Hay una necesidad de una evaluación no invasiva de la tensión. En este trabajo se describe un protocolo simple que utiliza imágenes térmicas para detectar una respuesta significativa en la temperatura del ojo-región herrerillos silvestres a un factor de estrés aguda leve.
Artículo de método
Imágenes Térmicas para estudiar el estrés de forma no invasiva en ilimitados Birds
En este artículo
Resumen
Resumen
El estrés, un concepto central en la biología, describe un conjunto de respuestas de emergencia a los desafíos. Entre otras respuestas, el estrés conduce a un cambio en el flujo de sangre que resulta en una afluencia neta de sangre a los órganos clave y un aumento en la temperatura central. Esta hipertermia inducida por el estrés se utiliza para evaluar el estrés. Sin embargo, la medición de la temperatura central es invasivo. Como el flujo sanguíneo se redirige al núcleo, de la periferia del cuerpo puede enfriar. En este trabajo se describe un protocolo donde la temperatura corporal periférica se mide de forma no invasiva en herrerillos silvestres (Cyanistes caeruleus) utilizando termografía infrarroja. En el campo que hemos creado una puesta a punto con lo que las aves de una posición ideal en frente de la cámara mediante el uso de una caja de cebo. La cámara toma una corta grabación de vídeo térmica del ave sin perturbaciones antes de aplicar un factor de estrés leve (cerrar la caja y por lo tanto la captura de las aves), y se registra la respuesta del ave a ser atrapado. La piel desnuda de la región de los ojos es lazona más cálida en la imagen. Esto permite una extracción automatizada de la temperatura máxima del ojo-región de cada cuadro de imagen, seguido de etapas adicionales de filtrado de datos manual de eliminación de las fuentes más comunes de errores (desenfoque de movimiento, parpadeo). Este protocolo proporciona una serie temporal de la temperatura del ojo-región con una resolución temporal muy bien que nos permite estudiar la dinámica de la respuesta al estrés de forma no invasiva. Además trabajo necesita para demostrar la utilidad del método para evaluar el estrés, por ejemplo, para investigar si la respuesta de temperatura ojo-región es proporcional a la fuerza del factor estresante. Si esto se confirma, se proporciona un método alternativo valiosa de evaluación del estrés en los animales y será útil para una amplia gama de investigadores de ecólogos, biólogos de la conservación, fisiólogos a investigadores de bienestar animal.
Introducción
El estrés es un concepto central en la biología, que describe la respuesta de emergencia de un organismo en respuesta a un desafío ambiental de intentar restaurar 1,2 homeostasis. En situaciones de estrés, la glucosa en sangre, los ácidos grasos y los niveles de aminoácidos, la frecuencia cardíaca, la frecuencia respiratoria y la tasa metabólica todo aumento, y la sangre se desvía desde la periferia a los órganos centrales 2. Este patrón genérico de cambios fisiológicos prepara al animal para ser capaz de responder con rapidez y de forma adaptativa a una serie de desafíos sociales y fisiológicas. Mientras que el reconocimiento y la comprensión de la tensión está en el corazón de tanto pura y aplicada la investigación con animales, la evaluación de estrés en los animales sin restricciones sigue siendo un desafío.
Un marcador fisiológico ampliamente utilizado de estrés es un aumento en los niveles circulantes de hormonas glucocorticoides, como el cortisol y la corticosterona 1,2. Una gran fuerza de este enfoque es que sus concentraciones aumentan in proporción al factor estresante intensidad, lo que permite el estrés a ser cuantificada. Sin embargo, los glucocorticoides no son hormonas de estrés '' per se, sino movilizadores de las reservas de energía 2. Como tal, los niveles de glucocorticoides cambian también con los requerimientos de energía, hora del día, la edad y estado reproductivo 3,4, así como en respuesta a situaciones aparentemente positivas, como la oportunidad de apareamiento 5. Niveles de glucocorticoides, por lo tanto, deben interpretarse con cautela y dentro de un contexto. La medición de la respuesta al estrés agudo glucocorticoides también tiene algunas limitaciones. Un factor de estrés agudo desencadena una respuesta dinámica de aumento de los niveles de glucocorticoides inicialmente y, posteriormente, volver a un nivel de línea de base 1,2. Muestras de glucocorticoides se obtienen típicamente invasiva, por muestreo de la sangre que es un factor de estrés en sí mismo y por lo tanto puede afectar a los niveles de glucocorticoides medidos 6. Además los niveles de glucocorticoides sólo pueden medirse en uno o muy pocos p tiempoUNTOS, que no podrá captar la variación en los niveles de pico y tiempos de respuesta o la duración, lo que limita nuestra capacidad de examinar el cambio en el tiempo de la respuesta dinámica de estrés en los individuos. Los métodos no invasivos de toma de muestras de la hormona, tales como las heces 7, el pelo o las plumas 8, miden los niveles de glucocorticoides promedio de más de una escala de tiempo más largo, de días o meses, aunque útil para estudiar los factores de estrés crónicos, no son aplicables al estudio de estrés agudo . Como incluso los métodos mejor establecidos sólo ofrecen una perspectiva limitada en la variación de estrés agudo entre las personas existe una necesidad de una metodología alternativa en las mediciones de estrés fisiológico.
