El efecto de los genes y el medio ambiente en el espacio social de Drosophila melanogaster se puede cuantificar a través de un paradigma analítico potente pero sencillo. Mostramos aquí diferentes factores que pueden afectar a este espacio social, y por lo tanto deben ser tenidos en cuenta a la hora de diseñar experimentos en este paradigma.
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Artículo de método
Condiciones que afectan Espacio Social en
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Resumen
Resumen
El ensayo espacio social descrito aquí puede ser utilizado para cuantificar las interacciones sociales de Drosophila melanogaste r - u otros insectos pequeños - en una manera directa. Como ya hemos demostrado 1, en una cámara de dos dimensiones, que las moscas primera fuerza para formar un grupo apretado, posteriormente que les permite tomar su distancia preferida entre sí. Después de que las moscas se han asentado, medimos la distancia al vecino más cercano (o espacio social), el procesamiento de una imagen estática con el software en línea gratis (ImageJ). El análisis de la distancia al vecino más cercano permite a los investigadores para determinar los efectos de los factores genéticos y ambientales en la interacción social, mientras que el control de los posibles factores de confusión. Diversos factores, como la capacidad de escalada, la hora del día, el sexo, y el número de moscas, puede modificar el espaciamiento social de las moscas. Por ello, proponemos una serie de controles experimentales para mitigar estos efectos de confusión. Este ensayo puedeser utilizado para al menos dos propósitos. En primer lugar, los investigadores pueden determinar cómo su turno ambiental favorito (como el aislamiento, la temperatura, el estrés o toxinas) afectará el espaciamiento social de 1,2. En segundo lugar, los investigadores pueden diseccionar las bases genéticas y neuronales de esta forma básica de la conducta social 1,3. En concreto, se utilizó como una herramienta de diagnóstico para estudiar el papel de los genes ortólogos se cree que participan en el comportamiento social en otros organismos, tales como genes candidatos para el autismo en los seres humanos 4.
Introducción
Las interacciones sociales son cruciales para el buen desarrollo y la salud de los individuos dentro de un grupo como un todo, y se pueden observar a través de numerosas especies, desde los seres humanos (Homo sapiens) a organismos más simples como la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster) 5,6. Una mosca de la fruta individuo o medios comunes comparten humana para procesar la información sensorial durante estas interacciones, ya sea: auditiva, visual, olfativa, táctil, o gustation. Nosotros y otros la hipótesis de que existe una neurocircuitos potencialmente compartida subyacente respuestas de comportamiento a las interacciones sociales y que las células neuronales y genes implicados podría ser evolutiva conservan 7. Una vez se ha producido la interacción inicial, el espacio social entre los individuos que interactúan ya sea para aumentar (evitación social 8) o disminuir (formación de grupos / agregación 5). Interacciones más complejas, como la agresión o el noviazgo, entonces pueden tener lugar.
Ni las herramientas y métodos sofisticados, ni grandes inversiones en tiempo y la formación son necesarios para cuantificar este sencillo formulario de la conducta social, por lo que es una herramienta de análisis de gran alcance. Aquí le explicamos un protocolo sencillo que cuantifica la distancia inter-mosca, o el espacio social, para evaluar la interacción social en grupos estables de Drosophila melanogaster, como se usa en los siguientes estudios 1-4,9. Espacio social se refiere a una medida de la distancia entre una mosca y su vecino más cercano 10. El espacio social es constante para una determinada población de D. melanogaster cuando se conservan las condiciones experimentales (un promedio de aproximadamente dentro de 1-2 cuerpo longitudes), y varía con respecto a la experiencia social de las moscas, lo que aumenta si el individuo se ha mantenido en forma aislada 1. Visión adecuada es necesaria para mantener la distancia social normal, pero no odorantes clásicos o CVA percepción 1. Medida del espacio social puede ser asíutilizado como una herramienta de diagnóstico para analizar las interacciones sociales y cuantificar el comportamiento social en D. melanogaster 1. Se describe aquí en detalle cómo realizar esta cuantificación, y en qué medida las variables experimentales comunes afectan a este comportamiento.
Se demuestra que la orientación de la cámara en la que se realiza el ensayo, así como el número de moscas - en una medida - hacer afecta el espacio social. Se ha demostrado previamente que la geometría de la cámara afecta el movimiento de exploración espontánea de moscas 11,12 y este fenómeno puede en última instancia afectar su decisión de asentarse. Sin embargo, siempre que la densidad de moscas (mosca / cm 2) y la orientación cámara se mantiene la misma, el espacio social de las moscas también permanece constante. La robustez de este ensayo se ilustra por el hecho de que los laboratorios independientes usando diferentes tamaños de cámara, la forma y la orientación se puede replicar el resultado mostrado por mutantes de la whgen ite (que afecta la pigmentación de los ojos), que es un espacio social incremento (triángulo vertical u horizontal en 1 círculo, cuadrado horizontal con el flujo de aire en 3).
