La entrega de proteínas, péptidos o impermeable a las células pequeñas moléculas en células vivas por incubación con el reactivo endosomolítico dfTAT

Resumen

Describimos cómo administrar proteínas y pequeñas moléculas impermeables a las células de mamíferos cultivadas mediante un sencillo protocolo de co-incubación con un reactivo que hace que los orgánulos endocíticos se vuelvan permeables.

Resumen

Estrategias de prestación macromoleculares normalmente utilizan la vía endocítica como una vía de entrada celular. Sin embargo, el atrapamiento endosomal limita severamente la eficiencia con la que las macromoléculas penetrar en el espacio citosólico de células. Recientemente, hemos eludido este problema mediante la identificación del reactivo dfTAT, un dímero enlace disulfuro del péptido TAT etiquetado con la tetrametilrodamina fluoróforo. Hemos generado un dímero marcado con fluorescencia del péptido de penetración celular (CPP) TAT prototípico, dfTAT, que penetra en las células vivas y alcanza el espacio citosólico de células con una eficiencia particularmente alta. La entrega citosólica de dfTAT se logra en varias líneas celulares, incluyendo células primarias. Por otra parte, la entrega no afecta notablemente la viabilidad celular, la proliferación o la expresión génica. dfTAT puede entregar moléculas pequeñas, péptidos, anticuerpos, enzimas biológicamente activa y un factor de transcripción. En este informe se describen los protocolos involucrados en DFTASíntesis de T y la entrega celular. El manuscrito describe cómo controlar la cantidad de proteína entregada al espacio citosólico de las células mediante la variación de la cantidad de proteína administrada extracelularmente. Finalmente, se discuten las limitaciones actuales de esta nueva tecnología y pasos involucrados en la validación de la entrega. Los protocolos descritos deben ser extremadamente útil para ensayos basados ​​en células, así como para la manipulación ex vivo y la reprogramación de las células.

Introducción

La entrega de proteínas, péptidos o pequeñas moléculas impermeables a las células en células vivas es a menudo deseable en muchas aplicaciones biológicas o biotecnológicas (de imagen celular, ensayos funcionales, la reprogramación celular, etc.) ^{A 1-4.} Ya se han reportado muchos enfoques de entrega, incluyendo la microinyección, electroporación, o el uso de agentes de portador (por ejemplo., Péptidos penetran en las células, tales como TAT, lípidos) ^5-7. Cada técnica tiene normalmente ventajas y desventajas específicas que podrían hacer que estos enfoques adecuados para ciertas aplicaciones, pero no para otros. Problemas comune....

Protocolo

1. SPPS: CK (TMR) TATG (fTAT) Síntesis

Nota: dfTAT se produce en dos etapas: la síntesis del monómero fTAT por síntesis de péptidos en fase sólida seguida de dimerización disulfuro de bonos para formar dfTAT.

1. Swell 500 mg de resina MBHA de amida de Rink en dimetilformamida (DMF) en un recipiente de 50 ml SPPS estándar para 1 hr.
2. Realizar desprotección de Fmoc mediante la incubación de la resina protegida con Fmoc en una solución de piperidina al 20% (20% de piperidina en DMF, 10 ml (0,30 mmol). Llevar a cabo etapas de desprotección dos veces (1 x 5 min y 1 x 15 min) con una etapa de lavado usando DMF (la etapa de lava....

Resultados

Para evaluar la diferencia entre fTAT y dfTAT, células HeLa se incuban durante 1 h con cada péptido para determinar la diferencia en su localización celular. La internalización de los dos CPP de se evaluó mediante microscopía de fluorescencia. Figura 2 muestra que fTAT (20 mM) se localiza en una distribución punteada. Esta distribución es coherente con el péptido restante atrapado dentro de los endosomas. Por el contrario, la señal de fluorescencia de dfTAT (5 M) muestra una distribución homogénea en to.......

Discusión

Las células utilizadas para la entrega dfTAT no debe ser demasiado confluentes (> 90% de confluencia), ya que esto podría afectar a la eficiencia en la entrega. Las células también deben ser saludables: las células muertas en el cultivo pueden liberar fragmentos apoptóticos con la que dfTAT puede interactuar (por ejemplo, el ADN de núcleos degradados). Esto a su vez puede interferir con la eficacia del suministro y la calidad de la imagen. Las células se deben lavar a fondo para eliminar FBS antes de añadir .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Heparina	Sigma	CAS 9041-08-1
SYTOX Blue	Invitrogen	S11348
SYTOX Green	Invitrogen	S7020
nrL15 L-15 (–) cisteína	Hyclone		Pedido especial
Aminoácidos protegidos por Fmoc	Novabiochem
dfTAT			Las muestras se proporcionarán a pedido (contacto: pellois@tamu.edu)
			de bioseguridad
Microscopio de epifluorescencia invertida	Olympus	modelo IXB1	equipado con una etapa de calentamiento mantenida a 37 ° C y con una cámara Rolera-MGI Plus retroiluminada con dispositivo de carga acoplada a la multiplicación de electrones (EMCCD) (Qimaging).
37 y s° C humidificado, 5% CO2 incubadora
Sintetizador de péptidos o recipiente para preformar la síntesis

Gabinete manual de péptidos