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Generación de agregados de células madre embrionarias de ratón que Muestre Symmetry Breaking, Polarización y Comportamiento Colectivo Emergente

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DOI:

10.3791/53252

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24 de noviembre de 2015

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1Department of Genetics, University of Cambridge, 2Hubrecht Institute, Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences

En este artículo

Resumen

Hemos desarrollado un protocolo para generar agregados de células madre embrionarias de ratón que muestran autoorganización, ruptura de simetría y elongación paralelas al desarrollo axial. Esta técnica permite el estudio de los procesos de desarrollo axial y la generación de tipos celulares que de otro modo serían difíciles de realizar en el cultivo monocapa.

Resumen

Hemos desarrollado un protocolo de mejora de la cultura actual embrioide Cuerpo (EB), que permite el estudio de la auto-organización, ruptura de la simetría, la elongación axial y la especificación del destino celular utilizando agregados de ratón las células madre embrionarias (mESCs) en cultivo en suspensión. Un pequeño número de mESCs se agregan en medio basal durante 48 horas en placas de 96 pocillos no de cultivo de tejidos tratados, fondo en U, después de lo cual son competentes para responder a las señales experimentales. Después del tratamiento, estos agregados comienzan a mostrar signos de polarización de la expresión génica y alterar gradualmente su morfología de una masa esférica de células a una estructura alargada, bien organizado en la ausencia de señales de asimetría externos. Estas estructuras no sólo son capaces de mostrar marcadores de las tres capas germinales, pero activamente muestran los movimientos de gastrulación-como, evidenciado por un desprendimiento direccional de las células individuales del agregado, que se produce fundamentalmente en una región de la estructura alargada. Este protocol proporciona un método detallado para la formación reproducible de estos agregados, su estimulación con las señales tales como la activación de Wnt / β-catenina y la inhibición BMP y su análisis por un solo punto de tiempo o microscopía fluorescente de lapso de tiempo. Además, se describen las modificaciones a los actuales procedimientos de tinción de embriones de ratón todo el montaje para inmuno análisis de marcadores específicos dentro de los agregados fijos. Los cambios en la morfología, la expresión génica y la longitud de los agregados se pueden medir cuantitativamente, proporcionando información sobre cómo las señales pueden alterar suertes axiales. Se prevé que este sistema se puede aplicar tanto al estudio de eventos tempranas del desarrollo como desarrollo axial y la organización, y en términos más generales, los procesos de auto-organización y la toma de decisiones celular. También puede proporcionar un nicho adecuado para la generación de los tipos presentes en el embrión que no se pueden obtener a partir del cultivo de células adherentes convencionales tales como neuronas motoras de la médula y la columna vertebral.

Introducción

El estudio y la comprensión de las decisiones de destino celular en el desarrollo de los mamíferos temprana pueden hacer uso de los cultivos de células madre embrionarias (CES), poblaciones clonales derivadas de blastocistos que tienen la capacidad de auto renovarse y diferenciarse en todos los tipos celulares de un organismo es decir., son 1,2 pluripotentes. Mientras que estas culturas han sido y siguen siendo útiles para la comprensión de las bases moleculares de las decisiones de destino celular, son incapaces de reproducir algunos de los arreglos espaciales y comportamientos globales que se generan en los embriones durante la gastrulación. En el embrión, el proceso de la gastrulación transforma una sola capa epitelial en las tres capas germinales distintas y dota al embrión con una organización anteroposterior abierta 3-5. Los intentos para recapitular estos eventos ex vivo se han basado en la generación de agregados tridimensionales de los CES, se hace referencia a cuerpos como embrioides (EBS), y sometiéndolos to condiciones de diferenciación 6,7. Estos agregados pueden ser inducidas a diferenciarse en muchos tipos de células diferentes, algunos de los cuales son incapaces de obtener o inducida con baja eficiencia en la cultura adherente o no se pueden producir en absoluto; por ejemplo, sangre. 8 y germinales primordiales células 9. Una limitación en el uso de EBs sin embargo, es que son incapaces de mostrar el comportamiento morfogenética, distribución capa germinal u organización axial que son las principales características del embrión en desarrollo, dando como resultado la desorganización espacial 6,10. En un informe, tratamiento de EBs con Wnt conduce a una polarización débil en la expresión génica en algunos agregados pero no morfogénesis clara se observa 7. En los informes más recientes, EBs que se han cultivado durante períodos prolongados de tiempo desarrollan estructuras anteriores tales como retinas, la corteza y las células sensoriales del oído interno, que imitan sus homólogos embrionarias pero desarrollan sin el contexto de un organizat axialion 11-13.

