Generación de células madre Integración de libre Humanos pluripotentes inducidas Usando derivada de pelo queratinocitos

Resumen

Este manuscrito proporciona un procedimiento paso a paso para la derivación y el mantenimiento de queratinocitos humanos a partir de pelo arrancado y la posterior generación de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) libres de integración por vectores episomales.

Resumen

Los avances recientes en la reprogramación nos permiten convertir las células somáticas en células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSCs). El modelado de enfermedades mediante el uso de hiPSC específicas del paciente permite el estudio del mecanismo subyacente de la patogénesis, proporcionando también una plataforma para el desarrollo de la detección de fármacos in vitro y la terapia génica para mejorar las opciones de tratamiento. El prometedor potencial de las hiPSC para la medicina regenerativa también es evidente por el creciente número de publicaciones (>7000) sobre iPSCs en los últimos años. Varios tipos de células de distintos linajes se han utilizado con éxito para la generación de hiPSC, incluidos los fibroblastos de la piel, las células hematopoyéticas y los queratinocitos epidérmicos. Si bien las biopsias de piel y la extracción de sangre se realizan de forma rutinaria en muchos laboratorios como fuente de células somáticas para la generación de hiPSC, la recolección y posterior derivación de queratinocitos pilosos se utilizan con menos frecuencia. Los queratinocitos derivados del cabello representan un enfoque no invasivo para obtener muestras de células de los pacientes. Aquí describimos un método simple y no invasivo para la derivación de queratinocitos a partir de cabello arrancado. También proporcionamos instrucciones para el mantenimiento de los queratinocitos y su posterior reprogramación para generar hiPSC libres de integración utilizando vectores episomales.

Introducción

El descubrimiento de las células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) ha revolucionado el campo de la medicina regenerativa, proporcionando un método viable para la generación de células madre específicas del paciente ^1-3. hiPSCs se han generado con éxito de varios tipos de células somáticas, incluyendo fibroblastos, células hematopoyéticas ^{4,5 6,7,} células epiteliales renales de orina ⁸ y queratinocitos ^9,10. Hasta la fecha, los fibroblastos de piel y células hematopoyéticas representan las fuentes de células más comúnmente utilizados para la generación de CMPI específicos del paciente. Posiblemente, esto se debe al hecho de que las biopsias de piel y la extracción de sangre son procedimientos médicos de rutina y los grandes bancos de datos genéticos de la sangre o de la piel muestras de los pacientes se han establecido en muchos países.

En contraste con las células de la sangre y los fibroblastos de la piel que requieren métodos de extracción invasivos, los queratinocitos representan un tipo de célula de fácil acceso para la generación de hiPSC. KeratinocytES son células epiteliales de queratina rica que forman la barrera epidérmica exterior de la piel y también se encuentran en las uñas y el pelo ^11. En particular, los queratinocitos se pueden encontrar en la vaina externa de la raíz (ORS) de los folículos pilosos, una capa celular externa que cubría el eje del pelo junto con la vaina radicular interna (IRS) células ^(12, Figura 1). Como colección de cabello es un procedimiento sencillo que no requiere la asistencia de personal médico, que proporciona una oportunidad para que los pacientes recogen y envían a sus propias muestras de cabello a los laboratorios, lo que facilitaría enormemente la recogida de muestras de los pacientes para la generación hiPSC. Queratinocitos epidérmicos también tienen una mayor eficiencia de reprogramación y la cinética de reprogramación más rápidas en comparación con los fibroblastos, añadiendo a las ventajas de utilizar los queratinocitos como las células de partida para la generación de hiPSC ^9,13. Además, hiPSCs también se puede generar usando otras poblaciones de células dentro del folículo piloso,incluyendo las células de la papila dérmica situados en la base del folículo piloso ^14,15.

Informes anteriores de la generación de IPSC utilizando células derivadas de pelo a menudo utilizan métodos de reprogramación retrovirales o basados ​​en lentivirus ^9,14,15. Sin embargo, estos métodos virales introducen integración genómica indeseable de transgenes extraños durante la reprogramación. En comparación, el uso de vectores episomales representa un método de reprogramación factible, no viral para generar CMPI-integración libre ^4. Hemos desarrollado previamente un método sencillo, rentable y no viral para reprogramar eficiente de queratinocitos en hiPSCs utilizando vectores episomales ^13. Aquí nos proporcionan un protocolo detallado para la generación de hiPSCs de queratinocitos derivados, incluyendo la derivación de los queratinocitos de desplumado pelo, expansión y mantenimiento de los queratinocitos y la posterior reprogramación para generar hiPSCs.