Como la respuesta al estrés implica una serie de efectos fisiológicos hay otros candidatos que podrían indicar estrés. Entre otros, simpáticamente mediada por canales de vasoconstricción arterial desde la periferia hasta el núcleo cuerpo. Esta concentración de la sangre y por lo tanto el calor, junto con diversas formass de la termogénesis inducida por el estrés, calienta el núcleo 9. Como tal, el calentamiento del núcleo, denominado estrés inducido por la hipertermia (SIH) también se ha utilizado como un marcador de estrés agudo en la investigación farmacéutica 10. SIH normalmente aumenta la temperatura corporal central por 0,5 a 1,5 ° C dentro de 10 a 15 min de un factor de estrés agudo 10. Es un fenómeno relativamente bien documentado que un factor de estrés experimental general aplicada de captura y manejo de un animal puede elevar la temperatura corporal central en una gama de especies de mamíferos y aves 11 - 17. Es importante destacar que, SIH se correlaciona con otros indicadores establecidos de estrés, tales como la frecuencia cardíaca 18, los niveles de glucocorticoides 19 y el comportamiento 20,21. Y al igual que los niveles de glucocorticoides, la temperatura central se ha linealmente relacionada con el estrés nivel en algunas especies 22. Sin embargo, como con el muestreo de sangre, la medición de la temperatura del núcleo es invasivo en sí mismo, lo que requiere la inserción or implantación de una sonda 10. La temperatura central de línea de base se incrementa gradualmente cada vez que la manipulación o sonda de inserción de inducción de estrés debe repetirse 23. La evolución reciente de los equipos de registro de temperatura que permiten el acceso a datos de forma remota pueden proporcionar una solución, por lo menos para los grandes animales 24.
Dentro del mismo mecanismo que genera SIH, sin embargo, se encuentra otro marcador potencial de la tensión: la vasoconstricción periférica que se mueve la sangre, y con ello calor, para el núcleo se enfría simultáneamente la piel 17. A diferencia de la temperatura del núcleo, temperatura de la piel se puede medir completamente no invasiva, mediante termografía infrarroja (IRT). IRT convierte la radiación infrarroja emitida desde la superficie de un objeto en la temperatura 25. Como la superficie de un animal normalmente tiene pocos calvas de la que la temperatura de la piel se puede derivar directamente, se requiere acceso a la piel expuesta de forma natural (por ejemplo, el área alrededor de tque ojo) o la creación de un parche desnudo por el recorte de pelo o plumas. De acceso proporcionado a un área expuesta adecuada de la piel y el animal puede ser mantenido en el campo de visión de la cámara, las cámaras IRT se pueden usar para recoger mediciones continuas de temperatura de la piel de forma remota, posiblemente permitiendo que la respuesta completa de temperatura a ser filmado y comparación entre individuos . A pesar de que ya se ha demostrado en los pollos que salen a la superficie la temperatura responde a la aguda tensión 26, la novedad de este estudio es que mide la temperatura corporal superficie de animales salvajes en una resolución más fina temporal de los estudios previos y también muestra que el descenso de la temperatura de la piel se espera pueda ser detectada en el campo donde la temperatura, humedad y tiempo son variables. El objetivo de este trabajo es describir la metodología necesaria para medir la temperatura de la piel de un animal sin restricciones el uso de imágenes térmicas. Utilizamos captura para inducir un estrés agudo leve en vida libre herrerillos (Cyanistes caeruleus, Linnaeus 1758 ) y describir cómo capturar las imágenes adecuadas, analizar las imágenes y procesar los datos para producir curvas de respuesta de la temperatura con respecto al tiempo que demuestran un significativo enfriamiento de la temperatura de la piel de las aves en respuesta al estrés leve. Esto puede proporcionar un método alternativo valiosa para evaluar el estrés en los animales silvestres y en cautiverio útiles para una amplia gama de investigadores de ecólogos, biólogos de la conservación y fisiólogos a investigadores de bienestar animal.
El estudio se llevó a cabo en el período comprendido entre el 17 de diciembre de 2013, y el 4 de enero de 2014 en un roble de hoja caduca (Quercus spp.) De bosques en el Centro Escocés de Ecología y Medio Ambiente Natural (escena) de la Universidad de Glasgow en la costa oriental de Loch Lomond, al oeste el centro de Escocia (56,13 ° N, 4,13 ° W). El protocolo consta de tres pasos principales: (1) La creación de condiciones adecuadas en virtud de que para capturar imágenes térmicas de un animal que va libre, (2) applying de un factor de estrés agudo mientras toma un video térmica, y (3) la extracción y el procesamiento de datos de las imágenes térmicas que luego pueden ser utilizados para caracterizar la respuesta del animal al factor estresante agudo. En nuestro caso hemos atraído a un paseriforme de vida libre, el herrerillo común a una caja de alimentación (filmando configuración) donde se optimizaron las condiciones de captura de imagen térmica, y luego aplicó un estrés de captura mediante el cierre de la caja de alimentación remota cuando el ave estaba dentro . La descripción de la captura de imagen térmica y la extracción de datos es específico para el equipo que utilizamos, y puede variar entre los sistemas de imágenes térmicas. El procesamiento de datos se describe el uso de un software de código abierto.
