Artículo de método

Ensayo de reclutamiento de células de pulmón Tumor

DOI:

10.3791/53172

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26 de febrero de 2019

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1Department of Pharmacology, Tokyo Women's Medical University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Medicine, Shinshu University

En este artículo

Resumen

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Este manuscrito describe un método para cuantificar la acumulación de células de tumor en los pulmones en un modelo animal de metástasis del tumor.

Resumen

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Para investigar los mecanismos moleculares que rigen la metástasis del tumor, se han propuesto varias pruebas utilizando el ratón como un animal modelo. Aquí, demostramos un simple ensayo para evaluar extravasación de células tumorales o micrometástasis. En este ensayo, las células del tumor fueron inyectadas en la vena de la cola, y después de un corto período, los pulmones fueron disecados y digeridos para contar las células tumorales marcadas acumulada. Este análisis omite el paso inicial de la invasión del tumor primario en el vaso sanguíneo y facilita el estudio de los acontecimientos en el lejano órgano donde se produce la metástasis del tumor. El número de células que inyecta en los vasos sanguíneos puede ser optimizado para observar un número limitado de metástasis. Se ha reportado que las células estromales en el órgano distante contribuyen a la metástasis. Así, este análisis podrían ser una herramienta útil para explorar potenciales medicamentos o dispositivos para la prevención de metástasis del tumor.

Introducción

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Metástasis del tumor responsable de alta mortalidad en enfermedades relacionadas con el cáncer. Desde el punto de vista de las investigaciones a nivel molecular, la metástasis se puede dividir en varios pasos: iniciación del tumor en el sitio del tumor primario, el crecimiento del tumor primario e invasión en alrededor de los tejidos, intravasación, circulación a través de los vasos sanguíneos , extravasación en órganos distantes y re-crecimiento del tumor. Cada paso implica diferentes conjuntos de moléculas/señales1.

Estudios hasta la fecha han estado preocupados con los eventos que ocurren en órganos distantes antes las células tumorales circulantes en la sangre, que también es conocida como la fase pre-metastásica2,3,4,5, 6. Nuestros estudios con ratones modelo revelaron que la fase pre-metastásica facilita la metástasis del pulmón mediante la creación de larga duración y bajo nivel de las respuestas inflamatorias en los pulmones. La fase pre-metastásica se caracteriza por hiperpermeabilidad de themicrovasculature y reclutamiento de células de la médula ósea derivada (BMDC), upregulation de citoquinas/quimioquinas-como moléculas incluyendo S100A8 y SAA33,4 . Se ha divulgado que esa lisil oxidasa modifica la matriz extracelular en los pulmones para reclutar BMDCs7. Otro informe ha revelado la importancia de Angpt2, MMP3 y MMP10 en la fase pre-metastásica8. En otras palabras, las intrincadas interacciones entre tumores primarios, médula ósea y órganos remotos necesitan ser comprendidos y modulada correctamente (por ejemplo, mediante el uso de fármacos que atacan las proteínas implicadas en estas interacciones) para evitar futuras metástasis9 . Para regular la fase pre-metastásica, debe primero visualizar y evaluar las intervenciones diagnósticas o terapéuticas. Aquí, Divulgamos un ensayo de reclutamiento de células de tumor de pulmón que permite el estudio de la fase pre-metastásico en los pulmones.

Las células del tumor inyectadas directamente en el vaso sanguíneo del ratón son similares a circulación las células del tumor en pacientes con cáncer, aunque puede haber diferencias entre las células cultivadas y células tumorales circulantes. Células tumorales circulantes se experimentan algunos cambios característicos cuando entran en circulación desde el tumor primario. Sin embargo, las células cultivadas pueden formar tumores en ratones inmunodeficientes cuando se inyectan en la vena de la cola. Además, en el sistema de modelo de ratón, fluorescencia marcada de las células del tumor puede utilizarse que permiten el seguimiento de estas células en el cuerpo. El comportamiento de las células tumorales en circulación es fundamental ya que determinan las consecuencias finales en cáncer pacientes10. Sangre no es un buen lugar para la supervivencia de las células de tumor2. Que necesitan para escapar del ataque por el sistema de inmune del huésped y necesita señales anti-apoptosis para evitar la apoptosis debido a la falta de soporte físico. Las células del tumor con mayores habilidades de iniciación de tumor en sitios metastáticos generan más nódulos del tumor. Si las células tumorales muestran tropismo de órgano específico, se deben observar metástasis en los órganos particulares. En este ensayo, los pasos iniciales de la cascada metastásica (crecimiento del tumor primario y la invasión) no están incluidos, y por lo tanto el foco está en la interacción entre la circulación de las células tumorales y las células del estroma (células endoteliales, células epiteliales y células de la sangre). En estudios de inyección de células de tumor convencional, los investigadores tienen que esperar hasta que los nódulos del tumor crecen hasta un tamaño tangible para detectar la metástasis. En este caso, no se puede cuantificar el número exacto de las células tumorales en los vasos sanguíneos. Además, este proceso incluye una fase de rebrote del tumor, indicando que otros factores en las células del tumor pueden afectar el resultado.

