Artículo de método

Análisis de pez cebra larvas esquelético Integridad del músculo con el colorante azul de Evans

DOI:

10.3791/53183

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30 de noviembre de 2015

 ,  ,  , 
1Program in Genetics & Genome Biology, The Hospital for Sick Children, 2Department of Molecular Genetics, The University of Toronto, 3Program in Genomics of Differentiation, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, 4Departments of Pediatrics and Neurology, University of Michigan

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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En este estudio, describimos un método sencillo para realizar el análisis de Evans Blue Dye (EBD) en larvas de pez cebra. Esta técnica es una herramienta poderosa para la caracterización de la integridad del músculo esquelético y la delineación de modelos de distrofia muscular de pez cebra, y es un método valioso para el desarrollo de nuevas terapias.

Resumen

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El modelo del pez cebra es un sistema emergente para el estudio de los trastornos neuromusculares. En el estudio de las enfermedades neuromusculares, la integridad de la membrana muscular es un determinante crítico de la enfermedad. Hasta la fecha, numerosas afecciones neuromusculares muestran fibras musculares en degeneración con integridad anormal de la membrana; Esto se observa con mayor frecuencia en las distrofias musculares. Evans Blue Dye (EBD) es un tinte vital permeable a las células que se incorpora rápidamente a las células degeneradas, dañadas o apoptóticas; Por el contrario, no es absorbido por las células con una membrana intacta. La inyección de EBD se emplea comúnmente para determinar la integridad muscular en modelos de ratón de enfermedades neuromusculares. Sin embargo, estos experimentos de EBD requieren disección y/o seccionamiento muscular antes del análisis. Por el contrario, la absorción de EBD en el pez cebra se visualiza en preparaciones vivas e intactas. Aquí, demostramos una metodología simple y directa para realizar inyecciones y análisis de EBD en peces cebra vivos. Además, demostramos una estrategia de coinyección para aumentar la eficacia del análisis de EBD. En general, este artículo de video proporciona un esquema para realizar la inyección y caracterización de EBD en modelos de pez cebra de enfermedad neuromuscular.

Introducción

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Las distrofias musculares constituyen un grupo de enfermedades musculares humanas prevalentes y heterogéneas con características histopatológicas específicas1,2. Los síntomas típicamente asociados con este devastador grupo de enfermedades incluyen debilidad muscular, degeneración muscular, pérdida de motilidad y mortalidad temprana1,3. Los principales mecanismos patológicos de las distrofias musculares son la pérdida de proteínas que estabilizan el sarcolema, anclan los complejos transmembrana y median la señalización celular a través de la membrana4-6. Por ejemplo, la pérdida completa de la proteína distrofina, una proteína primaria del andamiaje del complejo distrofina-glicoproteína, resulta en la desestabilización de la membrana muscular en la distrofia muscular de Duchenne7. Debido a que la mayoría de las distrofias musculares son el resultado de mutaciones en proteínas que participan en el enlace entre la matriz extracelular y el citoesqueleto sarcolema, una observación común a nivel celular es la pérdida de la integridad sacrolemática8,9. Esta comprensión de los principales mecanismos patológicos asociados con las distrofias musculares es el producto de numerosos años de investigación empleando sistemas de modelos animales2,10-15. Sin embargo, a pesar de los avances en el campo, todavía hay opciones terapéuticas limitadas para el tratamiento o el manejo de la gama de subtipos de distrofia. Esta limitación de las terapias viables se debe a varios factores clave: 1) la dificultad de las estrategias de terapia génica, 2) una alta frecuencia de casos de enfermedad de novo y la correspondiente falta de modelos animales traducibles, y 3) la falta de estrategias rigurosas para probar las consecuencias fisiológicas de los agentes terapéuticos putativos con medidas de resultado claras y reproducibles.

