Mapeo óptico de Intra-retículo sarcoplásmico Ca 2 + Y potencial transmembrana en el corazón de conejo perfundidos Langendorff

Resumen

En este artículo se describe el protocolo detallado y equipos necesarios para el mapeo óptico dual de potencial transmembrana (V _m) y libre retículo intra-sarcoplásmico (SR) Ca ²⁺ en el corazón de conejo perfundidos Langendorff. Este método permite la observación directa y la cuantificación de V _m y SR Ca ²⁺ dinámica en el corazón intacto.

Resumen

< clase p = 'jove_content'>El manejo del retículo sarcoplasmático (SR) Ca²⁺ juega un papel clave en el acoplamiento normal de excitación-contracción y se sabe que el manejo aberrante de SR^{Ca 2+} juega un papel importante en ciertos tipos de arritmia. Debido a que las arritmias son fenómenos emergentes espacialmente distintos, deben investigarse a nivel tisular. Sin embargo, los métodos para sondear directamente SR Ca²⁺ en el corazón intacto siguen siendo limitados. Este artículo describe el protocolo para el mapeo óptico dual del potencial transmembrana (V_m) y el intra-SR libre [Ca²⁺] ([Ca²⁺]_SR) en el corazón de conejo perfundido por Langendorff. Este enfoque aprovecha el indicador de Ca²⁺ de baja afinidad Fluo-5N, que tiene una fluorescencia mínima en el citosol donde el [Ca²⁺] ([Ca²⁺]_i intracelular) es relativamente bajo, pero exhibe una fluorescencia significativa en el lumen SR donde [Ca²⁺]_SR está en el rango milimolar. Además de revelar las características espaciales de SR Ca²⁺ a través de la superficie epicárdica del corazón, este enfoque tiene la clara ventaja de la monitorización simultánea de V_m, lo que permite investigar la relación bidireccional entre V_m y SR Ca²⁺ y el papel de SR Ca²⁺ en los fenómenos arritmogénicos.

Introducción

El mapeo óptico dual del Ca²⁺ intracelular y el potencial transmembrana (V_m) en el corazón intacto perfundido por Langendorff se ha convertido en un pilar de las investigaciones en electrofisiología cardíaca, incluidos los mecanismos de arritmia y el acoplamiento excitación-contracción^1-4. Este enfoque ha proporcionado un conocimiento sin precedentes sobre la electrofisiología normal y anormal y, lo que es más importante, sobre la relación bidireccional entre V_m y Ca²⁺ intracelular. Sin embargo, el mapeo óptico de Ca²⁺ intracelular con indicadores fluorescentes de alta afinidad (como Rhod-2 y Fluo-4) solo informa sobre cambios masivos en Ca²⁺ intracelular y no puede distinguir si estos cambios se deben al flujo, liberación y recaptación de Ca²⁺ transmembrana en las reservas intracelulares o, en la mayoría de los casos, a alguna combinación de ambos. Además, los indicadores de Ca²⁺ de alta afinidad tienen una cinética de encendido y apagado lenta y es posible que no informen con precisión de cambios rápidos en la concentración de Ca^{2+ 5}.

Cada potencial de acción desencadena un aumento en el Ca²⁺ intracelular, conocido como el Ca²⁺ transitorio intracelular (CaT). En el corazón de los mamíferos, aproximadamente el 70-90% del CaT total se debe a la liberación de Ca2⁺ del retículo sarcoplásmico (SR) a través de la apertura de los receptores de rianodina (RyRs)⁶. Dentro de la RS, aproximadamente la mitad del total de Ca²⁺ se une a la calsecuestrina (CSQ) y otros tampones intra-SR⁷, que desempeñan un papel importante en la homeostasis de la SR Ca^{2+ 8,9}. La cantidad de SR Ca²⁺ libre dicta la fuerza impulsora para la liberación de SR Ca²⁺, así como la activación de RyR y, por lo tanto, tiene un impacto significativo en el CaT intracelular. Además, las alteraciones en la liberación o recaptación de SR Ca²⁺ pueden, a su vez, afectar a V_m a través del intercambio electrogénico Na⁺-Ca²⁺, lo que puede tener consecuencias arritmogénicas. Por lo tanto, además de la CaT, la monitorización de SR Ca²⁺ libre puede proporcionar información importante sobre la disfunción contráctil y electrofisiológica.