Protocolo
Declaración de Ética:
El trabajo consistió en una trampa de la rutina de los pequeños paseriformes de vida libre aprobados por el British Trust for Ornithology y el protocolo de captura provocando un estrés leve en el ave se llevó a cabo bajo las licencias de Reino Unido del Ministerio del Interior.
1. Configuración de rodaje
- Crear una filmación configuración donde se anima a los pájaros para posicionarse en frente de la cámara (Figura 1). El ave entra en la puesta a punto a través de un agujero en una pared de extremo y tiene acceso a los alimentos cerca de la pared del extremo opuesto.
- Con el fin de habituarse a las aves a la puesta a punto, proporcionar una alimentación adecuada (por ejemplo, granos de maní) en el alimentador durante varias semanas antes de la grabación. Además de la provisión de la comida, deje inalteradas la puesta a punto. Durante este período, colocar un trípode maniquí en frente del alimentador para permitir que las aves se habitúan también a la cámara.
- En el día de la grabación, reducir el availabidad de granos de maní en la puesta a punto mediante la eliminación de todos los alimentos que queda desde el alimentador y su sustitución por alimentos contenidos en un recipiente transparente con sólo un pequeño agujero en el centro en la parte superior a través del cual las aves pueden tener acceso a la comida. Posición este contenedor de alimentos en el centro de la jaula en el extremo opuesto al orificio de entrada.
- Coloque un pequeño cuadrado de cinta aislante negro de emisividad conocida a la de tegumento natural en una de las esquinas de la malla de la caja para que aparezca en todas las imágenes. Coloque la cinta aislante negro a un termopar conectado con un registrador de temperatura que registra la temperatura de la cinta aislante negro con una resolución de 0,1 ° C cada 1 s.
- Coloque la cámara de imagen térmica 50 cm desde el centro de la trampa de caja de modo que toda la caja se ajusta dentro de campo de visión de la cámara, y aves que se alimentan desde el recipiente transparente se coloca en la zona de la cámara de foco. Conecte la cámara a un ordenador portátil, ajuste la cámara para grabar imágenes en un promedio de 7,5 fotogramas por segundo (con una marca de tiempo), y enviar imágenes en el disco duro del ordenador portátil para ser salvo allí.
- Coloque una línea de pesca a la puerta giratoria de la puesta a punto y extenderla a una posición donde el experimentador se oculta a la vista de las aves, pero la puesta a punto aún se puede observar - a unos 20 m de la puesta a punto.
2. rodaje Respuesta de Pájaro a un estrés agudo leve
- Una vez que un ave entra en la caja de alimentación, deje que el pájaro no alterados en la caja durante aproximadamente 5 segundos.
- Tire de la línea de pesca después de que el pájaro había gastado aproximadamente 5 segundos en el cuadro para cerrar el cuadro de alimentación. Tenga cuidado de que el ave se encuentra todavía en el otro extremo de la caja con el fin de minimizar el riesgo de lesiones a las aves.
- Abordar inmediatamente el cuadro de alimentación y permanecer inmóvil detrás de la cámara durante unos 3 min. Luego recuperar el ave de la caja y la dejó ir.
- Extraer temperatura máxima de cada cuadro. Nota: La temperatura máxima se registró a partir de prácticamente siempre dentro de la región alrededor del ojo, delimitada por la piel expuesta del anillo de periophthalmic (Figura 2), y se denomina en lo sucesivo como la temperatura ojo-región.
- En el Thermal Analysis Software Imaging haga clic derecho en la imagen, "añadir" un nuevo terreno para el máximo de la imagen. Luego, haga clic derecho en la trama que exporta los datos (temperatura ojo-región y el tiempo que se tomó la trama) a un archivo CSV.
- Eliminar en el archivo CSV todas las líneas de los marcos donde el ojo-región del ave no era visible.
- Trazar temperatura máxima contra el tiempo en I 27, apunta identificar manualmente, donde los picos de temperatura> 0,2 ºC entre dos lecturas sucesivas cuando la membrana nictitante se tiró sobre el ojo (intermitente) y los puntos con valores bajos Outside el rango de temperatura corporal de las aves 28 (es decir, cuando la región de los ojos era visible pero borrosa a través del movimiento de varios marcos) y quite las líneas relevantes del archivo de datos CSV producido durante el paso 3.1.
- Medir la temperatura ambiente.
- Descargue los datos (tiempo y temperatura registrador) del registrador de temperatura en un ordenador y exportación en una hoja de cálculo.
- Para obtener la temperatura ambiente de la imagen térmica, en la imagen térmica Análisis Software dibujar un cuadrado sobre la cinta aislante negro que cubría la sonda registrador de temperatura, a continuación, haga clic derecho sobre la plaza y seleccione 'añadir nueva parcela "para la temperatura media de la plaza.