Nuestros resultados también indican que el mantenimiento de la hora a la que se realiza el experimento espacio social es crucial para la consistencia de los resultados, como se muestra que los varones, pero no en las mujeres, son más separados por las noches. Sin embargo, las diferencias observadas entre las horas diurnas y nocturnas no se deben a diferencias de actividad de las moscas, y discutimos los argumentos que indican que los niveles de actividad no se correlacionan con el espacio social.
Por último, hay bases genéticas a la determinación del espacio social, como lo indica el mutante blanco ya se ha descrito 1,3, y las diferencias entre diversas cepas puras y silvestres de moscas que aquí presentamos.
Por lo tanto, este ensayo hace una excelente herramienta fo el estudio de los efectos de la genética y los factores ambientales.
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Protocolo
1. Equipos y Reactivos Creado Dentro de la casa (Ver Lista de Materiales de los demás)
- Preparar un aparato de anestesia frío Drosophila como se describe anteriormente 8.
- Preparar un aspirador de mosca como se describió anteriormente 13.
- Preparar las cámaras y los titulares de espacios sociales.
- Ordenar o hacer cristales y separadores acrílicos para crear las cámaras espaciales sociales. Cada cámara de espacio social consta de dos paneles de vidrio cuadradas (17,6 cm por 17,6 cm, con un espesor de 0,3 cm), dos espaciadores de acrílico triángulo rectángulo (con una altura de 16,5 cm, una base de 8,9 cm, con un espesor de 0,3 cm ), y dos espacios rectangulares (9 cm por 1,5 cm con un espesor de 0,3 cm) (Figura 1a).
- Montar el cristal y acrílico cámara de espacio social tal que es idéntica a la cámara en la Figura 1B. Para ello, inicie mediante la colocación de un separador triangular plana en la parte superior de un panel cuadrado de vidrio de tal manera que el ángulo rectodel espaciador triangular está alineado con una de las esquinas de la panel cuadrado. A continuación, coloque el segundo espaciador plana triangular en la parte superior del panel de la plaza, lo que refleja el primer separador triangular.
NOTA: Asegúrese de usar guantes para no contaminar las piezas con aceites y esencias de sus manos. - Coloque dos pequeños separadores rectangulares planas en la parte superior del panel cuadrado, a lo largo del lado del panel que no está cubierto. Los espaciadores de acrílico en la parte superior del plano cuadrado ahora deben formar una arena triangular.
- Coloque un segundo panel cuadrado de vidrio en la parte superior de los separadores acrílicos de tal manera que se alinea sobre el panel original de vidrio abajo.
- Utilice cuatro clips de la carpeta para asegurar los paneles y separadores para formar la cámara de espacio social. Colocar un clip cerca de la esquina, sobre el lado largo de cada uno de los espaciadores triangulares, asegurando ellos dentro de los paneles de vidrio. En estos mismos lados, colocar un clip en la esquina adyacente, sobre cada uno de los separadores rectangulares, asegurándolos enlado de los cristales.
- Montar un soporte de apoyo y una abrazadera matraz de tal manera que la abrazadera mantendrá la cámara de espacio social en una posición vertical, como la cámara de espacio social descansa sobre su borde en la parte superior de la superficie de trabajo.
- Para cada repetición en el experimento, montar una cámara de espacio social y apoyar a ponerse de pie.
- Preparar un mecanismo de respuesta ensayo de escalada para comprobar la capacidad de la escalada de las moscas probadas.
- Utilice un aparato de contracorriente, como se describió previamente 14,15.
- Garantizar condiciones de iluminación homogéneas mediante la realización del experimento en una superficie cubierta con una tapa banquillo blanco y delante de un fondo blanco.
2. Preparación de las moscas antes de que el experimento
- Mantener moscas en botellas que contengan estándar de Drosophila vuelan alimentos. Manténgalos en una cámara de incubación a 25 ° C en un 12 horas de luz / oscuridad ciclo.
- Uno o dos días antes de la eXperiment, recoger y sexo vuela bajo anestesia frío, como se describió anteriormente 8.