Para superar algunas de estas limitaciones, numerosos laboratorios, incluido el nuestro, están empleando el pez cebra como sistema para modelar y estudiar las enfermedades neuromusculares humanas2. Hasta la fecha, el pez cebra ha demostrado ser una herramienta valiosa en la investigación de enfermedades. El modelo de pez cebra se ha utilizado para identificar y validar nuevas mutaciones causantes de enfermedades humanas16,17, dilucidar mecanismos causantes de enfermedades no caracterizados17,18 e identificar nuevas estrategias terapéuticas12,19. Estos avances se lograron, en parte, por las fortalezas canónicas del sistema del pez cebra, como su claridad óptica, la facilidad de manipulación genética y la capacidad de reproducirse en grandescantidades. Además, el pez cebra ha demostrado ser modificable a las pruebas de detección de drogas a gran escala21, un método valioso para la identificación de nuevas terapias22-24. En lo que respecta a la investigación de enfermedades musculares, estas fortalezas se complementan con la capacidad de aislar fibras musculares esqueléticas individuales de pez cebra a través de la disociación25 y por la capacidad de examinar la organización de las miofibras in vivo utilizando el fenómeno óptico llamado birrefringencia26, que colectivamente permite una determinación rápida de la integridad muscular macroscópica. Independientemente de estas utilidades disponibles, se requiere continuamente un mayor desarrollo de herramientas para avanzar en la investigación.

Nosotros, y otros, hemos adaptado un protocolo para la inyección y el análisis de EBD en el modelo de pez cebra. La EBD es un tinte vital permeable a las células que es absorbido por las células dañadas, degeneradas o apoptóticas y luego se visualiza bajo fluorescencia27. Hasta la fecha, el análisis de EBD se ha utilizado ampliamente para analizar la integridad de la membrana muscular en modelos murinos de enfermedades del músculo esquelético y del corazón8,9,27. Sin embargo, en las preparaciones de mamíferos, el músculo recolectado generalmente requiere una sección o disección laboriosa antes del análisis. En el pez cebra, el análisis directo es posible en grandes cantidades utilizando animales vivos e intactos. En este videoartículo, demostraremos la metodología para realizar la inyección y el análisis de EBD en larvas vivas de pez cebra, con imágenes representativas de la absorción de EBD en la línea mutante de distrofia de pez cebra sapje15,28. Además, presentamos una estrategia de co-inyección que permite una mayor cuantificación de las preparaciones de EBD.

Protocolo

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1. Preparación de placas de agar de inyección (Tiempo: 45 min)

  1. Hervir 2% al 3% de agarosa en medios E3 y permita que la solución se enfríe un poco en el banco. Nota: El número de placas de inyección está preparando dicta la cantidad de agarosa necesario. Cada placa de inyección necesita aproximadamente 35 ml de la solución de agarosa.
  2. Después de hervir, deje que la agarosa se ​​enfríe hasta alcanzar la temperatura deseada (por ejemplo., 45 ° C) según las instrucciones del fabricante molde de inyección.
  3. Verter aproximadamente 35 ml de la agarosa enfriados en un plato de 100 mm.
  4. Coloque un extremo del molde de inyección preferido en la solución, luego se quedó resto del molde sobre solución de agarosa (esto ayudará a reducir la aparición de burbujas de aire).
  5. Dejar que la solución de agarosa se ​​solidifique ya sea a temperatura ambiente o 4 ° C durante aproximadamente 30 min.
  6. Use una espátula para separar un extremo del molde de la agarosa sólida. Retire lentamente el resto de la m viejo.

2. Preparación del colorante azul de Evans (EBD) Injection Mix (Tiempo: 30 min)

  1. Hacer un 1% stock de EBD en 1X solución de Ringer (NaCl mM 155; KCl 5 mM; 2 mM CaCl 2; 1 mM de MgCl 2; 2 mM Na 2 HPO 4; HEPES 10 mM; glucosa 10 mM; pH a 7,2), que se puede almacenar a temperatura ambiente.
  2. Hacer una solución de reserva de isotiocianato de fluoresceína (FITC) -dextrano MW 10.000 kDa a 25 mg / ml en solución y la tienda de 1X Ringer a -20 ° C.
  3. Preparar la mezcla de inyección diluyendo EBD a 0,1% directamente en solución madre de Stock FITC-dextrano (es decir, para un volumen de trabajo final de 100 l:. Mezclar 10 l de 1% EBD en 90 l de FITC Stock dextrano).
  4. Mezclar bien la inyección de vórtice (debe ponerse de color verde) y mantenerlo fuera de la luz directa envolviendo tubo de mezcla de inyección en papel de aluminio.

Preparación 3. EBD Inyección (Tiempo: Aproximadamente 30 min)

ent "> Nota: Protocolo funciona mejor con larvas después de la fecundación 3-7 días (DPF).

