilizar el aparato de Golgi marcador galactosiltransferasa acoplado a cian proteína fluorescente (GalT-PPC) como un objetivo, estamos en condiciones de precisión fotoactivar APP en la red trans-Golgi. Activada por fotos APP-paGFP puede entonces ser seguido, ya que trafica a los compartimentos posteriores identificados con fluorescencia etiquetados proteínas marcadoras de compartimentos para el endosoma temprano (Rab5), a finales del endosoma (Rab9) y el lisosoma (LAMP1). Por otra parte, el uso de inhibidores de procesamiento de APP incluyendo cloroquina o el inhibidor de la γ-secretasa L685, 458, estamos en condiciones de realizar experimentos de pulso-caza para examinar el procesamiento de APP en las células individuales.

Nos encontramos con que una gran parte de APP se mueve rápidamente hacia el lisosoma sin aparecer en la superficie celular, y luego se elimina del lisosoma por divisiones-secretasa similares. Esta técnica demuestra la utilidad de paGFP para seguir el tráfico y el procesamiento de las proteínas intracelulares from el Golgi a los compartimentos aguas abajo.

Introducción

El sello distintivo de la enfermedad de Alzheimer (AD) es la presencia de placas seniles y ovillos neurofibrilares (NFTs) en el cerebro. El principal componente de las placas seniles es β-amiloide (Aß). Aß se deriva de su precursor; proteína precursora amiloide (APP) 1. La escisión de APP amiloidogénico comienza con la eliminación del ectodominio de APP por la β-secretasa 2. El fragmento carboxilo terminal 99-residuo restante (CTF) puede ser escindido por γ-secretasa para producir Aß 3-7. Mientras que muchos experimentos han documentado la escisión de APP de la superficie celular después de la internalización de la superficie celular en el sistema endosomal / lisosomal, un número de estudios recientes han sugerido que el tráfico intracelular de APP también es importante en la regulación de su procesamiento 8 a 11.

Ha habido un número de intentos en la modulación de los niveles de Aß con inhibidores de la gamma secretasa y-Aß Immunotherapies. Sin embargo, los ensayos clínicos recientes con estas terapias no mostraron ningún beneficio, y, en algunos casos, causó daños 12. Una estrategia sin explotar para modular la producción de Aß es alterar la localización subcelular de la APP y la interacción-γ-secretasa. El aparato de Golgi, membrana plasmática, y los endosomas / lisosomas han sido sugeridos como posibles localizaciones para γ-escisión de APP. La investigación de nuestro laboratorio sugiere que la APP y la γ-secretasa son proteínas residentes de la membrana lisosomal 13. Además, hemos encontrado que la γ-secretasa lisosomales tiene un pH óptimo ácido 13. Además, la alcalinización del sistema endosomal / lisosomal con cloroquina o NH 4 Cl, se ha demostrado que disminuye la producción de Aß 14. gamma-secretasa inhibición o nocaut o presenilina conduce a la acumulación de APP-FASC en el lisosoma 15-17. Por otra parte, la interrupción de APP endocitosis disminuye la producción de Aß de 18-20.

A pesar de la importancia del Golgi como una estación de clasificación para las proteínas y las proteínas reciclados desde el sistema endosomal / lisosomal nacientes, el tráfico intracelular de APP no se ha estudiado en detalle 21. Trabajos recientes han demostrado que la APP puede ser reciclado a la red trans-Golgi (TGN) a través de la interacción con el complejo retromer. Regulación a la baja del complejo retromer disminuye la producción de Aß 8,22-24. Sin embargo, la salida de APP desde el Golgi no ha sido bien estudiado.

Mientras que después de la endocitosis de las proteínas de la superficie celular, tales como el receptor de transferrina, son fácilmente etiquetados y seguido, tras el tráfico de proteínas intracelulares es más difícil. De hecho, pocas proteínas han tenido su tráfico intracelular fotografiada. El advenimiento de las etiquetas de proteínas fluorescentes, tales como foto-activable-GFP (paGFP), ha proporcionado nuevas herramientas para examinar el tráfico intracelular. Photo-activable-GFP es una forma de GFP que es casi invisible después de la síntesis, pero desarrolla verde fuerte (GFP) de fluorescencia después de ser activado por luz láser 413 nm y esta señal es estable por día 25,26. Las construcciones utilizando paGFP se han utilizado para demostrar el tráfico intralisosomal de la proteína lisosómica proteína de membrana 1 (LAMP1) 25, la entrega de la superficie celular del virus de estomatitis vesicular glicoproteína (VSVG, un marcador de la ruta secretora) 27, y el volumen de los peroxisomas 28 y 29 autofagosomas.