Un informe de Marikawa et al. 14, mientras que el trabajo con los agregados de células de embrión de P19 de ratón de carcinoma (CE) formados por el método de gota colgante, informó la aparición de estructuras alargadas de origen mesodérmico una reminiscencia de los alargamientos que se observan con exogastrulae en anfibio y embriones de erizo de mar y Keller explantes 15-18. Como esto no se había observado con el ratón las células madre embrionarias (mESCs), se intentó reproducir el comportamiento observado con P19 células EC usando agregados de mESCs 19 y nos informan de las condiciones de cultivo que llevan a su ruptura de la simetría y la elongación axial. Una diferencia importante del trabajo con células P19 es que el protocolo de agregación se describe aquí se lleva a cabo en una placa de 96 pocillos, similar a la descrita por Eiraku et al. 20, en lugar de gotas colgantes. Este cambio se tradujo en un aumento de la eficiencia en términos de recuperación global y en tantoreproducibilidad intra e inter-experimental. Es importante destacar que el mantenimiento de los agregados en los pozos individuales asegura que la fusión entre los agregados (común cuando la agrupación de los agregados de gotas colgantes) no ocurre. Además, una característica clave del protocolo es de 24 horas de exposición a la CHI99021 inhibidor de GSK3 (Chi), un potente activador de la señalización de Wnt / β-catenina, a raíz de la agregación.

El método aquí descrito proporciona una base para la comprensión de los procesos de auto-organización, la organización axial y Especificación de la capa de germen de la cultura, lo que permite hacer inferencias sobre el desarrollo axial in vivo 19,21. Por estas razones el método tiene el potencial de permitir el análisis mecanicista detallada de los procesos que pueden ser difíciles de estudiar en el embrión. Además, una aplicación potencial es en la generación de tejidos y órganos que no son fácilmente obtenibles en cultivo adherente debido a la falta de un nicho celular estructurada comoprecursores de la médula espinal 21 y motoras neuronas. Cultura global tridimensional ofrece una estructura física y el medio ambiente de señalización que pueden no ser alcanzables por medios convencionales, dando lugar a un nuevo enfoque para la derivación de los linajes embrionarios de una manera espacialmente organizado.

Protocolo

1. Condiciones de cultivo antes de agregación

  1. Mantener mESCs en medio ESLIF (véase la Tabla de Materiales y Equipos específicos para la formulación) en frascos de 2 de cultivo de tejidos tratados recubiertos de gelatina 25 cm en un incubador humidificado a 37 ° C y CO 2 mayo 21 a 25%.
  2. Crecer células durante al menos dos pasajes publicar descongelación antes de su uso en este protocolo; células en pasajes inferiores son generalmente más éxito en la generación de características reproducibles en toda réplicas experimentales, (es decir., no más de 15 pases en cultivo) por leve variación entre las diferentes líneas de células madre embrionarias es de esperar (ver Tabla 2 para las líneas celulares ensayadas ).
  3. Cultivan las células a un 40-60% de confluencia. No utilice células sobre-confluentes para la agregación.