  1. Placa de inyección Pre-caliente para RT.
  2. Configurar aparato de inyección mediante la organización de micromanipulador en la placa de metal y de pie al lado del microscopio que se utilizan para la inyección. Encienda el controlador de la microinyección de aire impulsado. Nota: El sistema de inyección preferida variará por el laboratorio y no debe cambiar resultado del análisis.
  3. Volver llenar aguja de inyección con aproximadamente 2.4 l de mezcla EBD.
  4. Calibrar volumen de inyección a aproximadamente el 5 nl de mezcla EBD. Nota: Calibración Volumen de inyección dependerá de método de calibración. Una inyección de pistón accionado se puede fijar directamente a un volumen de inyección dado mientras que los inyectores de presión de gas tendrán que el volumen de inyección calibrado a través de volumen de bolo con el uso de un micrómetro.
  5. Placa de inyección húmedo con una solución de 1X Ringer y eliminar el exceso de los pozos.
  6. Larvas de Pre-tratamiento con sal metanosulfonato 0,04% de acetato de 3-aminobenzoatot (tricaína) diluido en solución de Ringer 1X para inmovilizar las larvas antes del comienzo de la inyección. Nota: Asegurar larvas son completamente inmóviles es importante ya que la inyección adecuada es difícil con cualquier movimiento residual.
  7. Coloque larvas anestesiadas en los pocillos de las placas de inyección de agar usando una pipeta de vidrio. Asegúrese de que las larvas son completamente dentro del pozo y la mentira de su lado. Nota: El número de larvas por así es hasta el experimentador.
  8. Después de larvas se colocan en los pocillos, eliminar el exceso de solución de Ringer para minimizar el movimiento larvas dentro del pozo. Deja una cantidad residual de solución para que las larvas no deshidratar.

4. Inyección pericárdico de larvas de pez cebra con EBD (Tiempo: Depende de la cantidad de inyección de larvas, que se estima 1.3 h)

  1. Coloque la placa de inyección que contiene las larvas en un microscopio de disección, donde se llevarán a cabo las inyecciones.
  2. Coloque la aguja pipeta de inyección que contieneel EBD mezcla sobre un larvas de pez cebra.
  3. Vuelva a la posición de la placa de inyección girándola para que la aguja de inyección está cerca del corazón de las larvas y de aproximadamente 45 ° ventral del eje antero-posterior.
  4. Insertar la aguja de inyección en la vena cardinal común (CCV) en la región de la vena en la porción anterior de la yema donde la vena se está convirtiendo inicialmente en la dirección dorsal (Figura 1). Nota: con un aumento de hasta 40x puede ser útil para ver claramente la CCV.
  5. Inyectar 5 nl de mezcla EBD y mantener la aguja de inyección en la posición de 5-8 segundos para minimizar la fuga inmediata de mezcla EBD. Nota: Una buena inyección tendrá coloración colorante se observa en las cámaras del corazón (Figura 1). Si mezcla EBD no se observa en el corazón, a continuación, la inyección de un 5 nl adicional de mezcla EBD puede ser suficiente para inducir la absorción de colorante. Alternativamente, el embrión puede ser desechada.
    Nota: En algunas situaciones, el corazón puede dejar de latir. Si este occurs, continuará monitoreando las larvas de 20-40 seg. Típicamente, el corazón latiendo como se reanuda el colorante se mueve a través del sistema circulatorio.
  6. Pasar a la siguiente larvas y repetir.
  7. Identificar embriones inyectados con éxito mediante la observación de la presencia de FITC-dextrano en la vasculatura inmediatamente después de la inyección (Figura 2).

5. Incubación y EBD Captación (Hora: 04.06 horas)

  1. Después se inyecta el número deseado de larvas, larvas de retorno inyecta a 1X solución de Ringer sin tricaína en placas de 100 mm.
  2. Mantenga los platos envueltos en papel de aluminio. Nota: Mantener larvas inyectado en la oscuridad aumenta significativamente las tasas de supervivencia y garantiza la mayor coherencia en la intensidad de la señal. Envolver en papel de aluminio es especialmente importante para el período de tiempo que las larvas se encuentran fuera de la incubadora.
  3. Permita que las larvas de incubar a 28,5 ° C durante 4-6 horas para asegurar la suficiente absorción EBD.

