La cuantificación tridimensional de espinas dendríticas de piramidal neuronas derivadas de células madre humanas pluripotentes inducidas

Summary

Las espinas dendríticas de las neuronas piramidales son los sitios de la mayoría de las sinapsis excitadoras en la corteza cerebral de los mamíferos. Este método describe un análisis cuantitativo 3D de morfologías de la columna vertebral en las neuronas glutamatérgicas piramidal corticales humanos derivadas de células madre pluripotentes inducidas.

Abstract

Las espinas dendríticas son pequeñas protuberancias que corresponden a los compartimentos post-sinápticos de las sinapsis excitadoras en el sistema nervioso central. Se distribuyen a lo largo de las dendritas. Su morfología es dependiente en gran medida de la actividad neuronal, y son dinámico. Las espinas dendríticas expresan receptores glutamatérgicos (receptores AMPA y NMDA) en su superficie y en los niveles de densidades postsinápticas. Cada columna vertebral permite la neurona para controlar su actividad estatal y local de manera independiente. Morfologías la columna vertebral han sido ampliamente estudiados en las células piramidales glutamatérgicas de la corteza cerebral, el uso de ambos enfoques in vivo y cultivos neuronales obtenidas a partir de tejidos de roedores. Condiciones neuropatológicos pueden estar asociados a la inducción de la columna vertebral y la maduración alterada, como se muestra en roedores neuronas cultivadas y el análisis cuantitativo unidimensional ^1. El presente estudio describe un protocolo para el análisis cuantitativo 3D de morfologías de columna usando cortic humanacol neuronas derivadas de células madre neurales progenitoras corticales (finales). Estas células se obtuvieron inicialmente a partir de células madre pluripotentes inducidas. Este protocolo permite el análisis de la morfología de la columna vertebral en diferentes períodos de la cultura, y con posibilidad de comparación entre las células madre pluripotentes inducidas obtenidos de individuos de control con los obtenidos a partir de pacientes con enfermedades psiquiátricas.

Introduction

Las espinas dendríticas de las neuronas piramidales corticales son protuberancias pequeñas y delgadas que se distribuyen a lo largo de las dendritas basales y apicales de estos subtipos neuronales en los roedores, primates, y el cerebro humano. Son los sitios de la mayoría de las sinapsis excitadoras y mostrar funciones clave en el aprendizaje y los procesos cognitivos. Las estructuras detalladas de las espinas dendríticas humanas se han estudiado técnicamente por microscopía electrónica ^2. Sin embargo, este enfoque lleva mucho tiempo y representa la carga de trabajo pesado. Más recientemente, un tridimensional (3D) de reconstrucción de la morfología de las espinas dendríticas ha sido reportado en la corteza del cerebro humano utilizando software específico combinado a gran análisis manual de la columna vertebral ^3.

La tecnología verde proteína de fluorescencia (GFP) acoplado a inmunofluorescencia representa una herramienta precisa para la identificación de la columna vertebral y medición de la forma por microscopía de fluorescencia. Este enfoque se puede aplicar fácilmente a las neuronas cultivadas. However, no hay datos han sido reportados en el análisis de maduración de la columna vertebral y la morfología de las neuronas humanas derivadas de células madre pluripotentes inducidas (IPSC).

El objetivo de este estudio fue describir un protocolo, que permite obtener imágenes de la espina dendrítica de las neuronas humanas cultivadas in vitro. Etiquetado GFP, microscopía confocal y análisis 3D con el módulo del filamento de marcador de software Imaris fueron utilizados en el presente protocolo. Cultura pasos que son necesarios para obtener neuronas glutamatérgicas corticales de las capas II a IV a partir de células madre neurales (NSC) son también brevemente descrito aquí. Todo el protocolo para la producción NSC humana ya ha sido publicado en otra parte ^4.

Protocol

1. Neuronal Cultura

Nota: la reprogramación de fibroblastos en células madre pluripotentes, el compromiso con el linaje telencéfalo dorsal, derivación, amplificación, y la banca de progenitores finales corticales (LCP) se describe en Boissart et al ^4. La diferenciación neuronal de las células-LCP como también se realizó de acuerdo a Boissart et al ⁴ con ligeras modificaciones. Otros procedimientos han sido desarrollados para la reprogramación directa de los fibroblastos en células madre pluripotentes inducidas seguido por su diferenciación en neuronas. Este protocolo fue retenido ya que permite la producción selectiva de las neuronas glutamatérgicas piramidales.