Con el fin de visualizar la clasificación de APP desde el TGN en células vivas, hemos diseñado plásmido que expresa los últimos 112 aminoácidos de APP acoplados a la foto-activable (paGFP) en el C-terminal (referido como βAPP-paGFP) 30. También hemos realizado estos experimentos con APP de longitud completa y ha logrado resultados similares; el constructo ΒAPP se utiliza aquí, ya que proporciona imágenes más brillantes. A continuación, la foto-activación y# 946; APP-paGFP sólo en el TGN, como demarcada por el TGN marcador galactosiltransferasa (GalT). Aunque APP ha sido etiquetado con paGFP para visualizar el transporte axonal rápido de la APP y el aclaramiento de la región perinuclear, esta es la primera demostración de tráfico de APP de un compartimento a otro cuidadosamente definido 11,31,32. Aquí, demostramos exacta foto-activación dentro del TGN y la salida de APP en compartimentos de bajada y posterior escisión y el visto bueno de los lisosomas 30. La foto-activación precisa dentro del Golgi es ampliamente aplicable a otros sistemas de proteínas.

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Protocolo

1. célula de recubrimiento y transfección

  1. En una campana de cultivo celular, placa ~ 300,000 a ~ 500.000 SN56 células (una especie de regalo del Dr. Jane Rylett) en una placa de 35 mm confocal con fondo de cristal y cubrir con los medios de comunicación antes de la transfección (medio Eagle modificado por Dulbecco, DMEM, suplementado con 10% FBS).
  2. Se incuban las células durante la noche a 37 ° C en un 5% de CO 2 incubadora a proliferar.
    Nota: Las células deben ser aproximadamente 50% -70% confluentes antes de la transfección.
  3. En una campana de cultivo de células, las células transfectar con plásmidos que expresan una proteína fluorescente etiquetados TGN marcador (galactosiltransferasa acoplado a Cyan Proteína Fluorescente, GalT-PPC), una proteína fluorescente etiquetada marcador compartimento (en este caso, lisosoma asociada proteína de membrana 1, LAMP1, etiquetadas con mRFP), y la proteína de interés etiquetado con paGFP (βAPP-paGFP). (Estos constructos se han descrito previamente 30)
  4. Se incuban las células con reactivo de transfección de ADN y el plásmido fo 24 horas a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%. Utilice una proporción de ~ 2 g de ADN a 5 l de agente de transfección (por ejemplo, Lipofectamine 2000) para la citotoxicidad mejor equilibrio y la eficiencia de transfección. Las concentraciones reales pueden necesitar ser optimizada para diferentes plásmidos. En los experimentos descritos aquí, utilizar 1 g / plato confocal de βAPP-paGFP, 0,3 mg / placa confocal de LAMP1-mRFP, y 0,2 g / plato confocal de GalT-PPC.
    Nota: La cantidad de plásmido utilizado dependerá de la eficacia de transfección.
  5. Para las líneas de células neuronales: Después de la etapa 1.4, en una campana de cultivo de células, retirar el medio de transfección pre-y diferenciar células SN56 en 2 ml de DMEM suplementado con 0,1% de penicilina / estreptomicina con 1 mM dibutiril AMP cíclico (dbcAMP) durante 24 horas.

2. Microscopio Preparación Etapa

  1. Pre-caliente-buffer fosfato salino (PBS) y solución salina equilibrada de Hank (HBSS) a 37 ° C. Platina del microscopio de calentamiento antes de imaging a 37 ° C.
  2. Lavar las células dos veces con PBS, para eliminar los medios de diferenciación y reemplazan con 2 ml de HBSS a 37 ° C. Coloque las células en fase de microscopio calentado a 37 ° C.
    Nota: Las células son viables por aproximadamente 1,5-2 horas en HBSS.
  3. Permitir 5-10 minutos para la temperatura de la placa confocal se equilibre con la platina del microscopio.