2. Generación de agregados

  1. Pre-caliente PBS (+ Ca 2+, Mg + 2 +), ESLIF, N2B27 26,27 y tripsina-EDTA en un 37 ° C baño de agua.
  2. Aspirar el medio de cultivo del matraz de cultivo de tejido (paso 1.3). Enjuagar el matraz suavemente con 5 ml de PBS, dos veces. Aspirar el PBS y añadir 1 a 2 ml de pre-calentado tripsina-EDTA (0,25%) para disociar las células.
    1. Colocar el matraz en la incubadora durante <5 min o hasta que las células han totalmente desprendido de la superficie del matraz. Pipeta de arriba abajo con una pipeta de 1 ml para generar la suspensión de una sola célula para el conteo exacto y la formación de tamaño agregado uniforme.
  3. Neutralizar tripsina con 5-10 ml ESLIF; lavar la superficie de crecimiento para maximizar la recuperación celular y transferir a un tubo de centrífuga de 50 ml. Retire una alícuota de 1 ml del tubo de centrífuga y contar las células con un hemocitómetro.
  4. Determinar el volumen de suspensión requerida para dar 10 células / l (una placa de 96 pocillos toda requiere 5x10 4 células en una suspensión de 5 ml). Contar las células con precisión, tan grande deviationes del número de células indicado pueden afectar negativamente a la respuesta de los agregados a los estímulos.
  5. Añadir 5x10 4 células a 5 ml de PBS precalentado en un 50 ml tubo de centrífuga fresco y giran a ~ 170 xg durante 5 min.
  6. Aspirar con cuidado el PBS y añadir 5 ml de pre-calentado PBS suavemente; no molestar el pellet en la parte inferior del tubo. Centrifugar a ~ 170 xg durante 5 min.
  7. Aspirar con cuidado PBS por segunda vez. Retire la mayor cantidad de PBS como sea posible sin alterar el sedimento como PBS arrastre puede afectar negativamente a la agregación. Resuspender el precipitado en primer lugar en 1 ml N2B27 caliente con una pipeta P1000 para generar una suspensión celular homogénea, seguido por la adición adicional de N2B27 al volumen requerido (por ejemplo, añadir 4 ml para un 5x10 4 células / 5 ml de suspensión).
  8. Transferir la suspensión celular a un depósito estéril y una pipeta una gota de 40 l en el fondo de cada pocillo de un no-tejido-cultivo tratado, 'U'de fondo 96-wplaca ell utilizando una pipeta multicanal. Cubrir la placa de 96 pocillos con su correspondiente tapa y confirmar la presencia de células con un microscopio de sobremesa invertida (Figura 1B).
    Nota: Es esencial que estas placas se utilizan para limitar la posibilidad de que las células adherentes. No cubra la parte inferior de la placa de 96 pocillos con gelatina, fibronectina o cualquier otro revestimiento que promueve la adhesión celular.
  9. Se incuban las células durante 48 horas en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% de CO 2 para la agregación.

3. La aplicación de estímulos y Cambio Medio

  1. Tras el período de incubación de 48 horas, observar la aparición de los mESCs dentro de cada pocillo de la placa de 96 pocillos para confirmar la agregación éxito (Figura 1E). Nota: Los agregados aparecerán esférica en la naturaleza y aproximadamente de 150-200 micras de diámetro. Consulte la sección de solución de problemas si surgen problemas (Tabla 1).
  2. 0; Añadir 150 l medio secundario fresco (3 M Chi99021 (Chi) en N2B27 19; de stock preparada en 10 mM en DMSO) a cada pocillo usando una pipeta multicanal. Pipeta con la fuerza suficiente para desalojar cualquier agregados que puede haber empezado a adherirse a la parte inferior de los pocillos. Incubar agregados en medio secundario durante 24 horas en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% de CO 2 (Figura 1A).
    Nota: Los agregados alargados y polarizados reproducibles se generan utilizando este medio secundario. Otras composiciones medio secundario también se pueden utilizar dependiendo de las condiciones experimentales requeridas y los ejemplos se muestran en la Figura 3.
  3. Para cambios de medio posteriores, utilizar una pipeta multicanal celebrada en un ángulo (aproximadamente 30 °) para eliminar suavemente 150 l de la medio secundario desde el lado de cada pocillo. Entonces, pipeta 150 l frescas N2B27 en cada pocillo con la suficiente fuerza para desalojar cualquier agregado que pueden tener inicioed a que se adhieran a la parte inferior de los pocillos.
  4. Repita el punto 3. 3 cada 24 horas hasta que el tiempo de curso está completo (la longitud típica de un experimento cultura global es de 120 horas).
    NOTA: Asegúrese de agregados se mueven libremente siguientes cambios de medio para asegurar la reproducibilidad y consistencia en y entre cada placa de 96 pocillos. Medio debe cambiarse diariamente tras el período de globalización.

