El objetivo de este video es demostrar cómo llevar a cabo la extracción de ADN automatizado de parafina embebido (FFPE) referencia las líneas celulares estándar fijado en formol y gotita digital de PCR (ddPCR) análisis para detectar mutaciones raras en un entorno clínico. La detección de mutaciones en muestras de FFPE demuestra la utilidad clínica de ddPCR en muestras FFPE.
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Artículo de método
El empleo de la gotita de PCR digital para detectar mutaciones BRAF V600E en embebidos en parafina líneas celulares de referencia estándar fijos-formalina
En este artículo
Resumen
Resumen
ddPCR es un método de PCR altamente sensible que utiliza un sistema de emulsión de agua y aceite. Usando un generador de gotas, una muestra de ácido nucleico extraída se divide en ~ 20,000 gotas de agua en aceite de tamaño nanométrico, y la amplificación de PCR ocurre en gotas individuales. El enfoque de ddPCR consiste en identificar mutaciones en secuencias, alteraciones en el número de copias y seleccionar reordenamientos estructurales que involucran genes específicos. Aquí, demostramos el uso de ddPCR como una técnica poderosa para cuantificar con precisión mutaciones raras de BRAF V600E en líneas celulares estándar de referencia FFPE, lo cual es útil para identificar a las personas con cáncer. En conclusión, la técnica de ddPCR ofrece el potencial de perfilar con precisión las mutaciones raras específicas en diferentes genes en varios tipos de muestras de FFPE.
Introducción
La acumulación de mutaciones genéticas en genes reguladores clave altera la programación normal de las células como la proliferación celular, la diferenciación y la supervivencia, que conduce al cáncer 1. La vía RAS-RAF quinasa MAP media las respuestas celulares a las señales de crecimiento. Mutaciones oncogénicas BRAF pueden resultar de mutaciones del conductor en el gen BRAF, que pueden causar la BRAF oncoproteína para convertirse hiperactiva 2. Las mutaciones en el gen BRAF también dan lugar a la señalización aguas abajo hiperactiva MEK y ERK 3, que, a su vez, conduce a un crecimiento celular excesivo y la prolife....
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Protocolo
1. Extracción de ADN de líneas celulares FFPE norma de referencia
Nota: Para este procedimiento, la extracción de ADN se realizó a partir de líneas celulares FFPE estándar de referencia (HD598, HD593, HD617, HD273 y de tipo salvaje (WT)) con el kit de aislamiento de ADN de tejidos FFPE como se describe en el protocolo a continuación. Extracción de ADN automatizada se logró siguiendo las instrucciones del fabricante para el aislamiento de ADN total.
- Usando un microtomo y el bloque de FFPE original, preparar manualmente secciones frescas antes de la extracción y el análisis de ADN, de acuerdo con los procedimientos establecidos. ....
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Resultados
Para nuestro análisis ddPCR, estudiamos las de referencia FFPE mutación líneas celulares estándar BRAF V600E. El lector de gota se conecta a un software de análisis de datos portátil ordenador en funcionamiento. Cada gotita individual se define sobre la base de la amplitud fluorescente como positivo o negativo. El software proporcionado por el fabricante también permite un punto de corte definido por el usuario a introducir para definir el umbral entre las gotitas positivos y negativos. El número de gotitas pos.......
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Discusión
En este sentido, destacamos la aplicabilidad de ddPCR y el aislamiento de ADN a partir de muestras de líneas celulares estándar FFPE de referencia para una evaluación específica de mutación genética. En este estudio, se utiliza TPS método de aislamiento de ADN automatizado que se puede adaptar fácilmente y automatizado, y tiene capacidad para un máximo de 48 muestras diferentes de forma simultánea, lo que permite más grandes experimentos a escala y una menor variabilidad. Una de las limitaciones del aislamiento del ADN .......
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Divulgaciones
Myung Ryuri Oh, Si Eun Kim, y Young Deug Kim son empleados de ABION CRO.
Agradecimientos
Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación y Desarrollo para la Sociedad de la Fundación Nacional de Investigación (NRF), financiado por el Ministerio de Ciencia, TIC y planificación de futuro (Grant No. 2013M3C8A1075908).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Hamilton MICROLAB STARlet IVD | instrument Siemens | 10701001 | Automated DNA isolation instrument |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 772BR1119 | |
| QX200 Lector de gotas | Bio-Rad | 771BR1497 | |
| Máquina de PCR convencional capaz de ajuste de tiempo de rampa | 621BR17718 | ||
| PX1 Selladora de placas PCR | Bio-Rad | 770BR1575 | |
| Software QuantaSoft | de aislamiento de ADN Bio-Rad | ||
| VERSANT Reactivos de Preparación de Tejidos Caja 1 | Siemens | 10632398 | |
| VERSANT Reactivos de preparación de tejidos Caja 1 | Consejos de Siemens | 10632399 | |
| CO-RE | Siemens | ||
| mutaciones | |||
| ddPCR Supermix | Bio-Rad | BR186-3010 | |
| Cartucho DG8 de concentración 2X | Bio-Rad | BR186-4008 | |
| Aceite generador de gotas | Bio-Rad | BR-186-3005 | |
| Junta | Bio-Rad | BR186-3006 | |
| Aceite lector de gotas | Bio-Rad | BR-186-3004 |
Referencias
- Vogelstein, B., et al. Genetic alterations during colorectal-tumor development. The New England journal of medicine. 319, 525-532 (1988).
- Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417, 949-954 (2002).
- Solit, D. B.,
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Reimpresiones y permisos
