Fotoactivado Localización Microscopía con bimolecular fluorescencia Complementación (BiFC-PALM)

Andrew Nickerson; Tao Huang; Li-Jung Lin; Xioalin Nan

doi:10.3791/53154

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Fotoactivado Localización Microscopía con bimolecular fluorescencia Complementación (BiFC-PALM)

9.6K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/53154

⸱

22 de diciembre de 2015

Andrew Nickerson¹^,²^,³ , Tao Huang¹^,²^,³ , Li-Jung Lin¹^,²^,³ , Xioalin Nan¹^,²^,³

¹Department of Biomedical Engineering, Oregon Health and Science University, ²Knight Cancer Institute, Oregon Health and Science University, ³OHSU Center for Spatial Systems Biomedicine, Oregon Health and Science University

En este artículo

Resumen

Las interacciones proteína-proteína se visualizan en células con resolución espacial nanométrica mediante la combinación de complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC) con microscopía de localización fotoactivada (PALM). Aquí se describe el uso de BiFC-PALM para obtener imágenes de las interacciones Ras-Raf en células U2OS para visualizar la agrupación y difusión a nanoescala de complejos Ras-Raf individuales.

Resumen

Las interacciones proteína-proteína (PPIs) son eventos moleculares clave para la biología. Sin embargo, sigue siendo un desafío visualizar IBP con suficiente resolución y sensibilidad en las células porque la resolución de la microscopía óptica convencional está limitada por difracción a ~ 250 nm. Al combinar la complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC) con la microscopía de localización fotoactivada (PALM), los PPI se pueden visualizar en células con sensibilidad de una sola molécula y resolución espacial nanométrica. BiFC es una técnica comúnmente utilizada para visualizar IBP con contraste de fluorescencia, que implica la división de una proteína fluorescente en dos fragmentos no fluorescentes. PALM es una técnica reciente de microscopía de superresolución para obtener imágenes de muestras biológicas a escala nanométrica y de una sola molécula, que utiliza sondas fluorescentes fototransformables como las proteínas fluorescentes fotoactivables (PA-FP). BiFC-PALM se demostró dividiendo PAmCherry1, un PA-FP compatible con PALM, por su naturaleza monomérica, buen brillo de una sola molécula, alta relación de contraste y utilidad para las mediciones estequiométricas. Cuando se divide entre los aminoácidos 159 y 160, PAmCherry1 se puede convertir en una sonda BiFC que se reconstituye eficientemente a 37 °C con alta especificidad para los IBP y baja reconstitución inespecífica. La interacción Ras-Raf se utiliza como ejemplo para mostrar cómo BiFC-PALM ayuda a sondear las interacciones a escala nanométrica y con una resolución de una sola molécula. Su difusión también se puede rastrear en células vivas utilizando el seguimiento de una sola molécula (smt-) PALM. En este protocolo, se discuten los factores a tener en cuenta al diseñar las proteínas de fusión para BiFC-PALM, se explican los pasos de preparación de la muestra, adquisición de imágenes y análisis de datos, y se muestran algunos resultados ejemplares. Al proporcionar una alta resolución espacial, especificidad y sensibilidad, BiFC-PALM es una herramienta útil para estudiar los IBP en muestras biológicas intactas.

Introducción

Las interacciones proteína-proteína (IBP) son fundamentales para la biología ¹ y están estrictamente regulados por mecanismos espacio-temporales en muchas escalas de tiempo y longitud. Los estudios sobre la señalización celular en la membrana celular, por ejemplo, han puesto de manifiesto compartimentos espaciales dinámicas, a nanoescala que facilitan IBP específicos y procesos celulares ^2. Por lo tanto, la capacidad para sondear los IBP en los sistemas biológicos con suficientes resoluciones espaciales y temporales, una alta especificidad y alta sensibilidad es clave para lograr una comprensión mecanicista de la biología.