- Luego, haga clic derecho en esa parcela, para exportar los datos (tiempo y temperatura IRT) en un archivo CSV. Combinar la serie en dos tiempos de temperatura resultante de registrador de temperatura y coincidente imagen térmica para el tiempo en una sola hoja de cálculo.
- Correcta ojo-región temperature frente a la temperatura ambiente. Exportación de la hoja de cálculo creada en el paso 3.4 en el archivo CSV a juego para el tiempo. Para cada temperatura ojo-región retenido añadir la diferencia entre el los valores de temperatura de formación de imágenes térmicas derivadas de registrador de temperatura y (temp logger - temp IRT), medido al mismo tiempo.
- Realizar filtrado automático para eliminar los valores de temperatura menos precisos bajos ojo-región utilizando el algoritmo de búsqueda de pico (ver Código Archivo Suplementario) para extraer los puntos más altos (y por lo tanto más precisos) en los datos de forma automática.
Nota: El algoritmo de búsqueda de pico reorganiza los datos de temperatura en un vector con una anchura definida por el usuario (SPAN), recomendado lapso = 3, extrayendo el valor central en filas en las que los números de cada lado son más bajos, es decir, los picos. - Utilice interpolación lineal para cerrar los huecos dejados por las secuencias cuando se extrajo ningún pico, y cuando la región de los ojos no era visible. Utilice el comando na.approx (zoológico paquete v1.7-11 en R 27) para dar un único valor de temperatura por segundo para cada individuo.
- En el archivo de datos CVS, añadir un valor de 0,2 para cada temperatura ojo-región para corregir el efecto de tomar las imágenes a través de una malla.
Nota: Las pruebas mostraron que cuando un cuerpo negro, se calienta a la aproximación de la temperatura corporal promedio de aves de ~ 41 ° C en su fase activa de 28 años, fue fotografiada por la ventana de malla con el mismo tamaño de malla que se utiliza en el rodaje de configuración, las temperaturas registradas por la cámara termográfica en zonas no oscurecidas por los cables eran 0,2 ºC más baja que los valores obtenidos sin la malla intervención (diferencia media = -0,2 ºC ± 0,085 SD, n = 30, rango de temperatura de cuerpo negro = 41,6-42,5 ºC).
Nota: Este es el factor de corrección específica a las condiciones de este estudio, y es probable que varíe con el instrumento de hacer, y el tipo y el ancho de la malla entre el animal y la cámara, y en cada situación debe ser establecido para el spcondiciones de estudio ecific. - A partir de las temperaturas ojo-región máximos registrados desde antes de la caja estaba cerrada seleccione el valor más alto, que constituirán la base de referencia de temperatura ojo-región del ave sin ser molestados. Añadir esta línea de base temperatura ojo-región en su nueva columna en el archivo CVS (línea de base). Luego reste el valor de referencia de cada retenido máximo valor de temperatura ojo-región, generando una nueva columna en el archivo de datos CVS.
Nota: Este nuevo valor ahora expresar la respuesta del ave a estrés agudo leve como una desviación de la temperatura de la línea de base sin ser molestados. - Trazar las desviaciones en la temperatura máxima del ojo-región desde la línea de base de temperatura ojo-región de todos los individuos a partir después de la trampa se cerró con el ggplot comandos (paquete ggplot2 v1.0.0 en I 27). Generar 95% intervalos de confianza bootstrapped utilizando el mean_cl_boot opción (paquete ggplot2 v1.0.0 en I 27). Para más detalles ver el archivo de código suplementario.
Resultados
Los resultados de 9 tetas azules de vida libre se presentan que ilustran la información que puede obtenerse a partir de imágenes térmicas y demostrar que la señal predicha de estrés en la temperatura ojo-región del ave puede ser detectado en los animales criados en libertad. Cada ave fue filmado durante una media de 5,1 ± 0,9 seg (n = 9) antes de que el cuadro 'puerta estaba cerrada. Esto permitió el cálculo de del ave sin perturbaciones temperatura ojo-región (temperatura de referencia) a la que todas las medidas posteriores puede ser referido. En las pruebas realizadas en 20 seg videoclips térmica de herrerillos inalteradas que llegan y se alimentan dentro de una trampa (n = 9 aves distintas de las que se utilizan para la aplicación de un factor de estrés leve), las correlaciones de r> 0,7 se encontró que existe entre el máximo temperatura ojo-región registró durante los primeros 5 segundos, y el máximo registrado en el primer 10, 15 y 20 segundos (Figura 3). Esto fue interpretado como una indicación de que el VA máximolue registró en los pocos segundos iniciales después de la entrada trampa era representativa del nivel de largo plazo, y la media de temperatura ojo-región durante aproximadamente 5 segundos inmediatamente anterior cierre cuadro se utiliza como valor de referencia. Los herrerillos en esta muestra tenían una línea de base de la temperatura media del ojo-región de 38,4 ± 0,5 ° C (media ± SE) y varió desde 35,8 hasta 39,9 ° C (n = 9). Una vez que el ave alimentada durante 5 segundos para permitir el cálculo de la línea de base temperatura ojo-región, la puerta de la caja estaba cerrado por el experimentador. Todas las aves notaron el cierre de la caja como lo demuestran sus vuelos de evacuación intentos.