En los últimos años, los investigadores han logrado avances significativos en la monitorización de SR Ca²⁺ en miocitos cardíacos aislados y desde una sola ubicación en el corazón intacto. Uno de estos métodos requiere pulsos rápidos de cafeína para abrir RyRs y el contenido de SR Ca²⁺ se infiere o calcula a partir del aumento inmediato de Ca²⁺¹⁰ intracelular. Otro enfoque intrigante utiliza indicadores de Ca²⁺ de baja afinidad, como Fluo-5N¹¹ o Mag-Fluo4¹², que se unen a SR Ca²⁺ libre. Estos indicadores tienen constantes de disociación (K_d) en el rango de 10 a 400 μM y, por lo tanto, exhiben una fluorescencia mínima en el citosol en comparación con el lumen SR, donde la concentración de Ca²⁺ ([Ca²⁺]_SR) está en el rango milimolar. Utilizando indicadores de Ca²⁺ de baja afinidad, se han investigado varios aspectos del ciclo de Ca²⁺ de SR a nivel del miocito aislado, incluida la liberación fraccional de Ca²⁺ de SR y los mecanismos de alternancia de Ca^{2+ 13,14}. Sin embargo, para comprender completamente la naturaleza heterogénea del ciclo de SR Ca²⁺ en el corazón intacto y el papel de SR Ca²⁺ en fenómenos arrítmicos espacialmente distintos, se requieren métodos para obtener imágenes de SR Ca²⁺ a través de la superficie epicárdica del corazón intacto¹⁵.

Este artículo describe la metodología para el mapeo óptico dual de SR Ca²⁺ y V_m libres en el corazón de conejo intacto perfundido por Langendorff con el indicador de Ca²⁺ de baja afinidad Fluo-5N. Además de revelar las características de SR Ca²⁺ espacialmente a través de la superficie epicárdica del corazón, este enfoque tiene la ventaja de la monitorización simultánea de V_m, lo que permite investigar la relación bidireccional entre V_m y SR Ca²⁺.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California, Davis, y se adhirieron a la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio publicado por los Institutos Nacionales de Salud.

1. Preparación

1. Prepare dos concentrados (25X) los stocks de solución de Tyrode modificada por adelantado y se almacena a 4 ° C: (1) de la I (en mM: NaCl 3205, _CaCl2 32,5, KCl 117.5, NaH ₂ PO ₄ 29.75, _MgCl2 26.25) y (2) de la II (en mM: _NaHCO3 500).
   1. Recién preparar la solución de 2 L Tyrode de la siguiente composición (en mM): NaCl 128,2, CaCl ₂ 1,3, KCl 4,7, _MgCl 2 1,05, NaH ₂ PO ₄ 1,19, _NaHCO3 20 y glucosa 11,1 mediante la combinación de 1840 ml de agua desionizada (DI) agua, 80 ml Stock I, 80 ml de Stock II, y 4 g de glucosa. No mezclar directamente de la I y II de la; añadir elm a 1840 ml DI para evitar la precipitación.
2. Preparar la solución madre del desacoplador blebbistatin excitación-contracción en 10 mg / ml en anhidro di-metilsulfóxido (DMSO) con antelación y almacenar la solución madre a 4 ° C.
3. Preparar soluciones madre de colorantes fluorescentes: (1) RH237 sensibles al voltaje colorante (1 mg / ml en DMSO) y (2) indicador de calcio de baja afinidad Fluo-5N AM (2 mg / ml en DMSO) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Utilice los preparativos de inmediato para evitar la descomposición, con la consiguiente pérdida de capacidad de carga.
4. Cebe la recirculación sistema de perfusión Langendorff con oxigenada (95% O _{2, 2} 5% de CO) solución de Tyrode. Ajustar el flujo de O ₂ / CO ₂ para mantener el pH de la solución de Tyrode a 7,4 ± 0,05. Utilice un filtro de red en línea de nylon tejido (tamaño de poro: 11 micras) para filtrar continuamente el líquido de perfusión.
   1. Cebe el sistema de perfusión a temperatura ambiente, como la posterior loading de Fluo-5N AM se lleva a cabo a temperatura ambiente. Para Fluo-5N AM carga, utilice un pequeño volumen de líquido de perfusión de recirculación (~ 150 ml). Después de colorante de carga, utilizar un volumen mayor de líquido de perfusión (1 - 2 L, véase la Figura 1C).
5. Encienda el sistema de adquisición de datos y prepararse para la monitorización continua de la presión de ECG y la perfusión. Prepara sistema de presión-vigilancia: Conecte un transductor de presión a la línea de perfusión y monitorear la presión de perfusión con un amplificador transbridge. Ajuste la presión de perfusión basal a 0 mmHg cuando el corazón no está conectado al sistema de perfusión.
6. Alinear las cámaras de mapeo óptico para asegurar la alineación espacial entre el V _my SR Ca ^{2 + señales.}
   1. En primer lugar, se centran las cámaras mediante la colocación de un gobernante o un objeto con el texto en el plato de la perfusión. A su vez las cámaras de mapeo en un modo de visualización en directo y ajustar el enfoque hasta que el texto es nítido y claro. Adquirir una sola imagen Marco de cada cámara.
   2. Superposiciónestas imágenes y ajustar la transparencia de la imagen de arriba, así que ambas imágenes son visibles. El texto en las imágenes debe superponerse con exactitud. Si no perfectamente alineados, ajustar el ángulo del espejo dicroico o la posición de cada cámara hasta que se alinean las dos imágenes.