Protocolo

La colección de la muestra de cabello humano de las personas requiere la aprobación ética por el comité de ética de la investigación humana en las instituciones de acogida y debe hacerse de conformidad con las directrices institucionales.

1. Aislamiento de queratinocitos de pelo Plucked

1. Descongele la matriz extracelular solución (ECM) (es decir, Matrigel) en el hielo O / N.
2. Utilizando puntas de pipeta de pre-enfriado, añadir 200 l solución ECM de 12 ml de medio DMEM / F12 frío. Rociar una placa de 12 pocillos con 1 ml de solución ECM diluido en cada pocillo. Incubar la placa recubierta O / N a 37 ° C. Lave la placa recubierta con medio precalentado DMEM / F12 antes de su uso.
3. Recoger el pelo humano primario de la cabeza del individuo mediante la colocación de los dedos cerca de la raíz del cabello y el desplume el pelo en un movimiento rápido y suave. Revise para confirmar que cada pelo recogido contiene un folículo piloso intacto y determinar la fase de crecimiento del cabello de la ONUder un microscopio de disección (Figura 1).
   1. Suma 5-10 pelos anágena de cada individuo para extraer los queratinocitos. Proceso arrancó los pelos tan pronto como sea posible para asegurar la obtención exitosa de los queratinocitos.
      Nota: la Figura 1 ilustra la morfología de pelos en diferentes fases del ciclo de crecimiento. Cabello anágeno está en la fase de crecimiento, con una capa exterior visible del epitelio que rodea la longitud del pelo, conocido como los ORS. Por otra parte, el pelo telógeno representa cabello en la fase de reposo y no tiene una ORS visibles, pero tiene un talón de las células que cubren la raíz del cabello, conocido como el bulto telógeno.
4. Colocar las muestras de cabello en una placa Petri que contiene 10 ml de antibiótico Mix para lavar durante 5 min a RT.
5. Con unas tijeras y pinzas esterilizadas, cortar cabello excesiva, dejando un fragmento de cabello con un folículo piloso intacto y alrededor de 0,5 a 1 cm de cabello.
6. Cuidadosamente transfer fragmento 1 de pelo en cada pocillo de la placa de ECM recubiertos con el uso de fórceps.
7. Con una pipeta 1 ml, añada aproximadamente 3 gotas de reemplazo Knockout Suero (KSR) medio (~ 100-200 mu l) para las muestras de cabello.
   Nota: Mantenga los fragmentos de pelo en estrecho contacto con la superficie de la placa para permitir la unión y posterior derivación de queratinocitos. Adición de medios excesiva en este paso puede hace que los fragmentos de pelo para flotar y disminuye la probabilidad de apego pelo éxito.
8. Incubar las muestras de cabello en una incubadora a 37 ° con 5% de CO ₂ y permitir que los folículos del pelo para sujetar O / N. Al día siguiente, añadir suavemente otros 3 gotas de medio de KSR (~ 100 a 200 l) para mantener las muestras de cabello húmedo.
9. Tenga en cuenta las muestras de cabello todos los días para confirmar que los folículos pilosos se han unido con éxito. En general adjunto de los folículos pilosos es evidente dentro de 1-3 días. Pelos gruesos suelen ser más fáciles de colocar en comparación con los pelos finos, como pelos finos tienen mayortendencia a flotar que dificultan el proceso de apego.
   1. Una vez que el cabello se han unido a la placa revestida, añadir 500 l de medio de KSR al pozo. Tenga mucho cuidado al añadir el medio como muestras de cabello no puede haber bien sujeto. Desde este punto, cambiar de medios cada 2 días.
      Nota: excrecencias queratinocitos deben ser visibles desde la región ORS del fragmento de pelo después de 3-7 días (Figura 2A-B). Permita que los queratinocitos a crecer hasta 14 días antes de que pases las células como se describe en la siguiente sección.