Al cierre de la trampa, la temperatura ojo-región se redujo rápidamente y alcanzó una temperatura ojo-región mínimo ~ 1,3 ° C por debajo de la temperatura de la línea de base después de ~ 10 seg (Figura 4). Figura 4 muestra la curva compuesta en base a la máxima ocular temperatura de la región de los nueve individuos promedio en cada segundo. Como laoportunidad y la magnitud de la caída de la temperatura del ojo-región varía entre los individuos de las máscaras curva compuesta la verdadera magnitud de la respuesta de la temperatura. El descenso de la temperatura media calculada para cada individuo por separado es de 2,0 ± 0,2 ° C y el punto más bajo se alcanza después de 9,4 ± 2,8 seg (media ± DE). A partir de entonces, la temperatura del ojo-región volvió gradualmente hacia la línea de base de temperatura ojo-región durante los siguientes 2-3 minutos, pero no bastante llegar a la línea de base por el final de la prueba.
Figura 1. El campo de rodaje. El plano establecido en el campo fue diseñado para atraer a las aves en el campo de visión de la cámara, donde se podría aplicar un factor de estrés aguda leve, con una caja de alimentación. La puesta a punto consistía en un 25 por 14 cm y 16,5 cm de alto de caja construida de madera contrachapada, con un panel frontal de malla de alambre galvanizado con un siz aperturae de 1 por 2,5 cm. La malla permite que la radiación infrarroja pase a través, por lo que es posible filmar pájaros mientras que dentro de la puesta a punto. Malla de alambre fue elegido, como el vidrio y la mayoría de los plásticos no transmiten la radiación infrarroja. Un agujero de 60 mm de diámetro fue cortada en la pared extremo izquierdo para permitir que las aves de entrar en la puesta a punto y tener acceso a los alimentos colocados en el extremo derecho de la caja. Una sonda registrador de temperatura entre dos cuadrados de cinta aislante negro (marcado por la flecha negro) se une a la esquina superior derecha del panel frontal para grabar una temperatura de referencia. El factor de estrés aguda leve se aplica a las aves en el interior mediante el cierre de la caja. Tirando de una línea de pesca unido a una puerta giratoria en el agujero de entrada permitió el experimentador para cerrar el cuadro cuando un pájaro está dentro. La cámara térmica situada en frente de la trampa registra toda la secuencia de los acontecimientos. Haga clic aquí para ver una versión más grande of esta cifra.
Figura 2. imagen térmica de un Tit azul. La mayoría del cuerpo de un paseriforme está bien aislado por las plumas (o en menor medida por las escalas de la pierna), pero la piel alrededor del ojo se expone y se irradia más calor en circunstancias normales, y es rodeada de tegumento refrigerador o el fondo. Esto se muestra en esta imagen térmica por el color amarillo (temperatura más alta) alrededor del ojo, el naranja, el rojo, púrpura y azul significa temperaturas más frías y más frías. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. repetibilidad de la temperatura basal medidos over diferentes períodos de tiempo. Los coeficientes de correlación entre la temperatura máxima registrada en el primer 1.8 seg de un clip y la "media de los máximos 'dentro de 0.5º del valor más alto registrado por primera 10, 15 y 20 segundos del Clip (representado por líneas rojas, azules y verdes, respectivamente). Todos los clips fueron 20 seg de duración (n = 9). Durante el análisis inicial utilizando un conjunto de datos más grande, se calcula un número de los "medios de los máximos 'de sólo 1 valor, y le dio el mismo valor para rho en todas las comparaciones. Estos clips se eliminaron del análisis, dejando sólo aquellos en los que se calcularon las medias de más de 3 mediciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Respuestade la temperatura del ojo-región de atrapamiento. Hay una señal muy clara y pronunciada del evento de captura refleja en el cambio de la temperatura del ojo-región con el tiempo. Para comparar entre los individuos que varían en su temperatura de línea de base, la temperatura residual ojo-región, como la diferencia de la temperatura real y la temperatura de línea de base de ese individuo, se traza en el eje vertical. Esto se representa gráficamente contra el tiempo con el cierre de la trampa fijado como 0 y el pájaro eliminado de la trampa después de 3 min. La línea roja muestra la temperatura residual media y la banda gris representa el intervalo de confianza del 95%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discusión
El objetivo de este trabajo es describir la metodología necesaria para medir los cambios en la temperatura de la piel de un animal de vida libre en respuesta a un estresante aguda. Este estudio demostró que los cambios rápidos en la temperatura de la piel asociados con una respuesta de estrés agudo en las aves silvestres pueden ser capturados de forma no invasiva utilizando IRT. Este procedimiento implicó cinco etapas importantes (1) Diseño de campo correspondiente configuración utilizando un sistema de imagen térmica altamente portátil, (2) la medición de la temperatura basal, (3) la aplicación de un factor de estrés leve que implica la captura de las aves en la puesta a punto, (4) post hoc de muestreo de la temperatura del ojo-región y (5) de calibración de los datos de temperatura extraídos automatizado. La metodología aquí descrita se aplicó a la captura de las tetas azules salvajes. Temperaturas ojo-región de referencia representativos podrían ser capturados en tan sólo 5 segundos. El tiempo estimado necesario para grabar una de las aves en el campo era de aproximadamente 1 hora, con una hora adicional requerido para procesar la3 min secuencia de vídeo térmica.
