Este manuscrito describe cómo las tasas de metabolismo de herbicidas se pueden cuantificar de manera efectiva con hojas extirpadas de una maleza dicotiledónea, reduciendo así la variabilidad y eliminando cualquier posible efecto de confusión de la absorción o translocación de herbicidas típicamente observada en ensayos de plantas enteras.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Medición de Precios de los herbicidas Metabolismo en Dicot malas hierbas con un ensayo extirpados Leaf
En este artículo
Resumen
Resumen
Con el fin de aislar y determinar con precisión las tasas de metabolismo de herbicidas en una maleza dicotiledónea obligada, el cáñamo acuático (Amaranthus tuberculatus), desarrollamos un ensayo de hojas extirpadas combinado con una estrategia de clonación vegetativa para normalizar la absorción de herbicidas y eliminar la translocación como factores contribuyentes en las poblaciones de cáñamo acuático resistentes a herbicidas (R) y sensibles (S). Los análisis biocinéticos de plaguicidas orgánicos en plantas suelen incluir la determinación de la absorción, la translocación (entrega al sitio objetivo), el destino metabólico y las interacciones con el sitio objetivo. El metabolismo de los herbicidas es un parámetro importante que se mide en las malezas resistentes a los herbicidas y en los cultivos tolerantes a los herbicidas, y normalmente se logra con pruebas de planta entera utilizando herbicidas radiomarcados. Sin embargo, una dificultad con la interpretación de los parámetros biocinéticos derivados de los métodos de toda la planta es que la translocación a menudo se ve afectada por las tasas de metabolismo de los herbicidas, ya que los metabolitos polares generalmente no son móviles dentro de la planta después de las reacciones de desintoxicación de herbicidas. Las ventajas del protocolo descrito en este manuscrito incluyen la determinación reproducible, precisa y rápida de las tasas de degradación de herbicidas en poblaciones R y S, una disminución sustancial en la cantidad de herbicida radiomarcado consumido, una gran reducción en los materiales vegetales radiomarcados que requieren mayor manipulación y eliminación, y la capacidad de realizar experimentos con herbicidas radiomarcados en el laboratorio o en la cámara de crecimiento en lugar de en un invernadero. A medida que la resistencia a los herbicidas continúa desarrollándose y extendiéndose en las poblaciones de malezas dicotiledóneas en todo el mundo, el método de ensayo de hojas extirpadas desarrollado y descrito en este documento proporcionará una técnica invaluable para investigar la resistencia basada en sitios no objetivo debido a las tasas mejoradas de metabolismo y desintoxicación de herbicidas.
Introducción
Resistencia a los herbicidas en las malezas presenta una seria amenaza para la producción mundial de alimentos y fibras 1,2. Actualmente, miles de poblaciones y biotipos resistentes de más de un centenar de especies de malas hierbas en todo el mundo se han documentado y estudiado 3. Un mecanismo importante que confiere resistencia a los herbicidas en las plantas es la alteración de los herbicidas genes y las proteínas diana del sitio, incluyendo mutaciones genéticas que afectan a la cinética de unión de la proteína herbicida o la amplificación del gen diana del sitio 2. Desintoxicación metabólica a través de actividades elevadas de mo....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Material Vegetal, condiciones de crecimiento, y vegetativo Clonación
Nota: Tres poblaciones rudis fueron investigados en esta investigación: MCR (del condado de McLean, IL), ACR (de Adams County, IL), y WCS (de Wayne County, IL) (Tabla 1).
- Recoger y suspender semillas rudis en 0,1 g de agar L -1: solución de agua a 4 ° C durante al menos 30 días para mejorar la germinación. Nota: Algunas poblaciones rudis están latentes, pero este paso ayuda a superar la latencia y hacer germinar la semilla de manera más uniforme.
- Germinar semillas de cada población rudis (como
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Se detectaron grandes diferencias en las tasas de metabolismo mesotriona entre cualquiera WCS o ACR y MCR (Figura 1). En cada punto de tiempo, MCR había metabolizado mesotriona más rápidamente que las dos poblaciones-mesotriona sensible, WCS y ACR, que se correlaciona con las respuestas fenotípicas planta entera anteriores 11. Por clonación suficientes plantas desde una única planta parental de cada población, los análisis tiempo-por supuesto metabolismo herbicida son uniformes y reproducible.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El método de hoja extirpada descrito en este documento se ha utilizado anteriormente en la investigación del metabolismo primisulfuron en hojas de maíz 15, pero nuestros resultados demuestran que este protocolo también es eficaz, preciso y reproducible para medir el metabolismo de los herbicidas en una especie de maleza dicotiledóneas 12. Una ventaja importante de la técnica de hoja extirpada en comparación con los estudios de la planta entera es que una hoja extirpada es independiente de los patro.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a Wendy Zhang, Austin Tom, Jacquie Janney, Erin Lemley y Brittany Janney por su ayuda con el crecimiento y las extracciones de las plantas, al Dr. Anatoli Lygin por su ayuda con los análisis cromatográficos y a Syngenta Crop Protection por su financiación.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | para semillas pregerminadas |
| Medio para macetas | Sun Gro Horticulture | 49040233 | para el crecimiento de las plantas |
| Nutricote | Agrivert | TOTAL BLEND 13-13-13 T100 | fertilizante de liberación lenta |
| Cámara de crecimiento E15 | Controlled Environments Limited | 20207 | de plantas |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | tampón para hojas extirpadas |
| HCl (concentrado) | Fisher Scientific | A144500 | ajustar el pH de las sales tampón |
| Murashige y Skoog (MS) | Sigma-Aldrich | M0404 | incubación de hojas extirpadas |
| Metanol | Fisher Scientific | A452-4 | lavados de hojas después de la incubación |
| Acetona | Sigma-Aldrich | 179124 | extracciones de plantas |
| Acetonitrilo (grado HPLC) | Macron Fine Chemicals | MKH07610 | HPLC fase móvil |
| ácido fórmico | Mallinckrodt Analítica | MK259205 | acidificar fase móvil pH |
| Microcentrífuga | Eppendorf | 5417R | Tubos de 1,5 o 2,0 ml |
| Centrífuga (con control de temperatura) | Eppendorf | 5810R | Tubos de 15 o 50 ml Tubo |
| centrífuga de polipropileno | Corning Inc. | 430790 | 15 ml, estéril |
| Evaporador rotativo | BÜ Muestras | plantas de concentrado | R200 |
| Espectrometría de centelleo líquido (LSS) | Packard Instruments | 104470 | cuantificar 14C |
| Cromatografía líquida de alta resolución | Perkin Elmer | N2910401 | resolver metabolitos de herbicidas |
| Analizador de centelleo de flujo | LabLogic System | 1103303 | para el análisis de HPLC de 14C |
| Hypersil Gold C18 columna | Termocientífico | 03-050-522 | Fase reversa |
| Cóctel Ultima-Flo M | Perkin Elmer | 6013579 | para analizador de centelleo |
| de flujo Cóctel de centelleo (ScintiVerse BD) | Fisher Scientific | SX18 | para LSS; |
| homogeneizador de laboratorio | Kinematica | CH-6010 | Homogeneizar muestras de hojas |
Referencias
- Yu, Q., Powles, S. Metabolism-based herbicide resistance and cross-resistance in crop weeds: A threat to herbicide sustainability and global crop production. Plant Physiology. 166, 1106-1118 (2014).
- Powles, S. B., Yu, Q.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