2. Mantenimiento y pases de queratinocitos

1. Pre-coat una placa de 6 pocillos usando el Kit de matriz de revestimiento. Añadir 680 l de la dilución medio del kit a cada pocillo, seguido de 6,8 l de solución de matriz de revestimiento. Agitar la placa para asegurar la distribución uniforme de la solución matriz de revestimiento en el plato.
2. Dejar que la placa revestida incubar durante 30 min a TA. Quitarla solución matriz de recubrimiento antes de chapado de los queratinocitos.
3. Disociar queratinocitos en una sola suspensión celular con 500 l de tripsina al 0,25% por pocillo durante 2-5 min a 37 ° C. Inactivar la tripsina con 500 l de medio que contiene suero (por ejemplo, suero bovino fetal (FBS) medio) y recoger en un tubo de 15 ml estéril. Retire el fragmento de pelo con unas pinzas esterilizadas.
4. Determinar el número de células cosechadas usando un hemocitómetro.
5. Centrifugar las células durante 3 min a 200 x g. Lavar las células con PBS y centrifugación de repetición. Aspirar el PBS y resuspender el botón celular en medio de queratinocitos fresco.
6. Placa abajo 4 × 10 ⁴ queratinocitos en un pocillo de la placa de ECM-recubierto en presencia de medio de queratinocitos. Mantener los queratinocitos en una incubadora a 37 ° con 5% de CO ₂ (Figura 2C). Cambie los medios cada día las células y de paso cuando la cultura es de ~ 80% de confluencia, which puede tardar aproximadamente 2-7 días, dependiendo del número de pases y la proliferación de los queratinocitos tasa. Los queratinocitos derivados deberían ampliarse para generar suficientes existencias congeladas utilizando métodos de criopreservación lenta congelación estándar ^16.
   Nota: Las condiciones de cultivo descritas apoyan la expansión de la población homogénea de queratinocitos con típica morfología de adoquines (Figura 2C). De vez en cuando, un par de queratinocitos diferenciados, con morfología grande y plana y han perdido potencial de replicación, se pueden observar en la cultura. Caracterización de los queratinocitos se puede realizar mediante inmunotinción utilizando anticuerpos contra citoqueratina 14 como se describió previamente ^17. Líneas celulares de queratinocitos establecidos también deben ser probados para micoplasma después de 1-3 pasajes utilizando kit disponible comercialmente.