Recopilación de buenos datos sobre la temperatura de la piel de un animal requiere de imágenes térmicas de alta calidad. Las cámaras térmicas sólo difieren fundamentalmente de las cámaras de luz visible en términos de la longitud de onda de la radiación electromagnética que detectan, por lo que muchos de los conceptos que se aplican en la fotografía (por ejemplo, el campo de visión, la profundidad de campo) se aplican también en termografía. Como comúnmente practicado por los fotógrafos de la naturaleza, cualquier lugar que un visitas de animales como era previsible, donde naturales (por ejemplo, sitios de anidación) o artificiales (por ejemplo, alimentadores), podrían ser utilizados para la recogida de imágenes térmicas. Atraer a los animales a la cámara en lugar de tratar de seguirlos, aunque su hábitat tiene la ventaja de que nos permite configurar la cámara de antemano, a recopilamos imagen de alta calidad con el menor trastorno posible tan pronto como el animal está a la vista. Sin embargo, con este enfoque, es vital para examinar o dar cuenta de los efectos de laese contexto específico de la medición de la tensión o temperatura de la piel. Por ejemplo, aquí, se midieron las aves en un contexto de alimentación, y la comida se usó para atraer activamente herrerillos en la puesta a punto. La investigación sobre los pollos sugiere que las experiencias positivas agudas, como la anticipación y el consumo de un premio de comida en un ensayo de aprendizaje asociativo también puede reducir la temperatura de los ojos 29. Como tal, "niveles de referencia" de las personas que entran en este conjunto particular hasta pueden estar influidos por la asociación de este acto con la recompensa. Esta posibilidad de nuevas investigaciones, aunque si está presente, sería de esperar para mejorar la caída de los niveles de referencia ya observada. Por otra parte, la termogénesis se produce con la digestión de los alimentos, aunque no se espera que los efectos específicos de alimentos que se consumen durante la medición de línea de base para elevar significativamente la temperatura dentro del período de captura 3 min 30.
Esta limitación considerado, la medición de todos los animales conen el mismo contexto es también una gran fuerza de este enfoque. Los resultados representativos mostraron que hubo una gran variación en la temperatura del ojo-región entre los individuos antes de que se aplica el factor de estrés agudo (línea de base temperatura ojo-region). La variación de la temperatura basal del ojo (coeficiente de variación = 3,9%) podría deberse en parte al error de medición o un fiel reflejo de entre-individuo diferencias. El período de la cámara IRT temperatura de la cinta aislante negro grabado durante 5 segundos cuando la temperatura de la cinta no ha cambiado, el coeficiente medio de variación fue de 0,26% (rango de 0,08% a 0,59%). Aunque es probable que sea más grande en un ave en movimiento, no obstante, el error de medición que indica que la mayor parte de esta variación en la línea de base temperatura ojo-región es de hecho entre los individuos. La noción de relativamente pequeño error de medición en las aves en movimiento se ve apoyado por la alta repetibilidad de temperatura ojo-región durante 20 segundos durante las mediciones de referencia ( Figura 3). Mediante el control de contexto, podemos asegurar que todas las aves estaban participando en la misma actividad. También podemos minimizar las contribuciones ambientales en el momento de la medición a entre-individuo variación en la temperatura de la piel, por ejemplo, asegurando que la localidad está protegido de la radiación incidente de confusión que, por las imágenes térmicas, dar lugar a una sobreestimación de la temperatura de la superficie del animal . Esto se puede hacer con el trabajo en la sombra o por tonos colocados estratégicamente, incluyendo plásticos más transparentes que bloquean la longitud de onda de infrarrojos. El protocolo presentado aquí muestra una sencilla puesta a punto que podría aplicarse fácilmente a la situación de invernada herrerillos. El herrerillo común fue filmada mientras que en una caja de alimentación con un techo sólido que evitó la exposición a la luz solar directa. Esta configuración también puede ser aplicado a muchos otros paseriformes que regularmente vienen a comederos artificiales en determinadas épocas del año. Como herrerillos son animales relativamente pequeños, queTienes que ser filmada de cerca para capturar un buen nivel de detalle. Al igual que con las cámaras fotográficas, acercarse al tema - tanto en términos de la distancia real, y magnificación - reduce dramáticamente la profundidad de campo. Para que las aves lo más grande posible en el campo de visión requerido filmación de ellos de distancia mínima de enfoque de la cámara, que en este caso era 500 mm y la reducción de la profundidad de campo 40 mm. Por lo tanto, todas las características de la filmación configuración deben ser diseñados para animar a los animales para mostrar su cabeza dentro de la zona relativamente estrecha de enfoque nítido de la cámara particular utilizado.
