Describimos un protocolo que permite la purificación del compartimento vascular del cerebro del ratón. Los vasos cerebrales aislados incluyen células endoteliales unidas por uniones estrechas y rodeadas por una lámina basal continua, pericitos, células musculares lisas vasculares, así como membranas astrogliales perivasculares.
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Artículo de método
La purificación de los buques de cerebro de ratón
En este artículo
Resumen
Resumen
En el cerebro, la mayor parte del sistema vascular consiste en una barrera selectiva, la barrera hematoencefálica (BBB) que regula el intercambio de moléculas y células inmunes entre el cerebro y la sangre. Por otra parte, la enorme demanda metabólica neuronal requiere una regulación de momento a momento del flujo sanguíneo. Cabe destacar que las anomalías de estas regulaciones son características etiológicas de la mayoría de las patologías cerebrales; incluyendo glioblastoma, accidente cerebrovascular, edema, epilepsia, enfermedades degenerativas (por ejemplo: enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer), tumores cerebrales, así como las condiciones inflamatorias tales como esclerosis múltiple, meningitis y disfunciones cerebrales sepsis inducida. Por lo tanto, la comprensión de los eventos de señalización que modulan la fisiología vascular cerebral es un gran desafío. Mucho penetración en las propiedades celulares y moleculares de los diversos tipos de células que componen el sistema cerebrovascular se puede obtener de cultivo primario o clasificación de células a partir de tejido cerebral recién disociada. Sin embargo,propiedades tales como la polaridad celular, la morfología y relaciones intercelulares no se mantienen en tales preparaciones. El protocolo que se describe aquí está diseñado para purificar fragmentos de vasos del cerebro, mientras que el mantenimiento de la integridad estructural. Se demuestra que los vasos aislados consisten en células endoteliales sellados por uniones estrechas que están rodeados por una lámina basal continua. Los pericitos, células de músculo liso, así como las membranas de astrocitos perivasculares endfeet permanecen unidos a la capa endotelial. Por último, se describe cómo llevar a cabo experimentos de inmunotinción en vasos cerebrales purificados.
Introducción
El funcionamiento adecuado del sistema nervioso central (SNC) requiere un entorno extracelular altamente regulado, y sus demandas metabólicas son enormes en comparación con otros órganos 1. El SNC es también extremadamente sensibles a una amplia gama de productos químicos, generalmente inofensivo para los órganos periféricos, pero a la misma, neurotóxico. Para garantizar el correcto funcionamiento, la mayor parte del 'vasculatura SNC forma una barrera endotelial; la barrera hematoencefálica (BBB), que controla el flujo de moléculas e iones, así como el paso de las células inmunes entre la sangre y el cerebro, lo que se mantiene la homeostasis adecuada ....
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Protocolo
1. Soluciones y Materiales
- Preparar soluciones de los vasos de aislamiento: B1, añadir 1,5 ml de HEPES 1 M a 150 ml de HBSS; B2, añadir 3,6 g de dextrano a 20 ml de B1; B3, añadir 1 g de BSA a 100 ml de B1.
- Modificar el soporte del filtro mediante la reducción de la parte inferior de la parte superior de atornillado.
- Preparar soluciones de inmunotinción: solución de fijación, 4% de paraformaldehído en PBS pH 7,4; Permeabilización / solución de bloqueo, diluir suero de cabra al 5% y Triton X100 al 0,25% en PBS pH 7,4.
Nota: La fijación depende del tipo de anticuerpos primarios utilizados.
2. Disecc....
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Resultados
Aquí se describe un protocolo que permite el aislamiento mecánico de los vasos cerebrales 14. Figura 1 resume las principales etapas de esta técnica. La arquitectura de los vasos cerebrales es compleja e incluye varios tipos de células, es decir, células endoteliales sellados por uniones estrechas y rodeados por pericitos, células musculares lisas, y procesos de pie 9 de astrocitos. Por lo tanto, después del aislamiento de los vasos cerebrales, que tuvo como objetivo carac.......
