Una Cultura Modelo Novela de Pluripotentes Stem Cell Propagación de gelatina en Media Placenta acondicionado

Resumen

Este protocolo proporciona una forma sencilla y eficiente de propagar células madre pluripotentes humanas (hPSCs) utilizando solo medios condicionados derivados de la placenta humana en un plato recubierto de gelatina sin suplementación exógena adicional o sustratos sintéticos específicos de hPSC.

Resumen

La propagación de células madre pluripotentes humanas (hPSCs) en medio condicionado derivado de células humanas en condiciones de cultivo sin alimentador ha sido de interés. Sin embargo, no se ha desarrollado un método ideal de propagación humanizado ex vivo sin alimentadores para las hPSC; En la actualidad, se añaden sustratos exógenos adicionales, incluido el factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF), un factor maestro de mantenimiento de hPSC, a todos los medios de cultivo y se utilizan sustratos sintéticos como Matrigel o laminina en todos los cultivos sin alimentador. Recientemente, nuestro grupo desarrolló un protocolo simple y eficiente para la propagación de hPSCs utilizando solo medios condicionados derivados de la placenta humana en un plato recubierto de gelatina sin suplementación exógena adicional o sustratos sintéticos específicos de las hPSCs. Este protocolo no se ha reportado previamente y podría permitir a los investigadores propagar hPSCs de manera eficiente en condiciones de cultivo humanizado. Además, este modelo evita los riesgos de contaminación por hPSC por productos animales como virus o proteínas desconocidas. Además, este sistema facilita la producción en masa de hPSC utilizando el recubrimiento de gelatina, que es fácil de manejar, lo que reduce drásticamente los costos generales del mantenimiento ex vivo de hPSC.

Introducción

El objetivo de este protocolo es la propagación de células madre pluripotentes humanas (hPSCs), incluyendo células madre embrionarias humanas (hESCs) y células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSCs) en condiciones ex vivo totalmente humanizadas, libres de alimento, sin requerir suplementación exógena adicional y sustratos sintéticos. Hasta la fecha, el desarrollo de modelos de cultivo ex vivo de hPSC, que permiten la introducción de productos de cultivo en la clínica, ha sido una preocupación importante en la investigación con células madre. En concreto, es necesario abordar dos problemas críticos. En primer lugar, se necesita un sistema de cu....

Protocolo

Declaración de Ética: El estudio de la placenta humana se realizó de forma prospectiva, con la aprobación de la Junta de Revisión Institucional para la investigación humana de la Universidad de Corea (AN09085-001). Todos los experimentos se llevaron a cabo en un centro de la habitación-Germ gratuito Limpio en el Centro Médico de la Universidad de Corea. El diseño y los procedimientos que utilizan hPSCs experimentales fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad del Centro Médico de Corea (AN12277-003).

1. Preparación de instrumentos, medios de cultivo, y platos

1. Escudo todas las placas de cultivo con....

Resultados

Una ventaja de este método de propagación HPSC es que utiliza componentes secretados a partir de células humanas. Un paso más ciritical en el protocolo es el aislamiento y cultivo de células de la placenta humanos derivados. Esto requiere la disección precisa y de una parte precisa de HPC placa vellosidades. La Figura 1 muestra el procedimiento para el aislamiento de células derivada de placenta humana. Este proceso es simple y conveniente para el aislamiento de células, y se puede realizar fácilmente d.......

Discusión

Este modelo fue desarrollado para propagar con éxito hPSCs, mientras que el mantenimiento de sus características, en condiciones de cultivo libres de alimentador humanizados sin la adición de factores de crecimiento recombinantes exógenas tales como bFGF o insulina, lo que permite la manipulación de hPSCs en un microambiente humanizado. Suplementación bFGF exógeno es común y la aplicación de sustratos tales como Matrigel o laminina es esencial para el cultivo libre de alimentador de hPSCs ^14.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Mitomicina-C	Sigma-Aldrich Corporation	M4287	10 μ g/ml
kit de detección de micoplasma	TaKaRa Bio Inc.	#6601
Matrigel	BD Biociencias	#354277
mTeSR1	STEMCELL Technologies Inc.	#05850
Dispasa	Worthington Biochemical Corporation	LS02100	1 mg/ml
Gelatina	Sigma-Aldrich Corporation	G2500	0.10%
BM-Cyclin	Roche	799 050	10 μ g/ml
RNeasy mini kit	Qiagen	74104
Espectrofotómetro de nanogota	Thermo Fisher Scientific Inc
iQ SYBR Green qPCR Master Mix	Bio-Rad Laboratories	#170-8882AP
Kit de caracterización de células ES	Chemicon International, Inc.,	SCR001
Power cDNA Synthesis Kit	iNtRON Biotechnology	25011
QIAamp® Kit DNA Micro	Qiagen	56304
AmpF/STR® Identificador® Kit de amplificación de PCR	Applied Biosystems Inc.
Applied Biosystems® 3130xl Analizador genético	Biosystems Aplicado, Inc.

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