3. Generación de hiPSCs a partir de queratinocitos Uso de vectores episomales

1. Pre-capa una placa de 6 pocillos con0,1% de gelatina (2 ml / pocillo). Permitir gelatina para recubrir por lo menos durante 20 min a TA.
2. Para el experimento de reprogramación, el uso de queratinocitos no más tarde de paso 6. disocian queratinocitos en una única suspensión de células con 1 ml de tripsina al 0,25% por pocillo durante 2-5 min a 37 ° C. Inactivar tripsina con 1 ml de medio que contiene suero (por ejemplo, medios de comunicación FBS) y recoger en un tubo de 15 ml.
3. Centrifugar las células durante 3 minutos a 200 xg y volver a suspender las células en medio de queratinocitos. Plate 1 × 10 ⁵ -1,5 × 10 ⁵ queratinocitos por pocillo en una placa gelatinizada O / N.
4. Al día siguiente (día 0), compruebe la placa para asegurarse de células son 50-60% de confluencia.
   Nota: Si los queratinocitos son menos de ~ 50% de confluencia que podría no crecer bien después de la transfección.
5. En el Día 0, lleve a cabo la transfección de los vectores de reprogramación episomal en los queratinocitos, utilizando una relación de reactivo de transfección 8 l a 2 g de ADN plasmídico total.
   1. Tomar 0,5 g para cada uno de los 4 plásmidos (pCXLE-EGFP, pCXLE-hOct3 / 4-shP53F, pCXLE-HSK, pCXLE-Hul) y diluir en 100 l de medio de suero reducido (por ejemplo, OPTI-MEM).
      Nota: El plásmido pCXLE-eGFP se utiliza para supervisar las eficiencias de transfección en los queratinocitos y no se requiere para la reprogramación éxito.
   2. Añadir 8 l de reactivo de transfección con el ADN diluido. Mezclar con un movimiento rápido del tubo. Dejar que la mezcla de reacción de ADN para descansar sin perturbaciones a temperatura ambiente durante 15 min.
   3. Reemplace el medio de queratinocitos con medio fresco.
   4. Añadir con cuidado la mezcla de reacción de ADN para cultivo de queratinocitos e incubar en una incubadora a 37 ° con 5% de CO ₂ durante 4 horas.
      Nota: No se recomienda realizar prolongada transfección O / N en los queratinocitos, ya que presentan una baja supervivencia después de la transfección.
   5. Después de 4 horas después de la transfección, sustituya el medio de queratinocitos con medio fresco.
6. En el Día 1 (1 día después de la transinfección), cambiar el medio de queratinocitos y comprobar la eficacia de transfección mediante la estimación del porcentaje de células positivas EGFP bajo un microscopio fluorescente. Por lo general se observa> 60-70% de eficiencia de transfección de queratinocitos primarios que utilizan este protocolo.
7. En el Día 2, repita transfección como se describe en el paso 3.5. Dos transfecciones consecutivos típicamente alcanzar> 90% de eficiencia de transfección. Cultivo de queratinocitos suele alcanzar confluencia por el final de la segunda transfección.
   1. Preparar un plato de 10 cm de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) de alimentación para cada reacción reprogramación. Preparar alimentadores MEF mitóticamente inactivadas como se describió anteriormente ^18.
   2. Pre-coat un plato de 10 cm con 5 ml de 0,1% de gelatina durante al menos 20 min. Placa 4 × 10 ⁶ MEF mitóticamente inactivados por placa de 10 cm en medio FBS. Permitir que las células se asienten y se unen O / N en una incubadora a 37 ° con 5% de CO _2.
8. El día 3, harconferir los queratinocitos con 0,25% de tripsina como se describe en el paso 3.2 y 3.3. Resuspender los queratinocitos en medio KSR y la placa 90% de los queratinocitos a partir de 1 pocillo de una placa de 6 pocillos en un plato de 10 cm alimentador MEF con medio KSR.
9. Desde el Día 4 en adelante, cambiar el medio KSR cada día.
   1. Alternativamente después del día 18, reemplace medio de cultivo cada dos días.
      Nota: Los queratinocitos para no reprogramado dejarán de proliferar, mientras que las colonias hiPSC con límites definidos que se asemejan a las células madre embrionarias humanas (hESCs) surgirán de Día 14-21.
10. Aislar colonias hiPSC por disección manual desde el día 21 en adelante. Evite colonias hiPSC que están estrechamente agrupados juntos y sólo recogen colonias hiPSC que se separan claramente de los demás.
    Nota: colonias hiPSC pueden ser recogidos antes, pero la colonia con límites definidos pueden no ser evidentes en momentos anteriores dado el tamaño de las colonias pequeñas. Eficiencia reprogramación pueden variar entre difftambién está influenciada de queratinocitos paciente Erent, y por otros factores tales como el número pasaje o tasa de proliferación de queratinocitos.
    1. Para la disección manual de las colonias hiPSC, utilice una aguja 26G para cortar colonias hiPSC bajo un microscopio de disección. Cortar una colonia hiPSC en trozos pequeños alrededor de 300 a 600 micras de longitud. Transfiera las piezas de una colonia hiPSC en una nueva placa de alimentación MEF (2,5 × 10 ⁴ MEF / cm ²⁾ para establecer una línea clonal de hiPSCs. Inicialmente, la cultura de cada línea clonal hiPSC en un pocillo de una placa de 12 o de cultivo de órganos así los platos, a continuación, expanda al 6 de formato de placa también.
    2. Mantener líneas clonales establecidos de hiPSCs en medio KSR en alimentadores MEF. Una vez que la cultura alcanzar el 70 - 80% de confluencia con colonias hiPSC ~ 1,5 mm de diámetro, hiPSCs de paso utilizando métodos estándar enzimáticos pases (Accutase, dispasa o colagenasa IV) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
11. Caracterizar línea hiPSC establecidos para confirmar la pluripotencia y su capacidad para diferenciarse en células representativas de las tres capas germinales in vitro y / o in vivo ^13,19. También, de forma rutinaria prueba establecidos líneas hiPSC para micoplasma utilizando kits comerciales para asegurarse de que están libres de patógenos. Monitorear rutinariamente la estabilidad genómica de líneas hiPSC por cariotipo o el número de copias variación basada en matrices (CNV) análisis.

Resultados

El pelo pasa por 3 fases diferentes del ciclo de crecimiento: anágena (fase de crecimiento), catágena (la fase de regresión) y telógeno (la fase de descanso) ^20,21. El folículo del pelo anagen contiene múltiples capas de epitelio; estas capas incluyen las sales de rehidratación oral, IRS y el tallo del pelo (Figura 1). Anagen pelo finalmente se somete a la transición a la fase catágena, que se caracteriza por la apoptosis de las sales de rehidratación oral y la terminación de la diferenciació...