Conteo de las células del tumor bajo un estereomicroscopio de fluorescencia de etiquetado es un proceso simple. El estereomicroscopio proporciona un amplio campo de visión que puede analizarse el pulmón entero. Citometría de flujo es también una herramienta útil que al instante le da un número exacto de las células tumorales en el tejido. Conteo de células fluorescentes en el tejido bajo un microscopio confocal, es posible y muestra las imágenes más precisas de las células del tumor metastásico, pero requiere tiempo y puede dar resultados sesgados si sólo se cuenta un área seleccionada. El objetivo final de este ensayo es observar cómo fácilmente se acumulan las células del tumor en los pulmones. Como se informó anteriormente de3,4, si los pulmones están en fase de pre-metastásico debido a la señalización inflamatoria del tumor primario, las células tumorales inyectadas son propensas a acumular en los pulmones, por lo tanto, lo que implica mayor probabilidad de metástasis del pulmón. Otras condiciones (artritis reumatoide, asma, etc.) y su tratamiento con agentes antiinflamatorios (como anti-TNFα) pueden atenuar la metástasis del pulmón. Por lo tanto, concluimos que este análisis es una poderosa herramienta para evaluar la posibilidad de metástasis del pulmón.

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Protocolo

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Todos los procedimientos realizados con ratones fueron aprobados por la Universidad de medicina Animal investigación Comité de Tokio de las mujeres.

1 inyección en la vena cola de pulmón de Lewis (LLC) células

  1. Mantener las células de la LLC en DMEM suplementado con 10% FCS, en humidificado 5% CO2 incubadora a 37 ° C. Células deben contener un sistema de expresión de la proteína fluorescente (p. ej., GFP).
  2. Eliminar las células de la placa de cultivo mediante el uso de un reactivo de disociación no enzimática de la célula. Seguir el protocolo del fabricante.
  3. Recoger las células en un tubo de 15 mL y centrifugar a 400 x g por 3 minutos resuspender las células en 5 mL de PBS por pipeteo y centrifugue el tubo (400 g de x, 3 min). A continuación, eliminar el sobrenadante.
    1. Repita este paso de lavado una vez más.
  4. Después del segundo lavado, pasar las células a través de un tamiz celular (tamaño de poro de 40 μm) y resuspender en PBS a una densidad celular final de 1 x 106 células/mL.
  5. Inyectar 0.1 mL de la suspensión celular (1 x 105 células, aguja 29 G) en cada ratón C57BL/6 (varones 8-10 semanas de edad) a través de la vena de la cola.

2. aislamiento de los pulmones y contar las células bajo un estereomicroscopio de fluorescencia

  1. Eutanasia a los ratones por la inhalación de CO2 .
  2. Retirar la piel en la cara ventral del tórax con tijeras. Luego, corte las costillas y el diafragma para exponer la cavidad torácica. Ras PBS (100 cmH2O, total 15 mL) a través del ventrículo derecho con una aguja de 25 G de infusión alado y tubería.
  3. Cortar el corazón y el timo. Agarre la tráquea con el fórceps y tire hacia arriba, los tejidos conectivos alrededor de tráquea de disección con tijeras. Diseccionar a los pulmones y lavar en PBS.
  4. Separe cada lóbulo y observar bajo un estereomicroscopio de fluorescencia.

3. pulmón digestión

  1. Disolver 10 mg de colagenasa, 10 mg de dispase y 10 μg de DNasa en 10 mL de DMEM libre de suero. Filtrar con un filtro de jeringa de 0,22 μm para preparar la solución de digestión enzimática.
  2. Dados el lóbulo caudal aislado con unas tijeras. Coloque los pedazos de pulmón en una jeringa de 10 mL, seguida por el émbolo.
  3. Aspirar la solución de digestión (5 mL) en la jeringuilla tirando del émbolo. Funcionar el émbolo hacia arriba y hacia abajo hasta que el pulmón se hunde en la solución. Luego, coloque el buffer de digestión y pulmón en un tubo de 50 mL.
  4. Agitar el tubo durante 15 min a 37 ° C en un agitador recíproco (150 rpm). Los pulmones pueden ser rota durante la incubación.
  5. Pipetee hacia arriba y hacia abajo hasta que las células del pulmón se dispersan totalmente. Agite el tubo adicional 30 min a 37 ° C en un agitador recíproco (150 rpm).
  6. Pasar las células pulmonares a través de un tamiz de célula 40 μm. Desactivación de las células a 400 x g durante 3 minutos.