2. La recolección, perfusión y tinte de carga del corazón de conejo

1. Asegure el conejo en un retenedor de conejo aprobado. Profundamente anestesiar a través de una inyección intravenosa (vena marginal de la oreja) de pentobarbital sódico (50 mg / kg) y heparina (1000 IU).
   1. Cuando los conejos pantallas carecen de reflejos nociceptivos, hacer una incisión en la piel en la línea media para exponer el esternón y las costillas. Corte a través del esternón con-contundentes punta tijeras quirúrgicas desde el xifoides al manubrio. Tenga cuidado de no dañar el corazón al abrir el esternón. Difundir las costillas para exponer el corazón.
   2. Extirpar rápidamente todo el bloque corazón-pulmón cortando rápidamente todos los vasos y tejido conectivo. Immediatamente colocar el bloque corazón-pulmón en solución enfriada con hielo de Tyrode.
2. Localice la aorta para la perfusión retrógrada. Cortar la aorta ascendente proximal a las tres ramas del cayado aórtico. Canular la aorta a una cánula de 8 G conectado al sistema de perfusión. Use un pedazo de sutura USP 0 seda para asegurar la aorta en la cánula.
3. Diseccionar cuidadosamente la tráquea, los pulmones y la grasa epicárdica del corazón. Con un fuerte pinzas y tijeras de disección, localizar la válvula mitral y cuidadosamente dañar o quitar un folleto para evitar la congestión de la solución en el ventrículo izquierdo.
4. Sumergir el corazón en la cámara de perfusión con camisa de vidrio horizontalmente con la superficie anterior del corazón hacia arriba para formación de imágenes. Fije la cánula a una pieza de Sylgard con los pernos en forma de U en la parte inferior del plato de silicio para evitar el movimiento del corazón durante el mapeo (Figura 1D). Si lo desea, inserte un alfiler pequeño insecto en el ápice del corazón por stabilización.
5. Posición electrocardiograma (ECG) electrodos en el baño en el lado derecho e izquierdo del corazón. Sumergir totalmente los electrodos en el baño y asegurarse de que no están en contacto con la superficie del corazón para proporcionar un ECG volumen realizado análoga a una configuración de derivación I. Verifique un plomo normal, me ECG morfología. Ajuste el flujo (25 - 35 ml / min) para asegurar que la presión aórtica se mantiene a 60 - 70 mmHg.
6. Apague las luces de la sala y añadir 0,3 a 0,6 ml de solución madre blebbistatin (paso 1.2) a la perfusión (concentración final 10 a 20 M).
   1. Apague las luces de las habitaciones para evitar fotoinactivación de blebbistatin. Si es necesario, un pequeño proyector o faro se pueden usar para proporcionar iluminación de la tarea.
      Nota: blebbistatin es un inhibidor de la ATPasa de la miosina y un desacoplador excitación-contracción. Debido Fluo-5N carga requiere condiciones prolongados (60 min) RT (hipotermia) (consulte los pasos 2,8 - 2,10), la producción de energía cardiaca podría estar comprometida. Therefore, la adición de blebbistatin en el perfundido antes de colorante de carga puede reducir la demanda de energía ¹⁶ y eliminar los artefactos de movimiento durante las grabaciones ópticas posteriores ^17.
7. Cuando la contracción del corazón ha cesado (10 - 15 min, verificado en el registro de la presión aórtica), cambiar al sistema de perfusión de recirculación de pequeño volumen (vea el paso 1.4.1).
8. Preparar y cargar solución de carga Fluo-5N AM: Añadir 0,25 ml de Fluo-5N AM solución madre (paso 1.3) a 0,25 ml cálida 20% F127 Pluronic. Añadir 0,5 ml de solución caliente de Tyrode a la mezcla, mezclar bien y agregar al sistema de perfusión de recirculación de pequeño volumen.
9. Monitorear continuamente la presión de perfusión y ECG y ajustar el flujo si es necesario. Colorante de carga dura aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente. 45 min después de la carga ha comenzado, encienda el baño de agua circulante para comenzar a calentar el sistema de perfusión y la perfusión a 37 ° C.
10. Después de 60 minutos de Fluo-5N AM carga, switch la perfusión para el sistema de perfusión recirculante volumen más grande (véase el paso 1.4).
11. Diluir 50 l de solución de colorante sensible al voltaje de la RH237 (etapa 1.3) en 1 ml de solución caliente de Tyrode y se añade lentamente (más de ~ 5 min) en un puerto de inyección proximal a la cánula.