3. Foto-activación de regiones de interés sobre el aparato de Golgi

  1. Con el ocular del microscopio, encontrar células transfectadas con GalT-PPC, LAMP1-mRFP y βAPP-paGFP.
    1. Utilice una lente de inmersión en aceite con una gran ampliación (es decir, 63X o 100X). Para la conformación visual de fluorescencia, utilice un conjunto de filtros capaces de visualizar FITC (por PPC y la fluorescencia de GFP) y rodamina (por mRFP fluorescencia).
  2. Establezca la rebanada confocal para cada canal a 1 micras. Tome una imagen de baja resolución.
  3. Recortar para imagen sólo la célula de interés.
  4. Usando el botón de ajuste, ajuste manualel plano focal a la mitad de la célula. Esta es típicamente la parte de la célula donde el núcleo es la más grande.
  5. Dibujar 3-5 Regiones circulares de Interés (ROI) dentro del TGN (GalT-PPC fluorescencia).
    1. Para dibujar regiones de interés (es decir, en el programa Zeiss LSM), seleccione el botón 'Editar ROI' en la consola de comandos.
    2. Seleccione el botón ROI circular.
    3. Haga clic y arrastre sobre la GalT-PPC regiones positivos de la célula.
      Nota: Los paquetes de foto-blanqueadores para muchos microscopios tienen esta capacidad.
  6. Tome una imagen de la célula con el superpuesto ROIs. Guardar una copia de las regiones de interés para su posterior consulta.
    1. Para guardar el rendimiento de la inversión a la imagen, seleccione el botón 'Macro'.
    2. Pulse el botón 'Load' para iniciar el 'CopyRoisToOverlay' (ruta de archivo: c: /AIM/Macros/AdvancedTimeSeries/Utility.lvb).
      Nota: Un microscopio confocal equipado con 475 a 525 nm (PPC) banda de paso (BP), un 500-530 nm BP (GFP),y se requieren unos 560 nm pase largo (LP) los conjuntos de filtros. También se requiere un láser de argón para 458 nm y 488 nm de emisión y un láser de HeNe para la emisión de 540 nm.
  7. Puesta en marcha del microscopio para un curso de tiempo de lejía.
    1. Ajuste el diodo láser (25 mW 405 nm láser) a la máxima potencia.
      Precaución: El exceso de foto-activación podría llevar a la foto-toxicidad o daño a las membranas celulares. Utilice protección para los ojos para evitar daños en la retina.
    2. Puesta en marcha del microscopio para 120 ciclos de formación de imágenes.
      Nota: Un ciclo de imagen consiste en el blanqueo en el rendimiento de la inversión y la imagen de toda la célula. Este es un curso de tiempo lejía.
    3. Ajuste el microscopio para blanquear (foto-activación) sólo el ROI por 20-30 iteraciones después de cada imagen. El tiempo para la imagen y la lejía una imagen variará. Establecer un retardo de tiempo entre las imágenes de manera que cada ciclo es de aproximadamente 30 seg.
      Nota: La parte de la imagen de cada ciclo dura aproximadamente 15 a 30 segundos dependiendo del tamaño de la imagen. El blanqueo para cada ROI es de unos 50 ms. El blanqueo de los 4 regiones de interés para 20 iteraciones se llevará a 4 segundos al final de cada ciclo de lejía / imagen.
  8. Empieza el curso temporal de lejía.
  9. Apagar el blanqueo después de 15 min (30 ciclos de formación de imágenes y blanqueo), pero seguir capturando imágenes de la célula.
    Nota: El tiempo de 0 a 15 minutos es el periodo de 'pulso'.
  10. Continuar capturar imágenes durante 45 minutos (sin blanquear), seguir la liquidación de βAPP-paGFP.
    Nota: El tiempo de 15 a 45 minutos es el periodo de 'persecución'.
  11. Utilizando el método de análisis descrito en el paso 6, co-localizar la proteína de interés (en este caso, βAPP-paGFP) con el compartimento de interés (en este caso, LAMP1-mRFP) haciendo superficies a cada canal.