4. Preparación de Áridos de inmunotinción y Análisis por Microscopía Confocal

  1. La fijación y Anticuerpo primario incubación
    Nota: El protocolo descrito por AK Hadjantonakis 28 ha sido modificado para adaptarse a la inmunotinción de mESC agregados. Para los anticuerpos típicos utilizados en nuestros estudios y sus diluciones, consulte previamente publicado trabajos 19,21,24,25,29 y en la Tabla 3.
    1. Utilice una pipeta multicanal celebrada en un ángulo (aproximadamente 30 °) para eliminar suavemente 150 l medio de la o ladof cada pocillo de la placa de 96 pocillos. Lavar dos veces con la pipeta 150 l de PBS en cada pocillo. Deja un par de minutos entre cada lavado para permitir que los agregados se asienten.
    2. Establezca una pipeta P1000 para dispensar 200 l, coloque la punta de la pipeta correspondiente y corte de aproximadamente 3 mm del extremo de la punta con un par de tijeras estériles. Dibuja una parte de la PBS en cada pocillo de la placa de 96 pocillos un camino corto hacia la punta y expulsarlo a agitar el agregado.
    3. Utilice el mismo consejo para elaborar todo el volumen dentro del pozo incluyendo el agregado y la pipeta en un pequeño (30 mm de diámetro) de vidrio disección Drosophila también. Transferencia de todos los agregados de la placa de 96 pocillos que se someterán a regímenes idénticos de inmunotinción en la misma disección de vidrio también.
      Nota: Use una nueva punta de pipeta de corte cuando se transfieren los agregados de diferentes condiciones experimentales para evitar el arrastre de los agregados.
    4. Coloque el bien de cristal que contiene el aggregates en un microscopio de disección. Agitar bien el cristal para forzar los agregados hacia el centro y aspirado de PBS de un lado del pozo con una pipeta Pasteur de vidrio. Utilice el microscopio para asegurar que los agregados no se aspiran. Deja un pequeño volumen de PBS dentro del pozo de vidrio para cubrir los agregados para evitar que se sequen.
    5. Añadir 1 ml de formaldehído recién preparada (4%) disueltos en PBS y se incuba durante 2 horas a 4 ° C en un agitador orbital ajustado a una velocidad baja. Precaución: El paraformaldehído se sabe que es alergénica, cancerígenos y tóxicos. Use protección apropiada mientras manejo.
    6. Después de la fijación, aspirar la solución de formaldehído de la misma manera como se describe en la sección 4. 1. 4 y lavar los agregados con 1 ml de PBS tres veces, 10 minutos para cada lavado con, en un agitador orbital ajustado a una velocidad baja.
    7. Aspirar el PBS como se describe en la sección 4. 1. 4 y llevar a cabo otros tres, 10 min lavados con PBS que contenía 10% de suero bovino fetal y 0,2% Triton X-100 (PBSFT). Realice los 10 min lavados en un agitador orbital ajustado a una velocidad baja.
      Nota: el uso de suero bovino fetal (FBS) resultados en un tampón de lavado claro, lo que reduce el número de agregados que de otro modo se perderían durante el protocolo de si se utilizó leche. Es importante tener en cuenta que después de la fijación, los procedimientos inmunohistoquímicos pueden llevarse a cabo de varias maneras distintas de las que se detallan a continuación y deben ser determinados y optimizados por el investigador.
    8. Bloquee los agregados durante 1 hora a 4 ° C en PBSFT en una mecedora orbital ajustado a una velocidad baja. El protocolo puede ser una pausa en este punto, y los agregados bloqueado O / N, con agitación constante en una mecedora giratoria horizontal a 4 ° C.
    9. Aspirar el PBSFT como se describió previamente (ver sección 4. 1. 4) e incubar los agregados con 500 l de anticuerpo primario requerido diluido en PBSFT O / N a 4 ° C en un agitador orbital ajustado a baja velocidad. Cubrir con film de parafina para evitar la evaporación.
  2. La incubación de anticuerpo secundario
    1. Aspirar la solución de anticuerpo primario y se lava con 1 ml PBSFT (a 4 ° C) de la siguiente manera: dos veces por 5 min; tres veces durante 15 min; y cuatro a siete veces para 1 hr. Realizar cada paso de lavado a 4 ° C y en una mecedora orbital ajustado a baja velocidad. Nota: Chill medio de lavado antes de su uso. No realice los lavados en el hielo ya que esto puede causar que los agregados a fragmentarse.
    2. Aspirar el medio de lavado final e incubar los agregados con el anticuerpo secundario requerido en 500 l PBSFT O / N a 4 ° C en la oscuridad en un agitador giratorio horizontal. Añadir tinción nuclear tales como Hoechst si es necesario.
  3. Montaje e Imagen por microscopía confocal
    1. Lave los agregados como se describe en la Sección 4. 1. 4 con 4 ° C PBSFT. Después del lavado final, enjuague los agregados con 1 ml de PBS que contenía 0,2% de FBS y Triton X-100 (PBT) de la siguiente manera: dos veces por 5 min; tres veces durante 15 min. Realizar lavadosa temperatura ambiente en una mecedora orbital protegido de la luz.
    2. Aspirar el medio como se ha descrito anteriormente (sección 4. 1. 4) y se incuba durante 30 min en la oscuridad con una solución 1: 1 de glicerol: PBT (1 ml) seguido de una segunda incubación de 30 min con un 7: solución de 3 glicerol: PBT (1 ml).
      Nota: Mezclar el glicerol y soluciones PBT a 4 ° C usando un rotador.
    3. Aspirar el glicerol definitiva: solución PBT y reemplazar con 1 ml de medio 24 de montaje. El protocolo puede ser una pausa en este punto antes de montar (si pausa, sellar los pozos con película de parafina y almacenar los pozos de tinción a 4 ° C).
    4. Montar los agregados sobre portaobjetos de microscopio con la pipeta en 17 mu l gotitas con una punta de corte P20 (Figura 2). Dobla la cinta de doble cara sobre sí mismo cuatro veces para generar espaciadores y adjuntar a cada extremo de la diapositiva. Coloque el cubreobjetos superior (22 mm x 60 mm) en estos espaciadores (Figura 2).
      Nota: es esencial que una punta de corte esutilizado en esta etapa a fin de no dañar las muestras. Los espaciadores evitan que el cubreobjetos aplastamiento de los agregados.
    5. Una vez que se montan los agregados, imagen las muestras mediante microscopía confocal utilizando protocolos previamente descritos 19,21,24,25. Una vez colocado en el microscopio, deje la diapositiva inalteradas en el escenario durante unos minutos para permitir que los agregados se asienten en el medio de montaje.