3. Mapeo óptico

1. Durante los momentos finales de colorante de carga, coloque el corazón y el enfoque de las cámaras de mapeo óptico para asegurar el campo apropiado de vista para el experimento.
2. Si lo desea, coloque un electrodo de estimulación bipolar en la superficie epicárdica del corazón para la estimulación.
3. Coloque un plástico o de vidrio cubierta de resbalón en la superficie de la cámara de perfusión para reducir los artefactos de movimiento en la superficie del líquido que puede estar presente debido a la recirculación del líquido de perfusión.
   Nota: Como alternativa a una hoja de cubierta, utilice una cubierta de plástico de cocina limpio 50 mm Petri.
4. Centrarse las guías de luz para iluminar uniformemente la superficie del corazón con el correoluz xcitation. Utilice azul diodo emisor de luz (LED) fuentes de luz y filtrar aún más la luz con un 475 a 495 nm filtro de banda (Figura 1).
5. Recoger fluorescencia emitida con un macroscopio y dos de metal-óxido-semiconductor (CMOS) cámaras de mapeo óptico complementarias. Dividir la luz emitida con un espejo dicroico a 545 nm.
   1. -Pass largo filtrar la fracción de longitud de onda más larga, que contiene la señal _m V, a 700 nm. De paso de banda filtrar la fracción de longitud de onda más corta, que contiene la señal SR Ca ^{2 +,} 502 a 534 nm (Figura 1A). Ajuste la frecuencia de adquisición de datos ópticos de 0,5 a 1 kHz.
6. Para cada grabación óptica, primero iniciar el protocolo de estimulación deseada, encender la luz de excitación, y recoger 1-4 seg de datos. Si lo desea, sincronizar el protocolos de estimulación y adquisición de datos.
   Nota: No es posible volver a cargar el Fluo-5N AM, por lo tanto la relación señal a ruido (SNR) se decreaSE lo largo del experimento debido a teñir fuga de la SR. Limite protocolo experimental a 1 - 2 horas para asegurar altos valores de SNR.
7. Tras el experimento, lavar el sistema de perfusión en la secuencia de agua DI, 70% de alcohol reactivo, y nuevamente con agua DI.
8. Filtra cada conjunto de datos con un filtro gaussiano espacial (radio de 3 píxeles) utilizando paquetes de software disponibles comercialmente de acuerdo con el protocolo del fabricante.
9. Si es necesario, espacialmente alinear el V _my SR conjuntos de datos Ca ^2+. Como en el paso 1.6, superponer imágenes de cada cámara y verificar que las estructuras anatómicas del corazón (es decir., Vasculatura coronaria, bordes de las aurículas o ventrículos) u otros artículos en el campo de visión (es decir, la cánula, el electrodo de estimulación) exactamente solapamiento. Si no, la alineación espacial de los conjuntos de datos es necesario.
10. Cambie la imagen transparente superior se logra en las direcciones x e y-dirección hasta que la superposición exacta, tomando nota del número de píxelesla imagen debe ser desplazado en cada dirección. Todo el conjunto de datos correspondiente a la parte superior de la imagen (ya sea V _m o SR Ca ²⁺⁾ debe entonces ser desplazado por el número determinado de píxeles en cada dirección para asegurar la alineación precisa entre el V y _m SR Ca ²⁺ conjuntos de datos.