- Enfríe el aparato de anestesia fría a -4 ° C. Lugar vuela en 50 tubos de plástico ml. Sumergir completamente los tubos de plástico que contienen las moscas en el hielo en un cubo de hielo aislados, espere al menos 5 minutos para las moscas a convertirse inmóvil.
- Colocar las moscas en la lámina de polietileno del aparato de anestesia frío. A RT, usar un microscopio estereoscópico para separar los machos de las hembras. Mantener las moscas, en grupos, en viales que contienen norma Drosophila alimentos volar, que no exceda de 40 moscas por vial.
- Dos horas antes del comienzo del experimento, asegurar que la temperatura de la habitación donde se realizó el experimento es de entre 24-25 de ° C y la humedad es de aproximadamente 50%.
- Transfiera las moscas en nuevos viales que contienen los alimentos, y colocarlos durante 2 horas sobre la superficie de trabajo, donde se llevará a cabo el experimento.
NOTA: Para estos experiments, las cepas de moscas utilizadas fueron las cepas de Drosophila melanogaster: Canton-especiales o de Cantón-S (CS), w 1118 Cs 10 (o W - w 1118 outcrossed 10 veces para Canton-S), Oregon y Samarkand moscas eran todos de nuestro laboratorio stocks 16; Elwood moscas se recolectaron en el otoño de 2011 en el barrio Elwood de Huntington, en Long Island, Nueva York, EE.UU. 8. Además, cuando se especifique lo contrario, se obtuvieron los resultados que se presentan con el Cantón-S vuela (en tonos de rojo).
3. Realización del experimento
- Realizar el experimento 24:00-15:00 (hora Zeitgeber - el tiempo en horas después de la aparición de la luz - de ZT 4 a 7).
- Prepare la cámara de espacio social para la transferencia de las moscas.
- Coloque un piso cámara de espacio social en una superficie de trabajo, con el lado que contiene separadores rectangulares más cercanos a tu cuerpo.
- Retire oClip ne más cercana a su cuerpo y deslice un espaciador rectangular hacia el exterior, creando un espacio de aproximadamente 1 cm entre los separadores rectangulares.
- El uso de cinta y un marcador, etiquetar la cámara de espacio social en una esquina superior con el sexo, la tensión, y el número de repetición. Tenga cuidado para asegurarse de que la cinta no cubre parte de la arena triangular interior.
- Transfiera las moscas en la cámara de espacio social.
- Transferencia de pájaro desde su frasco que contiene el alimento en un nuevo vial vacío. Aspirar vuela desde el vial vacío y transferirlos a la cámara de espacio social.
- Inhale sacar las moscas en la punta del aspirador. Coloque la punta en el espacio de 1 cm entre los separadores rectangulares de la cámara de espacio social y exhalar a un ritmo constante para forzar las moscas a la arena triangular interior.
- Inmediatamente deslice el espaciador rectangular en su lugar, el cierre de la base de la arena triangular interior, y colocar el clip de la carpeta de nuevo.
- Transferencia de pájaro desde su frasco que contiene el alimento en un nuevo vial vacío. Aspirar vuela desde el vial vacío y transferirlos a la cámara de espacio social.
- En una almohadilla palpitante, que se encuentra en diferentes banco que donde el trabajo experimental se lleva a cabo, mantenga la cámara de espacio social en posición vertical de manera que los separadores rectangulares están en la parte inferior. Libra tres veces para asegurar todas las moscas han caído a la parte inferior de la arena.
NOTA: Debido al espaciador de acrílico que salen de la cámara de tamaño más pequeño (Figura 1D), golpear los codos sobre la superficie de trabajo, manteniendo una sujeción segura en el aparato para asegurarse de que las moscas han caído hasta el fondo. - Iniciar un temporizador.
- Coloque la cámara de espacio social en la superficie de trabajo y el uso de la abrazadera soporte de la ayuda y el frasco para mantenerlo en posición vertical. Coloque una regla o una pegatina de longitud conocida plana contra la cámara de espacio social, pero no cubre ninguna parte de la arena triangular interior.
- Para los experimentos en posición horizontal, no coloque la cámara de espacio social en el soporte de la ayuda; lugar poner la cámara plana espacio social en la superficie de trabajo.
- Cuando las moscas se han establecido, por lo general después de alrededor de 30 minutos, tomar una fotografía de la cámara de espacio social. Asegúrese de que la trama contiene todo el ámbito interno triangular, el gobernante, y la etiqueta.
- Repita el experimento para cada genotipo y condición (idealmente 3 repeticiones internas y 3 repeticiones independientes).