4. Determinar el compartimiento de Downstream

  1. Para determinar si los lisosomas (en estos experimentos) son el compartimiento final, añadir inhibidores de la proteasa-membrana permeable para causar proteínas se acumulen en el lisosoma.
    1. Para βAPP, utilice 0,5 M L685, 458 (inhibidor de la γ-secretasa específica) durante la noche o la cloroquina 100 micras (deacidifies lisosomas) durante 30 min antes de formación de imágenes.
  2. Encuentra células y fotoactivar como en el paso 3,1-3,8.
  3. Image la célula por un adicional de 45-min (sin foto-activación) para determinar dónde βAPP-paGFP se acumula en ausencia de la escisión.
  4. Analizar la entrega de la proteína a los lisosomas (u otro compartimiento de corriente abajo) y el aclaramiento posterior de acuerdo con el método descrito en el paso 6.

5. Asegurar la precisión de Photo-activación en el aparato de Golgi

  1. Calentamiento HBSS a 37 ° C.
  2. Preparar una solución de 2 ml, por cada placa confocal para obtener imágenes, de 66 M nocodazole (tratamiento) o DMSO (control) en HBSS.
    1. Para una placa confocal, pipeta 2 ml de HBSS 37 ° C y añadir 7,96 l de nocodazol de una población de nocodazol 16.60 mM.
    2. Como control tanlución, pipeta 2 ml de HBSS 37 ° C en un tubo de 2 ml y añadir 7,96 l de DMSO.
  3. Se incuban las células en HBSS con nocodazol o DMSO durante 5 min antes de formación de imágenes.
  4. Encuentra las células como en el paso 3.1.
  5. Antes de fotoactivación, preparar el microscopio para tomar un Z-pila después del período de la foto-activación.
    1. Haga clic en el botón 'Z Stack'. Comenzar a escanear utilizando XY rápida.
    2. Ajuste el plano focal con la perilla de ajuste microscopio para la parte superior de la celda. Pulse 'Marcos Primera' para establecer la primera posición en la pila.
    3. Ajuste el plano focal con la perilla de ajuste microscopio para la parte inferior (la más cercana al vidrio) de la célula. Pulse 'Marcos Última' para establecer la última posición en la pila.
    4. En el panel de pila Z, pulse el botón 'Z seccionar'. Ajuste el 'Intervalo' a 1 micras.
      Nota: Para obtener una resolución espacial más alta pila de un intervalo de pila más pequeña, pero más imágenes tendrán quetomarse alargar el período de formación de imágenes para la pila.
  6. Bleach las células, tal como se describe en el paso 3/7 a 3/8. Foto desactivar e imagen desde 0 min y 15 min (30 cuadros).
  7. Deje de imagen después de 30 marcos. Inmediatamente guardar una imagen del vídeo.
    Precaución: Algunos microscopios pueden sobrescribir primer video si no se guarda antes de iniciar una segunda secuencia de imágenes.
  8. Después de guardar el video, adquirir de inmediato una Z-pila, utilizando los parámetros desde el paso 5.5.
  9. Co-localizar βAPP-paGFP con GalT-PPC (u otro marcador de Golgi), como se describe en el paso 6.
    Nota: PPC fotoblanqueadores rápidamente y puede que no sea visible por el final del período de formación de imágenes. Colocalización puede que no sea posible con la GalT-PPC. Si se requiere colocalización, mRFP utilizar para etiquetar GalT.

