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Aislamiento de mitocondrias a partir de cantidades mínimas de ratón músculo esquelético para mediciones de alto rendimiento de microplacas Respiratorias

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DOI:

10.3791/53217

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13 de noviembre de 2015

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1The Department of Human Nutrition, Foods, and Exercise, Virginia Tech, 2The Metabolic Phenotyping Core, Virginia Tech, 3Seahorse Bioscience

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos una modificación de un método previamente reportado que permite el aislamiento de mitocondrias purificadas y de alta calidad a partir de cantidades más pequeñas de músculo esquelético de ratón. Este procedimiento da como resultado mitocondrias altamente acopladas que respiran con alta función durante los ensayos respirometirc basados en microplacas.

Resumen

Mitocondrias del músculo esquelético disfuncionales juegan un papel en el metabolismo alterado observado con el envejecimiento, la obesidad y la diabetes tipo II. Ensayos respirométricos mitocondrial de preparaciones mitocondriales aislados permiten la evaluación de la función mitocondrial, así como la determinación del mecanismo (s) de acción de los fármacos y las proteínas que modulan el metabolismo. Procedimientos de aislamiento actuales requieren a menudo grandes cantidades de tejido para producir las mitocondrias de alta calidad necesarias para los ensayos de respirométricos. Los métodos presentados en este documento describen cómo de alta calidad mitocondrias purificadas (~ 450 g) se puede aislar a partir de cantidades mínimas (~ de 75-100 mg) de músculo esquelético de ratón para su uso en mediciones respiratorias de alto rendimiento. Se determinó que nuestro método de aislamiento produce 92,5 ± 2,0% mitocondrias intactas midiendo la actividad de la citrato sintasa espectrofotometría. Además, el análisis Western blot en mitocondrias aisladas resultó en la expresión débil del cytosoproteína lic, GAPDH, y la expresión robusta de la proteína mitocondrial, COXIV. La ausencia de una banda de GAPDH prominente en las mitocondrias aisladas es indicativo de poca contaminación de fuentes no mitocondriales durante el procedimiento de aislamiento. Lo más importante, la medición de la tasa de consumo de O 2 con tecnología basada en micro-placa y la determinación de la relación del control respiratorio (RCR) para los ensayos de respirométricos acoplado muestra altamente acoplado (RCR;> 6 para todos los ensayos) y las mitocondrias funcionales. En conclusión, la adición de una etapa de picar carne separada y reduciendo significativamente impulsado por motor de velocidad homogeneización de un método reportado previamente ha permitido el aislamiento de alta calidad y mitocondrias purificada a partir de cantidades más pequeñas de ratón músculo esquelético que da como resultado en las mitocondrias altamente acoplados que respiran con alta función durante ensayos respirometirc basado en una microplaca.

Introducción

La función principal de las mitocondrias es producir ATP a partir de la fosforilación oxidativa. Sin embargo, las mitocondrias tienen muchas otras funciones celulares importantes, que incluyen, entre otras: la producción y desintoxicación de especies reactivas de oxígeno, la regulación del calcio citoplasmático y mitocondrial, el tráfico de orgánulos, la homeostasis iónica y la participación en la apoptosis1,2. Por lo tanto, no es de extrañar que las mitocondrias disfuncionales desempeñen un papel en muchas patologías patológicas, como el envejecimiento, las enfermedades neurodegenerativas, las enfermedades cardiovasculares, el cáncer, la obesidad y la diabetes3,4. Es importante destacar que las mitocondrias del músculo esquelético específicamente están involucradas en muchas de estas patologías3-5.

Los ensayos de respiración mitocondrial que utilizan mitocondrias aisladas permiten evaluar la cadena de transporte de electrones y la función de fosforilación oxidativa, y determinar los mecanismos de acción de fármacos y proteínas que modulan el metabolismo. Existen procedimientos de aislamiento mitocondrial para múltiples tipos de tejidos y células para una variedad de especies6,7. Sin embargo, estos procedimientos a menudo requieren grandes cantidades de tejido/células para obtener un rendimiento mitocondrial de alta calidad necesario para los ensayos respirométricos clásicos.