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Discusión
La barrera sangre-cerebro regula el paso de sustancias fisiológicas dentro y fuera del SNC y lo protege contra sustancias potencialmente nocivas presentes en la sangre. Está implicado en varias patologías del sistema nervioso central, incluyendo enfermedades neurodegenerativas 2 y 28 tumores cerebrales. La muy baja permeabilidad de la BHE también dificulta el paso de agentes terapéuticos dirigidos células neuronales y el desarrollo de métodos que tengan la intención de abrir de forma reversible la BHE sin con.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Labex MemoLife y por el ARSEP (Fondation pour l'aide à la recherche sur la sclérose en plaques)
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Trituradora de tejidos tamaño C | Thomas scientific | 3431E25 | |
| centrífuga 5415 Centrífuga R | Eppendorf | ||
| 5810 R | Eppendorf | 5811000320 | |
| Microscopio estereoscópico modular de alto rendimiento | Leica | MZ6 | |
| Leica LED1000 | Leica | LED1000 | |
| de alta calidad (P1000) | Sorenson BioScience | 14200T | |
| Swinnex Portafiltros de 47 mm PP 8/Pk | Millipore | SX0004700 | |
| Disco de filtro de red de nailon Hydrophilic 20 µ m 47 mm 100/Pk | Millipore | NY2004700 | |
| Disco filtrante de red de nailon Hydrophilic 100 µ m 47 mm 100/Pk | Millipore | NY1H04700Tubo de | |
| borosilicato de pared estándar | Sutter Instrument | B150-86-7.5 | |
| Portaobjetos de microscopio | Thermo Scientific | 1014356290F | |
| Cubreobjetos, espesor 1 | Thermo Scientific | P10143263NR1 | |
| 0,2 ml Tubos de pared delgada y tapa abovedada | Thermo Scientific | AB-0266 | |
| PARAFILM M (tamaño de rollo 4 pulgadas y veces; 125 pies) | Sigma | P7793-1EA | |
| HBSS, sin calcio, sin magnesio, sin rojo fenol | Tecnología Life | 14175-129 | |
| HEPES (1M) | Tecnología Life | 15630056 | |
| Dextrano de Leuconostoc spp. Sr. ~70,000 | Sigma | 31390 | |
| Albúmina sérica bovina | Sigma | A2153 | |
| 10x PBS | Euromedex | ET330 | |
| 16% Formaldehído (p/v), sin metanol | Thermo Scientific | 28908 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| bisBenzimida H 33342 triclorhidrato (Hoechst) | Sigma | 14533 | |
| Medio de montaje Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Isolectina GS-IB4 De Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugado; Dilución 1/100 | Life technology | I21411 | |
| Agrin (conejo) ; dilución 1/400 | amablemente proporcionada por el Dr. Markus A Ruegg | ||
| Anti ZO-1 (ratón, clon 1A12) | Life technology | 33-9100 | dilución 1:500 |
| Anti Smooth Muscle Actin (ratón, clon 1A4) | Sigma | A2547 | dilución 1:500 |
| Anti GFAP (ratón, clon GA5) | Sigma | G3893 | dilución 1:500 |
| Anti AQP4 (conejo) | Sigma | A5971 | dilución 1:500 |
| Anti Cx43 (ratón, clon 2) | BD Biosciences | 610061 | dilución 1:500 |
| Anti Olig2 (conejo) | Millipore | AB9610 | dilución 1:200 |
| Anti NF-M (ratón) | proporcionada por el Dr. Beat M. Riederer, Universidad de Lausana, Suiza. | dilución 1:10 | |
| Anti Iba1 (conejo) | Wako | 019-19741 | dilución 1:400 |
| Alexa Fluor 488 Cabra Anti-Ratón IgG (H+L) Anticuerpo Tecnología | Life | A11029 | dilución 1:2.000 |
| Anticuerpo secundario IgG (H+L) anti-conejo de cabra, Alexa Fluor 488 | conjugado Tecnología de vida | A11034 | dilución 1:2.000 |
| Alexa Fluor 555 Cabra Anti-Ratón Anticuerpo IgG (H+L) | Tecnología Life | A21424 | dilución 1:2.000 |
| Anticuerpo secundario IgG (H+L) anti-conejo de cabra, conjugado Alexa Fluor 555 | Tecnología de vida | A21429 | Dilución 1:2.000 |
Referencias
- Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).
- Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders.
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Reimpresiones y permisos