Resultados

La figura 1A muestra un diagrama esquemático de la configuración óptica para la doble V _m y SR Ca ²⁺ mapeo. Con esta configuración, no hay separación espectral completa de la V _my SR Ca ^{2 + señales} (Figura 1B). Un diagrama del sistema de perfusión de doble bucle utilizado para Fluo-5N colorante de carga se ilustra en la Figura 1C. Figura 1D muestra la orientación horizontal del corazón en el plato de perfusión...

Discusión

Las claves del éxito Fluo-5N colorante de carga son la configuración de perfusión de recirculación de pequeño volumen, lo que permite una alta concentración Fluo-5N sin la necesidad de grandes cantidades de colorante, la longitud de tiempo de carga (1 hr), y la realización de la carga a TA. Si la carga se realiza a temperaturas fisiológicas, la actividad enzimática celular rápidamente escinde la etiqueta -AM cuando el colorante atraviesa la membrana celular, atrapando las moléculas de colorante en el citosol y no lo que...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
NaCl	Fisher Scientific	S271-1	Componente de la solución de Tyrode
CaCl2 (2H2O)	Fisher Scientific	C79-500	Componente de la solución de Tyrode
KCl	Fisher Scientific	S217-500	Componente de la solución de Tyrode
MgCl2 (6H2O)	Fisher Scientific	M33-500	Componente de la solución de Tyrode
NaH2PO4 (H2O)	Fisher Scientific	S369-500	Componente de la solución de Tyrode
NaHCO3	Fisher Scientific	S233-3	Componente de la solución de Tyrode
D-Glucosa	Fisher Scientific	D16-1	Componente de la solución de Tyrode
95% O2 5% CO2	AirGas	carbógeno	Para la oxigenación y el pH de la solución de Tyrode
Blebbistatin	Tocris Bioscience	1760	Desacoplador de excitación-contracción
RH237	Biotium	61018	Colorante sensible al voltaje
Fluo-5N AM	Invitrogen	F-26915	Indicador Ca2+ de baja afinidad; Alternativa: Invitrogen F-14204; La carga debe realizarse a temperatura ambiente
Pluronic F127	Biotium	59004	Para la carga del indicador Ca2+; Calentar hasta que la solución esté clara antes de usar
Sulfóxido de dimetilo (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	Para disolver blebbistatina y colorantes
Filtro	EMD Millipore	NY1104700	11 μ m filtro en línea
Transductor de presión	WPI	BLPR2	Para medir la presión de perfusión
Transbridge Transductor Amplificador	WPI	SYS-TBM4M	Para transducir/amplificar la señal de presión; PowerLab también se puede utilizar con los instrumentos BioAmp
PowerLab 26T	ADInstruments		para el registro continuo de señales de presión y ECG
THT Macroscope	SciMedia		Configuración óptica macroscópica. Detalles: Objetivo 0,63X (NA = 0,31), objetivo de condensación 2X, campo de visión resultante = 3,1 cm x 3,1 cm, profundidad de enfoque = ~ 1,5 mm
MiCam Ultima-L CMOS	SciMedia		Cámaras de mapeo óptico
Precision LED Spot Light Mightex		PLS-0470-030-15-S	Fuente de luz LED