Los ensayos respirometirc basados en microplacas permiten mediciones de alto rendimiento utilizando cantidades mínimas de mitocondrias aisladas, a menudo solo varios μg por pocillo8. Por lo tanto, presentamos una modificación de los métodos publicados anteriormente7 para permitir el aislamiento de mitocondrias de alta calidad a partir de cantidades más pequeñas de músculo esquelético de ratón para su uso en ensayos respirometirc basados en microplacas. Además, se proporcionan métodos para establecer la calidad de la preparación del aislamiento mitocondrial y la integridad de las membranas mitocondriales. Dado que las mitocondrias del músculo esquelético están involucradas en muchas condiciones patológicas, la medición del consumo de O2 en estudios mecanicistas es cada vez más frecuente en la investigación biomédica9,10.

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Protocolo

Los estudios en animales se realizaron bajo un protocolo aprobado por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión en el Instituto Politécnico de Virginia y la Universidad Estatal.

1. Configuración (Tiempo: ~ 45 min)

  1. Tiendas Descongele de 0,25% de tripsina, Aislamiento Buffer de mitocondrias (IBM) 1 y IBM2 en un baño de agua a 37 ° C.
  2. Enjuague la cristalería y los instrumentos de disección en etanol al 70%, seguido de agua de alta pureza.
  3. Preparar una solución de tripsina al 0,05% desde 0,25% de tripsina stock de diluir 1 parte de tripsina en 4 partes IBM1.
  4. Mezclar proteasa e inhibidor de la fosfatasa cóctel con tampón de lisis celular (1: 100 ratio) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con tapón de rosca.
  5. Alícuota de 5 ml (5 ml / ratón) de 0,05% de tripsina en un tubo de plástico de 15 ml.
  6. Conjunto motor impulsado homogeneizador de tejidos a 80 RPM.