1. Tratar 6 pocillos placas de cultivo con cubreobjetos de vidrio con poli-ornitina (diluido a 1/6 en DPBS, la concentración de stock 0,01%) O / N, seguido de tres lavados en DPBS. A continuación, añadir la laminina (concentración de solución madre 1 mg / ml, se diluyó 500 veces en DPBS) durante al menos 10 h bajo la campana de flujo .
2. Plate y despachar NSC a baja densidad (50.000 células / cm ²⁾ en 6 pocillos placas de cultivo con cubreobjetos de vidrio en 3 ml de medio de cultivo que consta de DMEM / F12 (500 ml), 2 viales (5 ml cada uno) de suplemento de N2, 2 viales (10 ml cada una) de suplemento B27, 10 ml de Pen-estreptomicina (Penicilina = 10.000 unidades / ml y estreptomicina = 10.000 unidades / ml), 1 ml de 2-mercaptoetanol (Stock solución: 50 mM) y laminina (1 / 500), y sin factores de crecimiento. PASO CRÍTICO: Llevar a cabo este paso cuidadosamente por la adición de células con movimientos giratorios lentos con el fin de reducir la agrupación de células.
3. Retire el medio de cultivo. Añadir medio N2B27 fresco que contiene 2 mg / ml de solución de laminina fresco para mantener la neurona adjunto sobre los cubreobjetos de vidrio y evitar la formación de grumos. Cambie el medio cada 3 días. Mantener algunos de el medio restante (200 l) antes de añadir medio fresco con el fin de evitar que la célula de secado. Alternativamente, proceder rápidamente y cambiar el volumen total (3 ml).

e_title "> 2. Lentiviral Transducción

Nota: lentiviral vectores GFP fueron amablemente proporcionados por el Dr. Uwe Maskos Laboratorio en el Instituto Pasteur (París) y preparados de acuerdo con el protocolo publicado ^5. Expresión de GFP es impulsado por el promotor de fosfoglicerato quinasa de ratón (PGK). Para este estudio, título viral fue de 400 ng / l (solución madre en PBS 1x).

1. Transducir neuronas derivadas de IPSC humanos en cualquier etapa de la maduración de las partículas virales mediante la adición de 1 l de la solución madre que contiene 40 ng de GFP vector lentiviral por cultivo así (placas de 6 pocillos) y se incuba durante 48 horas en medio de cultivo fresco. Nota: Para este protocolo, la duración de la incubación permite un buen etiquetado de las estructuras de la columna vertebral.

3. La inmunofluorescencia

Nota: Con el fin de mejorar el etiquetado de toda la morfología de la columna vertebral, se llevó a cabo el etiquetado de inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo anti-GFP en condiciones permeabilizadas.

1. Retire medio de cultivo y fijar las células transducidas en cubreobjetos en paraformaldehído al 4% durante 10 min a RT, a continuación, lavar 3 veces en 1X PBS (10 min cada uno).
2. Cubreobjetos immergé en PBS suplementado con 0,05% de Triton (100x) y 10% de suero de caballo durante 1 hora a RT, a continuación, lavar 3 veces en 1X PBS.
3. Añadir 100 l de 1x PBS suplementado con 4% de suero de caballo y anticuerpo primario (1 / 1.000) generado contra GFP y se diluyeron por un factor de 1000 en cada cubreobjetos. Incubar en una caja oscura O / N a 4 ° C, luego lavar 3 veces con PBS 1x.
4. Diluir Alexa Fluor 488-anticuerpo conjugado (1/200) en PBS suplementado con 0,5% de Tween 20 y se incuba durante 1 hora a RT. A continuación, lavar 3 veces en PBS 1x y montar cubreobjetos en portaobjetos de vidrio con medio de montaje para microscopía de fluorescencia.