En respuesta a un factor de estrés leve aguda bien establecida a un animal que esperábamos los rápidos cambios en el patrón de flujo de la sangre, de la periferia al núcleo a través de la vasoconstricción mediada simpáticamente que reduce la temperatura de la piel 17. La región periorbital fue elegido como esto proporcionó la única región del cuerpo que fue sin aislar y es associados con una rica red entremezclados de pequeños vasos sanguíneos, la ophthalmicum rete que puede afectar a la pérdida de calor desde el ojo 31. La frecuencia de imagen rápida de la técnica videoing térmica fue capaz de mostrar una caída en la temperatura del ojo-región de aproximadamente 2 ° C en 10 segundos seguido de un posterior aumento de la temperatura de entre 0,5 ° C de la línea de base a menos de 3 min. Aunque el enfriamiento periférica en respuesta al estrés leve ha sido registrado previamente en alrededor de 1 min intervalos 17,26, 32, la técnica aquí mostró que la máxima caída de la temperatura puede ser extremadamente rápido. Con menor resolución temporal de la magnitud de este efecto se puede perder. Esto puede ser importante cuando se comparan las diferencias en la respuesta al estrés de diferentes individuos. El recalentamiento de las aves después de la "lucha o huida" respuesta rápida no regresó a nivel básico como el pájaro se mantuvo dentro de la casilla que indica que el ave permaneció fisiológicamente destacó. Los pájaros eran liberaciónd de la experimental después de un punto de corte elegido arbitrariamente de aproximadamente 3 min para minimizar el período de retención de un animal de vida libre. Sin embargo, en el futuro, los ensayos pueden necesitar ser más en grabar la respuesta completa de temperatura hasta que la temperatura del ojo-región del animal ha vuelto al nivel de referencia, si es logísticamente posible.
Este nuevo protocolo que involucra una serie de imágenes recogidas antes y después del factor estresante se aplicó ahora permite el estudio detallado de la dinámica de la respuesta al estrés agudo y comparaciones de los múltiples puntos de tiempo entre animales individuales. La repetición de este juicio dentro de las personas mayores de las diferentes estaciones o condiciones ambientales puede permitir que los efectos del medio ambiente sobre la base de referencia o la temperatura post-aguda de la piel del estrés que se desenredan, como una posible vía hacia la evaluación de estrés crónico también. .
Temperatura de la piel de un pájaro depende no sólo de la producción de calor metabólico yel flujo de sangre, sino también de intercambio de calor de la radiación solar, velocidad del viento y humectación 25. Esto excluye condiciones de humedad y viento de grabaciones termográficas precisas. La temperatura ojo-región grabada por una cámara de imagen térmica a veces puede ser subestimada, ya sea (error negativo) o sobreestimado (error positivo). Error positivo sustancial requeriría entrada de energía, pero esto fue evitado por el ave en el cuadro de alimentación está protegido del sol. Otra fuente de error positivo incluida cuando el ave parpadeó. De vez en cuando el ave tira brevemente su membrana nictitante sobre la región de los ojos y como se almacena internamente a una temperatura cercana a la de la base del cuerpo, parpadeando da una lectura anómalamente alta temperatura cuando se cubre el globo ocular. Esta es, sin embargo, fácil de detectar, ya que deja una firma muy marcado y el bastidor afectada se puede quitar. La razón principal de un error negativo en nuestros registros fue el desenfoque de movimiento. Cualquier movimiento demasiado rápido para ser capturado sharcapas de la velocidad de fotogramas de la cámara confunde los datos capturados desde el pequeño ojo-región cálida de la imagen con la del área fresca (desenfoque de movimiento) que rodea, lo que resulta en una subestimación de la temperatura del ojo-región. Así, después de la eliminación de errores positivos esto hace que la temperatura máxima medida desde la región de los ojos la medida más precisa y un filtrado automático con el comando función picos elimina los valores más bajos con menos probabilidades de temperaturas máximas ojo-región.
Además, como la radiación infrarroja es absorbida por el vapor de agua, la temperatura superficial se verá influenciada por la humedad relativa del medio ambiente registró. Esto puede explicarse mediante la introducción de la temperatura del aire, la humedad relativa y la distancia al objeto en la imagen térmica de análisis Software de análisis. Sin embargo, un enfoque más preciso y eficiente (como se lleva a cabo aquí) es incluir un cuerpo de referencia de la temperatura y la emisividad conocida dentro del campo de visión. En nuestro caso se tratabaun cuadrado de cinta aislante negro con una emisividad de 0,97, que es aproximadamente equivalente a la de 33 tegumento naturales. Esto permite la calibración de la temperatura ojo-región mediante el uso de la diferencia entre los valores de temperatura de formación de imágenes derivadas reales y térmicas medidos para la cinta aislante. La temperatura de la superficie del cuerpo negro a continuación, se puede utilizar para calibrar imágenes de forma continua durante todo el periodo de medición.