6. Vesícula Filtrado y Colocalización

  1. Utilice un programa de análisis (por ejemplo Imaris) para hacer superficies del compartimento (por ejemplo LAMP1-mRFP) y una o proteínaf interés (por ejemplo βAPP-paGFP).
  2. Introduzca la sección 'Supera' del programa de análisis haciendo clic en el botón Surpass en la barra de menú superior.
  3. Seleccione el botón Asistente de superficie en la parte superior de los más panel izquierdo (5ª botón desde la izquierda).
  4. Seleccione un canal para filtrar vesículas (es decir, la fluorescencia βAPP-paGFP, proteína de interés).
  5. Realizar sustracción de fondo mediante la presentación del diámetro de la mayor de la vesícula en el campo para el asistente y pulse siguiente. El programa de análisis selecciona automáticamente - basado en un umbral derivado de la vesícula más grande en el campo - un área en el canal de interés.
    1. Para ajustar manualmente el fondo umbral para refinar la selección si es necesario.
  6. En la parte inferior de la pantalla de selección de umbral, compruebe la opción 'tocar objetos divididos' para separar las superficies combinado.
    Nota: Si muchas vesículas están estrechamente agrupados ajuntos, el grupo voluntad programa de análisis de estos objetos en una superficie.
    1. Elija 10-15 vesículas representativas y calcular el diámetro medio de vesículas y escriba el resultado en el asistente.
  7. Refinar los puntos de arranque seleccionados aumentando o disminuyendo el umbral en "Calidad" (intensidad del canal en el centro de cada mancha).
    Nota: Las superficies del canal de interés se creará. El perfeccionamiento de las superficies seleccionadas se puede realizar en este momento. Vesículas umbral basado en el número de píxeles en cada vesícula.
  8. Máscara del canal original con esta superficie. Para enmascarar, seleccione la cuarta pestaña de la izquierda en el asistente de creación de superficies (lápiz).
  9. Seleccione 'Máscara All'. Se creará un nuevo canal con las vesículas de interés.
    Nota: Durante el proceso de la máscara, se ofrece la opción de duplicar el canal original. Seleccione esta opción si los datos originales necesita ser salvado.
  10. Repita steps 6.1 a 6.7 para el canal sin filtrar (es decir LAMP1 mRFP, compartimiento).
  11. En la barra de herramientas superior, seleccione la herramienta de colocalización.
    1. En el panel superior, como aparezcan los histogramas de los canales que se colocalized, seleccionar los canales enmascarados de reciente creación.
    2. Seleccione todos los datos disponibles. Hay píxeles oscuros que a veces se presente después del análisis. No seleccione estos píxeles en el histograma, van a sesgar los resultados.
    3. En el panel de la derecha, seleccione 'Construir Coloc Channel'. Esto crea un nuevo canal que contiene sólo los píxeles colocalized. Los datos estarán en el mismo panel bajo el botón 'Estadísticas Channel'. Los datos se pueden exportar como un archivo CSV.
    4. Utilice la estadística 'Porcentaje de material colocalized'. Esta opción tiene en cuenta la intensidad de los píxeles y el tamaño del objeto.

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Resultados

Los resultados típicos muestran βAPP dejando el TGN y parece tráfico rápidamente a LAMP1 (Figura 1a y b). Durante el período de fotoactivación, las vesículas se pueden ver saliendo el aparato de Golgi con destino a los lisosomas (Figura 1b). Sin tratamiento inhibidor, paGFP fluorescencia será visible en los lisosomas mientras que hay foto-activación en el TGN. Después de parar la fotoactivación, la βAPP-paGFP se elimina rápidamente de la lisosoma (comparar Figura

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Discusión

Esta técnica se describe la precisión de foto-activación de las proteínas de membrana etiquetados con paGFP en el TGN para visualizar su posterior tráfico y escote. Mientras paGFP fue creado hace una década 25, este es el primer ejemplo de la foto-activación precisa para seguir el tráfico de proteínas nacientes en los diferentes compartimentos aguas abajo. Estudios anteriores utilizando APP-paGFP construye foto activada una región peri-nuclear de la célula, que fue considerado como el Golgi 11. Sin...

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Divulgaciones

Los autores no tienen intereses financieros en competencia o conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por una subvención del Instituto Canadiense de Investigación en Salud MOP 82890 a SHP. Los autores desean agradecer a G.H. Patterson y J. Lippincott Schwartz por la construcción de paGFP. Las células SN56 fueron un regalo de la Dra. Jane Rylett.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placas de cultivo con fondo de vidrio de 35 mm MatekP-35G-1.5-20-C
Solución salina tamponada con fosfato de DulbeccoLife Technologies14190-144
Solución salina equilibrada de HanksLife Technologies14025-092
Lipofectamina 2000Life Technologies11668019
Águila modificada de DulbeccoMedium Life Technologies11995-092
Penicilina/estreptomicinaLife Technologies15140-122
dibutiril cíclico AMPSigma D0627
Calor en suero fetal bovino activadoLife Technologies 10082147
Inserto de platina de microscopía calentado PPeCon GmbH
Tempcontrol 37– 2 microscopio digital de barridoPeCon GmbH
Zeiss LSM-510 META de 2 canales Carl Zeisscon diodo láser, láser de argón y láser HeNe1
Zeiss 63X 1.4 lente de inmersión en aceite de apertura numéricaCarl Zeiss
L685, 458 EMD Millipore565771disuelto en DMSO
colorquina SigmaC6628 disuelto en agua
NocodazolSigmaM1404disuelto en DMSO
Dimethyl sulfoxide Sigma472301
Imaris Plano de bitscon paquete de colocalización 
láser

Referencias

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