4. dendríticas Spine Imaging

1. Realizar imagen confocal través de un microscopio láser confocal de barrido.
2. Seleccionar las neuronas sanas con una morfología piramidalencontrar una arborización dendrítica completo, y cuantificar al menos 10 neuronas por condición de experimentos separados. Cuantificar 60 - 100 micras en las dendritas.
3. Adquirir imágenes utilizando un aceite 40X NA = 1,3 objetiva y una línea láser de 488 nm para la excitación GFP, con una potencia pico típico a nivel de muestra de alrededor de 20 mW. Establecer tamaño de píxel alrededor de 80 nm para probar adecuadamente las espinas dendríticas.
   Nota: La llamada posterior análisis de una imagen en la que el ruido no ponga en peligro la segmentación adecuada de las dendritas y espinas. Con los ajustes de toma de muestras y de potencia espaciales mencionadas anteriormente, se observó que un píxel en tiempo de permanencia de 3,15 mu s es suficiente para recoger suficientes fotones para construir una imagen tal. Para las muestras tenue, la calidad de imagen puede mejorarse mediante un promedio de 2 a 4 scans. La adquisición de varios azulejos XY puede ser necesaria para cubrir la región de interés, que luego debe ser cosida juntos antes de su procesamiento.
4. Para muestra, el volumen total de las neuronas, adquirir una Z-pila, conun espaciado Z que van desde 150 nm a 300 nm, produciendo 20 a 30 rebanadas z.
   Nota: La resolución espacial lateral logrado con estos ajustes es 234 nm y la resolución axial es 591 nm. El muestreo elegido aquí es adecuada, pero como la resolución axial es más grande que el tamaño más pequeño de las espinas en ser fotografiado, el análisis favorece las espinas que se extienden lateralmente desde las dendritas.
   

5. 3D Cuantificación de espinas dendríticas

Nota: Las siguientes secciones describen específicamente el uso del software Imaris para su análisis. Existen implementaciones alternativas, incluyendo NeuronStudio ¹⁵ o Metamorph ^8, que puede proporcionar resultados similares.

Utilice los siguientes valores fundamentales:

1. Como una etapa de tratamiento previo, utilizar el filtrado gaussiano a través de las instalaciones de procesamiento de imágenes que ofrece el software. Realizar filtrado gaussiano a través del procesamiento de imágenes> SmooLo> Filtro de Gauss. Ajuste el ancho del filtro para que sea igual al tamaño del pixel en XY.
2. Realizar un trazado semi-automática de las dendritas, utilizando el módulo de Filamento trazador del software.
   1. En primer lugar, calcular el diámetro de las dendritas, con la función distancia en la pestaña de la rebanada del software.
   2. En la pestaña Surpass, haga clic en la herramienta de filamentos. Para una mejor robustez, este protocolo se basa en el seguimiento semiautomático; haga clic en la creación automática Omitir. El interfaz del módulo muestra ahora en la pestaña Dibujo. Aquí, seleccione AutoPath como método, Dendrita como un tipo, y la entrada al diámetro estimado de dendritas.
   3. Utilice el modo de selección del puntero, convirtiendo el cursor en una caja. Mayús y haga clic derecho en el punto de partida de las dendritas. Nota: el software realiza cálculos iniciales.
   4. Mueva el puntero a lo largo de la dendrita. Desde el punto de partida (representared como una esfera azul), se muestra una línea amarilla que representa la ruta de dendritas más probable. Mayús y haga clic izquierdo en el punto final de dendritas.
3. Realice el espinas segmentación automatizada. Nota: Las espinas en la dendrita trazado se encuentran automáticamente por la interfaz del módulo.
   1. En la interfaz de módulo, haga clic en la ficha Creación. En la lista desplegable Reconstruir, recoger Reconstruir Dendrita Diámetro y marque la casilla de datos Fortaleza. Luego haga clic en Reconstruir.
   2. Establecer el umbral de modo que el volumen segmentado corresponde al volumen dendrita real. Como un algoritmo, seleccione la distancia más corta de Distancia mapa. Haga clic en el botón Siguiente.
   3. Determine el diámetro de la cabeza más pequeña columna vertebral y la longitud máxima, de nuevo con la función distancia en la pestaña de la rebanada del software, y luego volver a la pestaña Surpass e introduzca los parámetros. Fo este protocolo, los valores alrededor de 200 a 300 nm para el diámetro mínimo y 4 m de longitud máxima son buenos puntos de partida. No marque la casilla Permitir Rama de espinas. Haga clic en el botón Siguiente.
   4. Ajustar el umbral de puntos semilla de modo que los puntos azules que representan espinas localizar a las cabezas de la columna vertebral reales. Haga clic en el botón Siguiente. Nota: El cálculo básico se hace ahora y puede ser largo.
4. Clasifique espinas por ir a la pestaña Herramientas de la interfaz del módulo. Haga clic en Clasificar espinas. En la interfaz de usuario se le solicite, asegúrese de que hay cuatro clases, que se define por su morfología de la siguiente manera: Stubby: longitud <1 m; Mushroom: Longitud (columna vertebral)> 3 y el ancho máximo (cabeza)> significan ancho (cuello) x 2; Larga delgada: La media anchura (cabeza) ≥ media anchura (cuello); -Filopodios como: Longitud ≤ 4 micras (sin cabeza).
   Nota: El mointerfaz dule genera cuatro nuevos objetos filamentos que contienen los resultados de la clasificación.
5. Exportar Datos estadísticos: en cualquiera de estos cuatro interfaces de objetos, vaya a la pestaña Estadísticas.
   Haga clic en los Exportar Estadísticas de botón File.
   Nota: Otros valores estadísticos se pueden exportar para dendritas (. Por ejemplo, longitud, área, diámetro, profundidad rama, ramas ángulo, volumen, etc significa.), Y por espinas (por ejemplo, la rectitud, la zona de unión, longitud y volumen de distinta partes de la columna vertebral, diámetro columna vertebral, densidades, etc.)