6. Visualización de EBD en el músculo (Tiempo: Depende de la cantidad de inyección de larvas y el tipo de microscopía, prevista 0,5-3 horas)

  1. Antes de la formación de imágenes, anestesiar a las larvas con 0,04% tricaína para evitar el movimiento.
  2. Ver larvas bajo fluorescencia roja para determinar si EBD absorción se produce en el músculo esquelético (Figura 3).

Resultados

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La mezcla de inyección EBD se inyectó en el CCV de mutantes homocigotos sapje y hermanos de tipo salvaje en 3 dpf. Las inyecciones que llenaron las cámaras del corazón (Figura 1B) y luego se analizaron para la inyección con éxito mediante la visualización de FITC-dextrano en la vasculatura bajo fluorescencia verde (Figura 2).

Después de un periodo de incubación de 4 horas, EBD captación fue examinado a nivel somito mediante microscopía de fluorescencia. Hermanos de tipo salvaje no mostraron fluorescencia EBD dentro de las fibras musculares visibles (Figura 3A), mientras que los mutantes homocigotos sapje mostraron EBD captación, lo que indica daños en la membrana muscular 15 (Figura 3B).

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Figura 1. mezcla de inyección Inyectar EBD en la vena cardinal común (CCV) de un embry pez cebrao. Embrión (A) no inyectados. Flecha indica la ubicación ideal para la inyección CCV. (B) la inyección exitosa en el CCV. El colorante entra en las cámaras del corazón (flecha) y comienza a ser bombeado a través de la vasculatura. (C) Una inyección CCV sin éxito dará lugar a algunos o todos el tinte de entrar en el saco vitelino del embrión (flecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2. Los embriones se pueden ordenar para inyección con éxito mediante la observación de la distribución-FITC dextrano bajo fluorescencia verde en toda la vasculatura inmediatamente después de la inyección y antes de la EBD captación.Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: EBD será absorbido por las fibras con las membranas dañadas hermanos (A) Wildtype que no muestran fluorescencia EBD en las fibras musculares.. (B) sapje mutante homocigotos con fluorescencia EBD dentro de las fibras musculares múltiples (flechas). Todas las larvas fueron inyectados con la mezcla de inyección EBD y se analizó después de un período de incubación de 4 horas a 3 dpf. Hermanos y mutantes fueron ordenados por el músculo de fibra desprendimiento antes de la inyección CCV. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

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El pez cebra se perfila como una herramienta poderosa para el estudio de 2,29 enfermedad neuromuscular. Hasta la fecha, el sistema de pez cebra se ha utilizado para validar que causan enfermedades nueva musculares mutaciones 16,17,30, dilucidar nuevos mecanismos patológicos 18, e identificar potencialmente nuevas drogas terapéuticas 12,24. Estos esfuerzos colectivos han establecido la utilidad del pez cebra para modelar enfermedades neuromusculares humanos. Sin embargo, a pesar de los avances realizados con modelos de pez cebra y mamíferos, hay opciones limitadas de tratamiento para los pacientes dentro del amplio espectro de condiciones neuromusculares. Por lo tanto, existe una gran demanda para el desarrollo de la terapia para este grupo de enfermedades devastadoras. Paralelamente a esta demanda para la terapéutica es la correspondiente necesidad de innovación experimental en curso, así como el análisis riguroso para verificar nuevos modelos animales y estrategias terapéuticas putativos.

Análisis EBD se utiliza comúnmente en modelos de ratón detejido estudio y el daño celular en el cerebro, el corazón y el músculo esquelético 27,31. Más notablemente, EBD se utiliza ampliamente en modelos de ratón de diversos subtipos distrofia muscular para mostrar la gravedad de la inestabilidad muscular membrana y dañar 8. El uso de EBD para revelar daño de la membrana muscular es un parámetro de apoyo establecer similitudes del modelo animal para el estado de enfermedad humana 9. El poder de la EBD en el ratón ha llevado a varios laboratorios, incluido el nuestro, para desarrollar y aplicar EBD a los modelos de pez cebra de enfermedad neuromuscular. Debido a la aplicabilidad de análisis EBD, esta técnica se está aplicando activamente para corroborar modelos de pez cebra para el estado de enfermedad humana 11,15,22,24,32. Las larvas con las membranas musculares dañadas tendrá EBD absorción y fluorescencia roja, por lo tanto dentro de las fibras musculares. La fluorescencia observada en el espacio entre las fibras, pero no dentro de las fibras musculares individuales también pueden ser de carácter informativo de las fibras de desprendimiento de la membrana basal en tque la ausencia de daño de la membrana, proporcionando detalles de diagnóstico útil. Análisis EBD tiene aplicación potencial más allá de la validación de modelos animales. Los esfuerzos de nuestro laboratorio han demostrado recientemente que el análisis EBD es beneficioso en la validación de nuevos fármacos potencialmente terapéuticos 24. Determinar si los tratamientos terapéuticos potenciales reducir o abolir EBD captación en modelos de enfermedades neuromusculares puede significar acción terapéutica relevante 8. Este tipo de análisis puede ayudar a establecer el mecanismo (s) de la terapéutica y amplía la aplicación del análisis EBD.