2. Aislamiento de mitocondrias del músculo esquelético (Tiempo: ~ 90 min)

  1. La eutanasia a un ratón por el CO 2 inhalación, seguido por dislocación cervical.
  2. Eliminar músculo rojo del músculo gastrocnemio y cuádriceps, que incluye el sóleo (~ de 75-100 mg total) como se describe en los siguientes pasos:
    1. Pelar la piel hacia el ratón.
    2. Retire la almohadilla de grasa por encima del punto de origen del cuádriceps. Cortar el tendón del cuádriceps que se adjunta a la rótula con unas tijeras de punta fina.
      Nota: El cuádriceps se identifica por su posición anatómica en la parte anterior del fémur proximal.
    3. Lentamente cortar la aponeurosis entre el hueso y el cuádriceps, evitando al mismo tiempo la arteria femoral, para liberar el cuádriceps de la médula. Cortar el tendón con tijeras de punta fina en el punto de origen en el fémur para liberar el músculo cuádriceps y colocar el músculo cuádriceps en PBS enfriado.
    4. Retire el tejido adiposo visible sobre los cuádriceps con tijeras. Voltear las cuádriceps de manera que la porción del músculo que se recubre el fémur se enfrenta up. Abra el músculo cuádriceps con fórceps en un movimiento en abanico. Retire las dos porciones musculares rojas visibles desde cada lóbulo con tijeras de punta fina y colocar en un vaso que contiene 5 ml de enfriado IBM1.
      Nota: del músculo cuádriceps aparecen como dos lóbulos con una tira de músculo rojo situado cerca del borde lateral de cada lóbulo.
    5. Cortar la piel que recubre el tendón de Aquiles con punta fina tijera y la cáscara de la piel hacia el ratón. Cortar el tendón de Aquiles expuesto y pelar el músculo hacia el cuerpo del ratón.
    6. Cortar el tendón en los cóndilos lateral y medial del fémur con tijeras de punta fina para liberar a los gemelos y colocar el gemelo unido a sus tendones en PBS frío.
    7. Da la vuelta al gastrocnemio una y pelar el músculo sóleo y colocarlos en el vaso que contiene 5 ml de enfriado IBM1. Fan abrir el gastrocnemio. Retire los tres porciones visuales rojos musculares (dos tiras rojas laterales y uno medial superficiales) con tijeras de punta finas y les traslado al vaso que contiene 5 ml de enfriado IBM1.
  3. Retire otra ~ 75-100 mg de músculo rojo de la otra pata del ratón (como se describe en el paso 2.2) y ponerlo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con proteasa e inhibidor de la fosfatasa cóctel y tampón de lisis celular (50 mM Tris-HCl, 1 EDTA mM, NaCl 150 mM, 1% de dodecilsulfato de sodio, 0,5% de desoxicolato de sodio, 1% de polioxietileno (9) nonilfeniléter, ramificada. Inmediatamente FLASH-congelar esta segunda muestra en nitrógeno líquido para su uso posterior en Western Blot (véase el paso 6.1).
  4. Coloque una superficie de plástico pre-enfriado, plana sobre hielo en un gran cubo. Vierta una gota de IBM1 sobre la superficie de plástico y utilizar pinzas para colocar toda la músculo rojo seccionado (paso 2.2.4 y 2.2.7) en IBM1 gotas. Picar el tejido muscular durante 2 minutos con 3 cuchillas de afeitar borde individuales cambiando las maquinillas de afeitar cada 40 seg.
  5. Transferir el tejido picado a un nuevo vaso de precipitados con 5 ml de IBM1 fresco mediante la celebración de la superficie de plástico sobre el the vaso de precipitados y raspando el músculo en el vaso de precipitados con una hoja de afeitar. Tome esta solución y drenarla a través de un filtro de células 100 micras colocado sobre un tubo cónico de 50 ml.
  6. Seque el tejido con un limpiador tarea delicada y luego transferirlo a 5 ml de la solución de tripsina 0,05%. Utilice pinzas para retirar el tejido del limpiaparabrisas tarea.
  7. Incubar el tejido muscular en hielo durante 30 min en solución de tripsina 0,05%.
  8. Haga girar los 15 ml tubo cónico de mezcla que contiene tripsina / muscular a 200 xg durante 3 min a 4 ° C.
  9. Verter el sobrenadante de tripsina en un contenedor de residuos y resuspender el precipitado con 3 ml de hielo frío IBM1. Transferir el tejido a un tubo de vidrio de 45 ml homogeneizador. Enjuague los 15 ml tubo cónico con otro 1,5 ml IBM1 reunir cualquier muestra restante y agregar esto a el tubo homogeneizador de vidrio.
  10. Coloque el tubo homogeneizador de vidrio en un lleno hasta la mitad vaso o recipiente de plástico con hielo por lo que el homogeneizador de vidrio se mueve mínimamente dentro del vaso de precipitados.
  11. Homogeneizar la mezcla de tejidos / IMB1 con las maja PTFE unido a un motor impulsado homogeneizador de tejidos con 10 pases a 80 rpm. Sostenga la parte inferior de cada pasada por unos 2 seg.
  12. Transferir el homogeneizado de tejido a un nuevo tubo cónico de 15 ml y enjuagar el tubo homogeneizador de vidrio con 6,5 ml de IBM1. Verter la IBM1 en el tubo cónico de 15 ml que contenía homogeneizado de tejido.
  13. Haga girar el tubo cónico de 15 ml a 700 g durante 10 min a 4 ° C. Vierta suavemente el sobrenadante en un tubo de centrífuga de alta resistencia vidrio y desechar el sedimento.
  14. Girar el sobrenadante de la etapa anterior a 8000 xg durante 10 min a 4 ° C.
  15. Eliminar el sobrenadante IBM1 y volver a suspender el sedimento añadiendo lentamente 500 l de IBM2. Corte el extremo de una punta de pipeta y homogeneizar suavemente el pellet en IBM2 con mezcla y agitación movimientos. Añadir otros 4,5 ml de IBM2 a la mezcla después el sedimento está totalmente suspendida.
    Nota: Evite la trituración excesiva mientras que romper pedazos de pellets de mayor tamaño como tsu puede dañar las membranas mitocondriales.
  16. Haga girar el homogeneizado / tejido IBM2 a 8.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
    Nota: Este paso puede repetirse en un tubo de centrífuga de alta resistencia limpia para la cuantificación de proteínas más precisa de mitocondrias aisladas en el paso 4 ya BSA residual puede contribuir al contenido total de proteínas.
  17. Eliminar el sobrenadante y suavemente, pero totalmente volver a suspender el sedimento añadiendo dos incrementos de 25 l de IBM2 con una punta de pipeta con su punto de corte. Revuelva suavemente y mezclar la pastilla después de cada adición de 25 l de IBM2. Coloca esta población mitocondrial en hielo.