Resultados

Aparición de células inmediatamente después de la siembra y después de Agregación

Inmediatamente después de la siembra, se puede observar la presencia de células individuales dentro de cada pocillo de la placa de 96 pocillos con un microscopio invertido estándar de cultivo de tejidos (Figura 1B). Dentro de 8 h de chapado, estas células se han comenzado a descender a la parte inferior de la bien debido a la gravedad y se han empezado a unirse en grupos discretos (Figura 1C). Después de 24 horas, las células de coalescencia habrán completado la agregación primaria, y se han compactado en bien definidos, agregados todavía irregulares donde las células individuales son indistintos entre sí (Figura 1D). Al final del segundo día (48 horas), los agregados deben buscar "limpia", después de haber tomado todas las células dentro del pozo (Figura 1E); la parte inferior del pozo puede tener algunas células que se han desprendido del agregado en esta etapa. Siempre queque los agregados se han agregado en N2B27, en este punto de tiempo, deben ser esférica, aproximadamente de 150-200 micras de diámetro y se mueve libremente dentro del pozo (es decir., no adherido a la parte inferior de los pocillos). Agregación en otros medios (es decir., ESLIF o N2B27 con factores específicos) tiene el potencial de alterar tanto la morfología agregado inicial y la respuesta a los estímulos posteriores (Turner et al., En preparación).