4. flujo Cytometry de pulmón de células

  1. Disolver 100 mg de BSA en 10 mL de PBS y el filtro a través de un filtro de jeringa 0,22 μm prepararse PBS - 1% de BSA.
  2. Retire el sobrenadante de la muestra obtenida en el paso 3.6 con una pipeta y añadir 2 mL de solución de lisis de glóbulos rojos. Entonces, giro de las células a 400 x g durante 3 min descarte el sobrenadante.
  3. Resuspender las células en 5 mL de PBS - 1% de BSA mediante pipeteo y centrifugue el tubo (400 g de x, 3 min). Deseche el sobrenadante.
    1. Repita este paso de lavado una vez más.
  4. Suspender las células en 1 mL de PBS - 1% de BSA y pasar por un colador de celular nuevo de 40 μm.
  5. Analizar las células con un citómetro de flujo para contar las células tumorales (usando filtro instalación FL1 de GFP-LLC).

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Resultados

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Los pulmones presentan muchas células GFP-LLC 2 h después de la inyección (figura 1A). Cabe señalar que los puntos fluorescentes también detectados en el filtro rojo deben ser excluidos de la cuenta del número de celular. La gran mayoría de las células LLC desaparece de los pulmones 24 h después de la inyección (figura 1).

Para confirmar el número de la GFP-LLC en los p...

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Discusión

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Pretratamiento de ratones con anticuerpos, medicamentos, una dieta alta en grasas o medio condicionado por el tumor antes de la inyección de células de tumor es posible. El paso más difícil en este análisis es la inyección de la vena de la cola. Inyección incompleta da lugar a datos no concluyentes. La vena de la cola en C57BL/6 es particularmente difícil de identificar, dando por resultado las inyecciones fallidas. Colocando el ratón sobre una almohadilla de calefacción (37 ° C) ayuda a dilatar la vena de la cola para q...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
ColagenasaSigmaC6885
DispasaGibco17105-041
Albúmina sérica bovinaSigmaA7030
DPBSGibco14190-144sin calcio, sin magnesio
Desoxirribonucleasa ISigmaDN-25traza
tampón de lisis RBCSigmaR7757
Filtro de célulasBD352340malla de 40 micrómetros
Kit de etiquetado de fluorescenciaSigmaMIN26-KIT
DMEMGibco11965-092
0.22 μ m filtro de jeringasartorius17597K
O.C.T. compuestoSakura Finetek4583
4% Paraformaldehído Fosfato SoluciónWako163-20145

Referencias

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  1. Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
  2. Kaplan, R. N., et al. VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche. Nature. 438 (7069), 820-827 (2005).
  3. Hiratsuka, S., Watanabe, A., Aburatani, H., Maru, Y. Tumour-mediated upregulation of chemoattractants and recruitment of myeloid cells predetermines lung metastasis. Nature Cell Biology. 8 (12), 1369-1375 (2006).
  4. Hiratsuka, S., et al. The S100A8-serum amyloid A3-TLR4 paracrine cascade establishes a pre-metastatic phase. Nature Cell Biology. 10 (11), 1349-1355 (2008).
  5. Tomita, T., Sakurai, Y., Ishibashi, S., Maru, Y. Imbalance of Clara cell-mediated homeostatic inflammation is involved in lung metastasis. Oncogene. 30 (31), 3429-3439 (2011).
  6. Deguchi, A., et al. Serum amyloid A3 binds MD-2 to activate p38 and NF-κB pathways in a MyD88-dependent manner. Journal of Immunology. 191 (4), 1856-1864 (2013).
  7. Erler, J. T., et al. Hypoxia-induced lysyl oxidase is a critical mediator of bone marrow cell recruitment to form the premetastatic niche. Cancer Cell. 15, 35-44 (2009).
  8. Huang, Y., et al. Pulmonary vascular destabilization in the premetastatic phase facilitates lung metastasis. Cancer Research. 69 (19), 7292-7237 (2009).
  9. Sceneay, J., Smyth, M. J., Möller, A. The pre-metastatic niche: finding common ground. Cancer Metastasis Reviews. 32 (3-4), 449-464 (2013).
  10. Castle, J., Shaker, H., Morris, K., Tugwood, J. D., Kirwan, C. C. The significance of circulating tumor cells in breast cancer: A review. The Breast. 23, 552-560 (2014).
  11. Wolf, M. J., et al. Endothelial CCR2 signaling induced by colon carcinoma cells enables extravasation via the JAK2-Stat5 and p38MAPK pathway. Cancer Cell. 22 (1), 91-105 (2012).
  12. Hiratsuka, S., et al. Primary tumours modulate innate immune signalling to create pre-metastatic vascular hyperpermeability foci. Nature Communications. 4, 1853(2013).
  13. Deguchi, A., et al. Eritoran inhibits S100A8-mediated TLR4/MD-2 activation and tumor growth by changing the immune microenvironment. Oncogene. 35 (19), 1445-1456 (2016).
  14. Ieguchi, K., et al. ADAM12-cleaved ephrin-A1 contributes to lung metastasis. Oncogene. 33 (17), 2179-2190 (2014).

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