Detección Sensible de Proteopathic Siembra Actividad con FRET Citometría de Flujo

Jennifer L. Furman; Brandon B. Holmes; Marc I. Diamond

doi:10.3791/53205

Artículo de método

Detección Sensible de Proteopathic Siembra Actividad con FRET Citometría de Flujo

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DOI:

10.3791/53205

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8 de diciembre de 2015

Jennifer L. Furman^*¹ , Brandon B. Holmes^*¹ , Marc I. Diamond¹

¹Center for Alzheimer's and Neurodegenerative Diseases, University of Texas Southwestern Medical Center

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

La transferencia de célula a célula de agregados de proteínas, o semillas proteopáticas, puede ser la base de la progresión de la patología en las enfermedades neurodegenerativas. Aquí, se describe un nuevo ensayo de citometría de flujo FRET que permite la detección específica y sensible de la actividad de siembra a partir de muestras recombinantes o biológicas.

Resumen

Cada vez hay más evidencia que apoya la propagación transcelular de agregados de proteínas tóxicas, o semillas proteopáticas, como mecanismo para el inicio y la progresión de la patología en varias enfermedades neurodegenerativas, incluida la enfermedad de Alzheimer y las tauopatías relacionadas. El papel potencialmente crítico de las semillas de tau en la progresión de la enfermedad respalda firmemente la necesidad de un ensayo sensible que detecte fácilmente la actividad de siembra en muestras biológicas.

Combinando la especificidad de la transferencia de energía por resonancia fluorescente (FRET), la sensibilidad de la citometría de flujo y la estabilidad de una línea celular monoclonal, se ha diseñado un ensayo de siembra ultrasensible que es compatible con la detección de semillas a partir de muestras recombinantes o biológicas, incluidos los homogeneizados de cerebro humano y de ratón. El ensayo emplea células monoclonales HEK 293T que expresan de manera estable el dominio de repetición (RD) propenso a la agregación de tau que alberga la mutación P301S asociada a la enfermedad fusionada con CFP o YFP, que producen una señal FRET tras la agregación de proteínas. La absorción de semillas proteopáticas de tau (pero no de otras proteínas) en las células biosensoras estimula la agregación de RD-CFP y RD-YFP, y la citometría de flujo monitorea sensible y cuantitativamente este FRET inducido por la agregación. El ensayo detecta concentraciones femtomolares (monómero equivalente) de semillas de tau recombinantes, tiene un rango dinámico que abarca tres órdenes de magnitud y es compatible con homogeneizados cerebrales de ratones transgénicos con tauopatía y sujetos con tauopatía humana. Con ligeras modificaciones, el ensayo también puede detectar la actividad de siembra de otras semillas proteopáticas, como la α-sinucleína, y también es compatible con cultivos neuronales primarios. La facilidad, sensibilidad y amplia aplicabilidad de la citometría de flujo FRET la hacen útil para estudiar una amplia gama de trastornos de la agregación de proteínas.

Introducción

La acumulación intracelular de tau amiloides define tauopatías tales como enfermedad de Alzheimer. En las etapas iniciales de la enfermedad, la patología es generalmente localizada en regiones discretas del cerebro, pero con progresión de la enfermedad, la patología se extiende invariablemente a lo largo de distintas redes neuronales ^1-5. La evidencia acumulada sugiere propagación transcelular de agregados de proteínas tóxicas subyace en esta patología (revisado en ^6-10). En este modelo, las semillas proteopathic (por ejemplo, tau) se liberan de las células del donante y entran en las células vecinas, la transformación de la proteína ta....