3. La homogeneización del Plenario del tejido lisado (Tiempo: ~ 45 min; se puede hacer durante el paso 7)

  1. Retire el músculo de que se colocó en el nitrógeno líquido desde el paso 2.3 y se incuba a temperatura ambiente hasta que esté completamente descongelado.
  2. Picar el tejido de ~ 30 seg en el hielo con unas tijeras de punta fina.
  3. Añadir dos cucharadas de 100 l de Zircoperlas de óxido nio al tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con tapón de rosca desde el paso 3.2 que contiene el tejido picado. Homogeneizar los tejidos en un homogeneizador de tejidos molino de bolas utilizando dos o tres ciclos de 5 min con un ajuste de velocidad de 4-6 (posición media).
  4. Gira la mezcla de la etapa 3.3 a 12.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante usando una punta de pipeta de 1.000 l después del giro y la transferencia en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Deseche la pastilla y colocar el sobrenadante en hielo.

4. Determinación de proteínas (Tiempo: ~ 30 min)

  1. Determinar la concentración de proteínas de todo el lisado de tejido (paso 3.4) y de la mitocondrial (paso 2,17) utilizando el kit de ensayo de proteína BCA de acuerdo con las especificaciones del fabricante.

5. Las mitocondrias integridad de la membrana; Citrato sintasa (CS) Actividad (Tiempo: ~ 15 min)

  1. Haga dos separadas 1: 20 diluciones de la población mitocondrial en agua de alta pureza. Añadir0,1% de Triton X-100 a una muestra y sonicar que en un ajuste bajo (765 Watts, amplitud de 2). Deje el otro dilución en el hielo. Devuelva la muestra en hielo después de la sonicación.
  2. Realizar un ensayo de la citrato sintasa tanto con la no sonicado y se sonicó diluciones mitocondriales usando un ensayo espectrofotométrico como se describió previamente 11,12.
  3. Determinar el porcentaje de membranas de mitocondrias intactas mediante el uso de las siguientes ecuaciones:
    (Actividad CS no sonicado ÷ sonicada CS actividad) * 100


100- N (porcentaje alcanzado desde arriba)

6. Las mitocondrias Calidad de aislamiento; Western Blot (Hora: De acuerdo con el Protocolo de Laboratorio)

  1. Realizar transferencia de Western en el lisado de tejido y mitocondrias aisladas como se ha descrito previamente 12.
    Nota: Utilice los anticuerpos primarios para GAPDH (1: 1000 dilución en el 5% de BSA / TBS-T) y COXIV (1: 1000 dilución en el 5% sin grasaleche / TBS-T) seguido de anti-cabra y conejo anticuerpos secundarios, respectivamente (1: 10.000).

7. respirometría Ensayo Run (Tiempo: ~ 90 min)

  1. Realizar ensayos respirométricos deseados utilizando la tecnología de medición de consumo basado en una microplaca de O 2 como se ha descrito anteriormente (véase el artículo de compañía y Rogers et al 8).
  2. Determinar la relación de control respiratorio (RCR) dividiendo Estado 3 por 4o Estado (RCR) o dividir 3u Estado por Estado 4o. Utilice el punto medio (promedio), o el más alto (estado 3) y tarifas más bajas (4o Estado) a partir de los restos de punto a punto en la determinación de RCR.

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Resultados

La actividad de la citrato sintasa sirve como medida para la integridad de la membrana desde la citrato sintasa se ​​encuentra en la membrana mitocondrial interna, y por lo tanto no debe estar presente en las suspensiones de las mitocondrias con membranas intactas. La figura 1 representa la actividad de la citrato sintasa en muestras no se sonicaron mitocondriales en comparación con sonicado muestras de la misma aislamiento. Sonicando los resultados mitocondrias en un aumento estadísticamente significat...