4. Análisis de los datos Espacio Social
- Importe las siguientes macros en ImageJ 17
- ImageJ está disponible aquí: http://rsbweb.nih.gov/ij/.
- Puede crear un comando "Medir Distancias" en el menú de plugins salvando las macros a continuación en un archivo llamado 'Measure_Distances.txt' en la carpeta ImageJ / plugins, en la subcarpeta macro, y el uso de la Ayuda> comando Actualizar menús.
- Copiar en un archivo .txt las macros que se proporcionan en los datos suplementarios y fueron publicados originalmente en 3.
- Sube las imágenes a un ordenador y abrir uno picture usando ImageJ.
- Crear una escala dibujando una línea desde las 0 cm a 1 cm de marcas en la regla en la imagen, y en la ficha Analizar, seleccione el conjunto de características de escala para establecer una escala de 1 cm para esa distancia (el mismo enfoque para la pegatina de longitud conocida). Elija la opción global antes de aplicar la escala de la imagen.
- Recortar la imagen utilizando la función de la cosecha bajo la etiqueta de imagen tal que incluye todas las moscas, mientras se quita como gran parte del resto de la imagen de lo posible.
- Haga la imagen en blanco y negro por la elección de 8 bits de la opción Tipo en la ficha Imagen.
- Retire todo el ruido de fondo de la imagen, vaya a la función de umbral bajo la opción Ajuste de la ficha Imagen. Arrastre los reguladores para mejorar o eliminar el contraste para que el cuerpo de cada mosca se puede ver claramente y sin cualquier otra marca en la imagen. Si hay marcas que no son moscas, capturarlos con la herramienta rectangular y eliminarlos.
- Ajuste elmediciones mediante el uso de la herramienta Medidas Set en la ficha Analizar. Seleccione Area, Centro de la Misa, centroide, y display Label. A continuación, elija las partículas Analizar cuentan en la ficha Analizar para crear una lista numerada de todos los puntos negros representan las moscas.
- Cuando se usa Analizar partículas; tamaño del conjunto de 0,01 a 0,1 (no elija la unidad píxel); circularidad 0,00-1,00; muestran contornos; mostrar los resultados, y añadir a la gerente.
- Asegúrese de que cada punto negro (cada partícula) es una representación exacta de las moscas que se encuentran en la imagen original, mediante la comparación de la lista numerada a la imagen original.
NOTA: Si algunas moscas que están muy próximos entre sí se cuentan como una partícula, dibujar manualmente una línea blanca para separar las dos moscas en la imagen binaria.
- Mientras esté seleccionada la lista, utilice el vecino más cercano - Lista Distancias macro bajo la segunda opción Macros en la pestaña de Plugins para crear una nueva lista que contiene las distancias, en cm, de each volar a su vecino más cercano.
- Copie las distancias de vecinos más cercanos de ImageJ y pegar en una columna de un programa de hoja de cálculo.
- Recopilar todos los datos de cada repetición en la misma hoja de cálculo y organizar por el genotipo y el estado.
- Realizar análisis de datos utilizando el software estadístico. En este experimento, Graph Pad Prism (versión 6 para MacOSX, GraphPad Software, San Diego California EE.UU., www.graphpad.com) se utilizó para llevar a cabo un modelo lineal, y Análisis de Kruskal-Wallis, Tukey y de post-hoc pruebas de Dunnet.
- La distribución de las distancias sigue una distribución no paramétrica 1, y los datos se representan como caja y bigotes de Tukey (para eliminar valores atípicos).
5. Escalada Ensayo (Comportamiento de control)
- Utilice un ensayo de escalada como un control de moscas de la prueba de escalada capacidad 14,15,18.
- Utilice el aparato de contracorriente de tal manera que tres ensayos cuna ejecutarse en paralelo.
- Transferencia de 50 a 100 moscas ingenuos (moscas que no han sido probados antes) en tres viales de prueba diferentes y complementos ellos en la 1ª, 3ª y última ranuras en la parte inferior del aparato de contracorriente, con viales vacíos frescas en los lugares opuestos.
- Colocar los viales frescas, vacíos en las ranuras vacías en la parte inferior del aparato.
- Pulse la flecha abajo del aparato tres veces, de tal manera que todas las moscas son en la parte inferior de cada tubo, para iniciar el experimento.
- Comienza el temporizador de 15 segundos (tiempo suficiente para que ~ 100% de los 3-7 días de edad Canton-S para llegar a la parte superior del vial - ver Figura 3F).
- Deslizar la parte superior del aparato de contracorriente, para desplazar los mejores viales por una ranura.