Gracias a los avances tecnológicos en el desarrollo de las cámaras térmicas que ahora se puede implementar como pequeñas cámaras ligeras capaces de recopilar muchos cuadros por segundo durante períodos prolongados de tiempo. Aunque la termografía es una técnica ampliamente utilizada en la investigación aviar 25, el tamaño y el costo de los sistemas de imágenes térmicas han restringido su uso en la naturaleza. En este estudio el sistema era muy portátil, costó aproximadamente. 6000 £ y video térmica proporcionada alta resolución capaz de forma no invasiva la captura te precisadatos mperatura de animales de vida libre, sin necesidad de manipular aves. Grabación en múltiples fotogramas por segundo permite mediciones de series de tiempo de alta resolución de la temperatura periférica y por lo tanto ofrece la posibilidad de explorar la dinámica de la respuesta de estrés agudo. Esto es difícil de lograr con la muestra de glucocorticoides convencional de que está limitada por el número de muestras que se puede tomar dentro de un período de tiempo. Aquí hemos extraído una serie temporal de la temperatura del ojo-región con un intervalo de 1 segundo, lo cual fue suficiente para demostrar la respuesta de la temperatura del ojo-región a un estresante agudo (captura), pero de mayor resolución temporal también sería posible. La acumulación de un gran número de imágenes, sin embargo, requiere un cierto nivel de automatización en la extracción de información de las imágenes. El protocolo describe un proceso semi-automatizado sencillo para extraer la temperatura máxima de cada imagen. Hemos sido capaces de hacer esto como la región de interés, el ojo-region, fue siempre el lugar más caluroso en la imagen. Análisis podría ser más problemático si las regiones de interés son más complejas y pueden requerir software de reconocimiento de patrón diseñado a medida (por ejemplo, 34). En este estudio se requiere algún tipo de filtrado manual para situaciones en las que la temperatura del ojo-región estuvo sobre o sub-estima, pero estos fueron detectados con facilidad, pero, por supuesto, una mayor automatización es deseable. Las mediciones de refrigeración periférica inducida por el estrés por imagen térmica proporciona una valiosa adición a otras medidas fisiológicas de estrés y el aspecto no invasiva de esta técnica es muy ventajoso para realizar nuevos estudios con animales en cautiverio y silvestres.
La captura de la respuesta al estrés completa, la termografía infrarroja claramente tiene un gran potencial como una herramienta para la evaluación del estrés. Para llegar a ser una alternativa no invasiva a la hormonal establecido y ensayos de temperatura central, sin embargo, será necesario cruzada validar entre estas medidas ydeterminar si la temperatura de piel muestra la misma proporcionalidad con la intensidad de factor estresante, es decir, la medida de la respuesta de temperatura de la piel puede reflejar la fuerza del factor de estrés. La investigación futura debería abordar si la temperatura de la piel capta el estrés crónico. Mientras SIH en respuesta a un estresante aguda se espera que sea, la exposición recurrente transitoria a factores estresantes agudos físicos o psicológicos pueden generar elevación crónica de la temperatura corporal 35,36. Ya sea vasoconstricción en curso contribuye a esta elevación del núcleo no se ha probado de forma explícita. Sin embargo, los estudios correlativos en los seres humanos que sufren de enfermedades relacionadas con el estrés crónico sí muestran temperaturas dedos reducidos 37. Un atributo final para explorar es la valencia: la capacidad de distinguir positiva de los acontecimientos negativos. Ensayos hormonales no pueden distinguir de valencia 5, con los niveles de glucocorticoides que aparecen para reflejar el nivel de excitación en lugar de estrés específicamente. La investigación sobre los estribos peinetura en pollos domésticos expuestos a estímulos aversivos y positivas sugieren temperatura de la piel puede ser igualmente similar a la excitación general de 22,29. Sin embargo, en los seres humanos, los diferentes estados emocionales provocan cambios en regiones específicas en la temperatura de la piel, por ejemplo el calentamiento periorbital y refrigeración mejilla cuando se asustan de 38 años, pero en general la disminución de la temperatura de la piel al reír 39. Las comparaciones entre diferentes regiones todavía pueden revelar el estado emocional. El uso de las recomendaciones establecidas en este documento, será posible hacer frente a todas estas preguntas, y validar temperatura de la piel como un marcador no invasivo de estrés.
Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por una beca de proyecto BBSRC a DMcK, DMcC y RGN (BB/K002775/1) y una beca de doctorado [a JP, BB/J013854/1]. Agradecemos el fantástico asesoramiento sobre el equipo técnico y las técnicas de campo que recibimos a lo largo del proyecto por parte de Nozrat Mirzai (Unidad de Bioelectrónica de la Universidad de Glasgow), Ross McLeod y Matthew Clavey (ThermalVision Research), así como de SCENE, por todo su apoyo logístico en el trabajo de campo. También nos gustaría agradecer a Debbie Kelton de Veracity por proporcionar generosamente el equipo utilizado para alimentar la cámara termográfica en el campo.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cámara termográfica | FLIR | A65 (f=25 mm) | Compacta (106 x 40 x 43 mm) y de bajo coste |
| Software de análisis de imágenes térmicas | FLIR | ResearchIR v3.4 | Permite la grabación de vídeo térmico de alta velocidad y el análisis de patrones térmicos |
| Registrador de temperatura Registradores | de datos Gemini Tinytag | Talk 2 TK-4023-PK | Monitores de -40 a +125 ° C usando la sonda de temperatura adjunta |
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