Al igual que con muchas técnicas, análisis EBD tiene varias advertencias que deben observarse durante el diseño y la práctica experimental. Por ejemplo, puede ser un reto para identificar el CCV debido a la engrosamiento del tejido con la edad. Además, es fácil dañar las larvas en la preparación antes y durante la inyección pericárdico, la reducción de los recuentos experimentales y el aumento de la necesidad de preparar un gran número de larvas.Además, el daño físico causado a las larvas durante la manipulación y la inyección podría dar lugar a falsos positivos como el músculo dañado puede tomar hasta EBD. Con el fin de superar algunos de estos obstáculos, hemos descrito una estrategia de co-inyección en este artículo de vídeo que permite la identificación fácil y fiable de las larvas con la infusión de colorante éxito inmediatamente después de la inyección y antes de posterior análisis. La controles co-inyección de FITC-dextrano para inyección éxito al permitir la confirmación de EBD en la vasculatura antes de su absorción por las fibras musculares. Esto puede ser particularmente útil como EBD fluorescencia se vuelve muy difusa en las larvas después de varias horas si no se recoge en las fibras musculares; como tal, puede ser difícil de detectar. Además, falta el CCV y la inyección de EBD en la yema o el cuerpo cavidad puede, después de la incubación, dar lugar a fluorescencia roja difusa similar a controlar embriones, sin embargo, con la reducción de la probabilidad de absorción por las fibras musculares dañadas. Colectivamente, estas cuevasats sugieren inyección EBD requiere paciencia y práctica para lograr resultados consistentes y fiables.

En total, se describe un método práctico y sencillo para realizar el análisis EBD en larvas de pez cebra. Hasta la fecha, el uso del pez cebra como modelo de sistema, sobre todo como modelo de enfermedad humana, se ha expandido rápidamente. Esta expansión se debe en parte al desarrollo continuo y la modificación de las técnicas experimentales que mejoran sobre las ventajas actuales del sistema de pez cebra. La técnica de inyección EBD ofrece una herramienta adicional y potente al arsenal de un investigador para la validación y el estudio de modelos de enfermedad del músculo del pez cebra. La aplicación en curso y la modificación de esta técnica tiene el potencial de ayudar a descubrir nuevas estrategias terapéuticas, así como mecanismos de la enfermedad que causa.

Divulgaciones

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Los autores no tienen que compiten intereses financieros u otros conflictos de intereses.

Agradecimientos

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Queremos agradecer a Trent Waugh por su asistencia técnica. También reconocemos el Departamento de Pediatría en el Hospital para Niños Enfermos y Cure distrofia muscular congénita (CMD) por su generosa financiación para este proyecto.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Isotiocianato-dextrano de fluoresceína MW 10.000SigmaFD10S
Evan's Blue DyeSigmaE2129
Sal de metanosulfonato de etilo 3-aminobenzoatoSigmaA5040
Placa de Petri de 100 mmFischerbrandFB0875712Base de molde de inyección
Capilares de vidrio de pared delgadaWorld Precision InstrumentsTW100F-4Para aguja de inyección
AgarosaBioshopAGA001Molde
microinyecciónAdaptive Science ToolsTU-1Molde de inyección
Cloruro de sodioBioshopSOD001Solución de Ringer
Cloruro de potasioBioshopPOC888Solución de Ringer
Cloruro de magnessio hexahidratadoSigmaM2670Solución de Ringer
Fosfato de sodio monobásico monohidratadoSigmaS9638Solución de Ringer
HEPESSigmaH4034Solución de Ringer
GlucosaBioBasicGB0219Solución de Ringer
Cloruro de calcioSigmaC1061Solución de Ringer
de inyección Molde de

Referencias

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