Discusión

Generación de hiPSCs específicos del paciente ofrece un enfoque único para el estudio de la patogénesis en los tipos de células enfermas in vitro, y también proporciona una plataforma para la detección de drogas para identificar nuevas moléculas que pueden rescatar a los fenotipos de la enfermedad. Este enfoque de modelado enfermedad utilizando hiPSCs ha dado resultados prometedores para una variedad de enfermedades, incluyendo el síndrome de QT largo, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson y la escl...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Mezcla de antibióticos:
de anfotericina B	Sigma	A2942-20 ml de 250 ng	/ml está compuesta por PBS.
1X Penicilina/Estreptomicina	Invitrogen	15140-122
PBS (-)	Invitrogen	14190-144
Reemplazo de suero knockout (KSR) medio:			El medio KSR se filtra con Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) antes de su uso. El bFGF se añade fresco al medio antes de su uso.
20% de reemplazo de suero knockout (KSR)	Invitrogen	10828-028
DMEM/F12 con glutamax	Invitrogen	10565-042
1× MEM aminoácido no esencial	Invitrogen	11140-050
0.5 veces; Penicilina/Estreptomicina	Invitrogen	15140-122
0,1 mM β-mercaptoetanol	Invitrogen	21985
bFGF (10 ng/ml, añadido fresco)	Millipore	GF003
Medio de queratinocito:
EpiLife con 60  y micro; M Invitrogen de calcio		M-EPI-500-CA
1× Suplemento de crecimiento de queratinocitos humanos (HKGS)	Invitrogen	S-001-5
Suero fetal bovino (FBS) medio:			El medio FBS se filtra con Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) antes de su uso.
10% suero fetal bovino (FBS)	Invitrogen	26140079
DMEM	Invitrogen	11995-073
0.5x Penicilina/Estreptomicina	Invitrogen	15140-122
2 mM L-glutamina	Invitrogen	25030
0.25% tripsina-EDTA	Invitrogen	25200-056
Matriz extracelular (ECM):
Matrigel	Corning	354234	Aliquot Matrigel stock y tienda en -80° C siguiente fabricante» s instrucciones. La concentración de existencias de Matrigel varía ligeramente de un lote a otro (~9 mg/ml). Recomendamos utilizar 200µ l Matrigel para recubrir una placa de 12 pocillos (~ 150 y micro; g/pozo).
Kit de matriz de recubrimiento	Invitrogen	R-011-K
Plásmidos:			Tenga en cuenta que pCXLE-eGFP solo se utiliza para monitorear la eficiencia de la transfección y no es necesario para la reprogramación.
-                  pCXLE-eGFP	Addgene	27082
-                  pCXLE-hOct3/4-shP53F	Addgene	27077
-                  pCXLE-hSK	Addgene	27078
-                  pCXLE-hUL	Addgene	27080
Reactivo de transfección Fugene HD	Promega	E231B
Gelatina (de piel de cerdo)	Sigma	G1890	Gelatina de composición al 0,1% en agua destilada. Autoclave antes de usar.
Medio sérico reducido: OPTI-MEM	Invitrogen	31985062
Accutase	Sigma	A6964-100ml
		fibroblastos embrionarios de ratón (MEF)	MEF puede ser inactivado por tratamiento con mitomicina C o irradiación como se ha descrito anteriormente 16.
Aguja de 26G	Terumo NN2613R
placa de 6 pocillos (tratamiento con cultivo de tejidos)	BD Biosciences	353046
placa de 12 pocillos (tratamiento con cultivo de tejidos)	BD Biosciences	353043
plato de 10 cm (tratamiento con cultivo de tejidos)	BD Biosciences
Dispasa	Invitrogen	17105-041	Uso a 10 mg/ml
Colagenasa IV	Invitrogen	17104-019	Uso a 1 mg/ml
Anticuerpo TRA-160	Millipore	MAB4360	Uso a 5 µ g/ml
anticuerpo OCT4	Santa Cruz	SC-5279	Uso a 5 µ g/ml
anticuerpo NANOG	R& D Systems	AF1997	Uso en 10 y micro; g/ml
Kit de detección MycoAlert	Lonza	LT07-418