- Recoger moscas tocando el aparato hacia abajo, para que todas las moscas en los viales inferiores.
- 1 ª y 2 ª tubos (o 3 ° y 4 °, 5 ° y 6º) corresponden respectivamente a las moscas que no alcanzaron al principio y las moscas que alcanzaron el vial superior.
- Calcular el Índice de Desempeño (PI).
- Cuente el número de moscas en cada vial.
- El PI es el porcentaje de moscas capaces de trepar sobre el tubo superior.
- Los medios de la PI siguen una distribución normal 1, y los datos se representan como gráficos de columna de error estándar media más o menos a la media (SEM).
NOTA: Como alternativa, la PI puede ser calculada como el porcentaje de moscas capaces de alcanzar la parte superior del vial inferior (por moscas mayores, 5 seg es el tiempo suficiente para cuantificar una diferencia en la capacidad de subida entre infectado y no infectado 12 días de edad Canton-S cuantificados a partir de una imagen fija: ver resultados). Otros han utilizado diferentes medidas de actuación en geotaxis negativos inducidos sobresalto-, que también son apropiados para cuantificar la capacidad de subida 19-22.
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Resultados
La cámara de espacio social se puede utilizar como una herramienta para cuantificar el comportamiento social de Drosophila melanogaster. Espaciadores de acrílico y paneles de vidrio se recortan para formar un espacio triangular interior que proporciona un área de dos dimensiones en el que las moscas pueden formar grupos estables sin la presencia de muchas señales de confusión potenciales. Cuando las moscas se trasladan a la arena vertical, que se asustan al ser golpeado ligeramente hacia abajo, y responden por ...
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Discusión
En este protocolo, se describe un procedimiento detallado para la cuantificación del espacio social. Algunos pasos cruciales para asegurar el experimento tiene éxito son: 1) Siempre use guantes al limpiar y configurar el aparato, para mantener sus propios aceites y aromas de la cámara interior del aparato, 2) asegurarse de moscas se recogen al menos un día antes el experimento para reducir los posibles efectos de la anestesia frío, 3) 2 h antes del experimento proporciona nuevos viales que contienen los alimentos fresco...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Los autores quieren agradecer al Dr. Tadmiri Venkatesh por su estímulo para preparar este manuscrito, a Dova Brenman y Selwyn Chui por sus comentarios constructivos, a Elyssa Burg y Wayne Rasband por diseñar la macro en ImageJ para todas las distancias entre moscas y para las distancias de los vecinos más cercanos. Los autores también quieren agradecer a los revisores por sus comentarios constructivos.
A.A.A, M.C.C. y A.F.S fueron responsables del diseño de la investigación; S.N.J., A.A.A., M.N., Z.R. y A.J.M. realizaron los experimentos. A.A.A, M.N., A.J.M. y M.C.C y A.F.S. analizaron los datos; A.R.M. y A.F.S. escribieron el manuscrito.
Este trabajo fue apoyado por los premios de investigación PSC-CUNY, financiados conjuntamente por el Congreso de Personal Profesional y la Universidad de la Ciudad de Nueva York para A.F.S.; por fondos internos de Western University para A.F.S.; por una beca de especialización en Matemáticas, Biología, Química y Geología para profesores en formación y por una beca de la Alianza Louis Stokes para la Participación de las Minorías para A.A.A.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Microscopio estereoscópico con zoom | Nikon | SMZ-645 | Cualquier otro visor estándar para el manejo de moscas funcionaría |
| Pinceles pequeños | para empujar moscas | ||
| Jazz-mix | Fisher | 33545 | cualquier otro alimento estándar para drosophila funcionaría |
| Mini-Alarma Temporizador/Cronómetro | |||
| Bolígrafos | |||
| Cinta | |||
| Pinzas de carpeta de | Grapas | para mantener las cámaras unidas: Clips medianos de 1-1/4" (32 mm) con capacidad de 5/8" | |
| Soportes | pequeños Carolina | 707161 | para mantener las cámaras en una orientación vertical |
| Abrazaderas de bureta | Carolina 707362 | ||
| Cámara digital | Nikon | Coolpix S8000 | para tomar las fotografías fijas |
| Regla | para poder escalar el cuadro de | ||
| tríptico y la tapa | para proporcionar un fondo blanco y una luz homogénea. | ||
| Almohadilla de golpeo: | cualquier alfombrilla | ||
| Prisma 6 | GraphPad Software Inc. | Prisma 6 para Mac OS X | Cualquier software de análisis estadístico con t-test, ANOVA de un factor y de dos vías funcionaría |
Referencias
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