Results

El presente estudio describe un protocolo estandarizado para la columna vertebral cuantificación de las dendritas de las neuronas piramidales cultivadas derivadas de IPSC. Este protocolo permite el análisis de la maduración de la columna vertebral en las neuronas humanas y su posible relación con la maduración de espinas en cultivos neuronales roedores estándar, así como en modelos animales in vivo.

La figura 1A representa un esquema de las diferentes etapas de cult...

Discussion

La cuantificación de las características morfológicas de las neuronas piramidales se basó en el software. La interfaz Filament trazador se utilizó para la segmentación de las neuronas y espinas, y el módulo XT se utilizó para su análisis.

Analizar la precisión de nuestra técnica, lo primero que comparó los parámetros morfológicos medidos (longitud, superficie, volumen y total de la columna vertebral en su caso), con los publicados utilizando ratas neuronas piramidales maduros en la cultura <...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
D-PBS (1x), sin Calcio, Magnesio y Fenol Rojo	Gibco/ Life Technologies	14190169
Solución de poli-L-ornitina Biorreactivo	Sigma Aldrich	P4957
Laminina de ratón	Dutscher Dominique	354232
N2 Suplemento	Gibco/ Life Technologies	17502048
B-27 sin vitamina A (50 veces)	Gibco/ Life Technologies	12587010
DMEM/NUT. MIX F-12 W/GLUT-I	Gibco/ Life Technologies	31331028
Neurobasal Med SFM	Gibco/ Life Technologies	21103049
2-mercaptoetanol	Gibco/ Life Technologies	31350-010
Penicilina-Steptomycin	Gibco/ Life Technologies	15140-122
GFP Anticuerpo policlonal de suero de conejo	Gibco/ Life Technologies	A-6455
Suero de caballo	Gibco/ Life Technologies	16050130
Alexa Fluor 488 Cabra Anti-Conejo	Gibco/ Life Technologies	A11034
Anticuerpo policlonal anti-tubulina betaIII	Millipore	AB9354
Cubreobjetos 13 mm	VWR	631-0150
Reactivo antidecoloración Prolong Gold con DAPI	Gibco/ Life Technologies	P36931
Tween(R) 20 Bioextra, líquido viscoso	Sigma Aldrich Chimie	P7949
Triton X-100	Sigma Aldrich Chimie	X100-100ML
Fibroblastos humanos Biorepositorio de	la línea celular de Coriell	GM 4603 y GM 1869	Instituto Coriell para la Investigación Médica, Camden, NJ, EE. UU
Microscopio de barrido láser confocal	Zeiss (Alemania)	LSM 700
Imaris Software	Bitplane AG, versión	6.4.0	de Zúrich Filament Tracer y son necesarios los módulos Imaris XT
Huygens Software	Huygens software, SVI, Países Bajos	Versión Pro	Opcional (para pruebas de deconvolución)