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Discusión

Los métodos presentados en este documento proporcionan una descripción detallada de un procedimiento de aislamiento mitocondrial a partir de cantidades mínimas (~ de 75-100 mg) de músculo esquelético de ratón. Este procedimiento de aislamiento es capaz de producir de alto funcionamiento, las mitocondrias pura (~ 450 g) como lo demuestra O 2 tasas de consumo, valores RCR, máxima actividad de la citrato sintasa y de expresión de proteínas de inmunotransferencia. Es importante destacar que las mitocondrias aisla...

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Divulgaciones

George Rogers es un empleado de Seahorse Bioscience que produce el instrumento para el que se modificó este protocolo.

Agradecimientos

El Instituto de Investigación de Ciencias de la Vida Fralin y el Núcleo de Fenotipado Metabólico de Virginia Tech apoyaron este trabajo.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Esencialmente grasoSigma AldrichA6003N/A
Libre de ácido- BSA
Tris/HClPromegaH5123N/A
KCLSigma AldrichP9541N/A
Tris BasePromegaH5135N/A
EDTASigma AldrichE6511N/A
EGTASigma AldrichE4378N/A
SacarosaSigma AldrichS7903N/A
D-ManitolSigma Aldrich63559N/A
Tripsina-EDTA (0,25%), rojo fenolThermo Scientific25200-056N/A
Cloruro de sodio
Cristales blancos o polvo cristalino
≥ 99.0 %		Fisher ScientificBP3581N/A
Dodecil sulfato de sodioSigma AldrichL3771 N/A
Desoxicolato de sodioSigma AldrichD6750 N/A
Éter de polioxietileno (12) nonilfenil, ramificadoSigma Aldrich238651N/A
Hojas de afeitar de un solo filoFisher Scientific12-640N/A
Falcon- 100 uM Coladores de células de nailonFisher Scientific352360N/A
Stop Proteasa & Cóctel de inhibidor de fosfato ThermoScientific1861284N/A
Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml con tapón de roscaThermo Scientific3474N/A
Perlas de óxido de circonioFisher ScientificC9012112N/A
Anticuerpo GAPDH (1D4)Santa Cruz Biotechnologysc-59540N/A Anticuerpo
Anti-COXIVSeñalización Celular4844sCualquier proteína de la membrana interna mitocondrial será suficiente
Peroxidasa conjugada affinipure Burro, Anti Conejo IgG (H + L)Jackson ImmunoResearh711-035-152N/A
Peroxidasa conjugada affinipure Cabra, Anti Ratón IgG (H + L)Jackson ImmunoResearh115-001-003N/A
Triton-X100Sigma AldrichX100N/A
Pierce BCA Protein Kit  Thermo Scientific23225N/A
Ácido pirúvico, 98%Sigma Aldrich107360Almacenar en 4 & grados; C, pH a 7.4 con KOH antes de usar en el ensayo respirométrico
Ácido succínicoSigma AldrichS9512Almacene a temperatura ambiente, pH a 7.4 con KOH antes de usar en el ensayo respirométrico
L(-) Ácido málico, BioXtra, ≥ 95%Sigma AldrichM6413Almacenar a temperatura ambiente, a 7.4 con KOH antes de usar en el ensayo respirométrico
Ácido L-glutámicoSigma AldrichG1251Almacenar a temperatura ambiente, a 7.4 con KOH antes de usar en el ensayo respirométrico, a 7.4 con KOH antes de usar en el ensayo
Palmitoil Cloruro de L-carnitinaSigmaAldrich P1645Almacenar a -20 °C
Oligomicina A, ≥ 95% (HPLC)Sigma Aldrich75351Tienda a -20 ° C
Cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi)Sigma AldrichC2920Almacenar en 2-8 ° C
fenilhidrazona
≥ 98% (TLC), polvo [FCCP]
Antimicina A de streptomyces sp.Tienda Sigma AldrichA8674a -20 ° C
Adenosina 5′-difosfato sal monopotásica deshidratada [ADP]Sigma AldrichA5285Almacenar en -20 ° C, hasta 7,4 con KOH antes de su uso en el ensayo
RotenonaSigma AldrichR8875Almacenar a temperatura ambiente
respirométrico respirométrico

Referencias

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