Representante morfológica Cambios

La adición de un pulso de 24 h de medio secundario que contiene Chi entre 48 y 72 hr (Figura 1A, 5A) genera bien definido agregados alargados que muestran expresión polarizada en marcadores específicos de las capas germinales 19,21. Inmediatamente después del pulso de Chi (72 hr), los agregados comenzarán a eliminar las células y empezar a mostrar su respuesta a estas señales hacia el final de este día (Figura 3A). Estas respuestasse manifiestan por los cambios en la expresión génica y la morfología, ambos de los cuales son dependientes sobre el tratamiento que los agregados han recibido después del periodo de agregación de 48 hr inicial en N2B27 (Figura 3B). Si sólo se requiere un análisis de punto final, el momento óptimo para la imagen de los agregados es de aproximadamente 96 a 120 horas. En este punto, los agregados se han desarrollado morfologías cristalinas y patrones de expresión génica (figura 3A), y su tamaño y masa son todavía lo suficientemente bajo como para que la expulsión de medio de P200 pipeta es suficiente para desalojar cualquier que pueden haber adjunto. El incumplimiento de impedir la adhesión del agregado al pozo afectará negativamente a la formación de agregados (Figura 5Biv). El patrón de morfologías y la expresión génica de los agregados puede ser alterado dependiendo del tratamiento. Los resultados representativos para regímenes sostenidos o pulsadas con cualquiera de los tratamientos individuales o combinaciones de factores se muestran para BMP4, Dorsomorphin H1 (BMP inhibidor del receptor), ActivinA, SB43 (activina / inhibidor de Nodal), bFGF o PD03 (inhibidor de MEK) (Figura 3B).

Imaging agregada y Análisis de Imagen Cuantitativa

Los agregados son susceptibles a las imágenes ya sea por microscopía de campo amplio (principalmente para time-lapse 19), o fija y immunostained de imagen confocal 19,21 (Figura 2). La descripción del protocolo y la imagen actual de arriba permite que la información cuantitativa que se pueden obtener a partir de estos agregados. Siguiendo confocal o de gran campo de captura de imagen, la longitud y la expresión del gen correspondiente a lo largo del diámetro o la columna vertebral del agregado (esférica o alargada, respectivamente; Figura 4A, B) se pueden medir. Estos análisis también son directamente aplicables a las imágenes de lapso de tiempo, donde se puede obtener información de la tasa de crecimiento, el tamaño y el alargamiento de los agregados en diferentes condiciones (Figura 4 ).

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Figura 1. Típico tiempo de curso y los primeros morfologías. (A) El curso de tiempo típico para experimentos de agregación. Las células se agregan durante 48 horas en N2B27 contiene una suspensión de células ES de ratón (10 células / l) en una placa de 96 pocillos (p1, p2). (B) Inmediatamente después de la siembra (t = ~ 5min), las células individuales pueden ser vistos en la suspensión y han comenzado a formar montones por 8h (C). (D) Después de 24 horas las células se han formado un solo agregado en cada pocillo que es de aproximadamente 100 micras de diámetro. (E) Después de la agregación de 48 hr, el agregado diámetro varía de 150 a 200 micras. En este punto, el medio de agregación (N2B27) se retira y se añade un medio secundario o bien para el resto del experimento (p1 en la parte A) o durante 24 horas antes de ser cambiado bACK al N2B27 (p2 en la parte A). La barra de escala representa 100 micras. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2. agregados de montaje en portaobjetos de microscopio. Una vez que los agregados se han fijado, inmunotinción y se coloca en medio de montaje, cada agregado se pipetea en un portaobjetos de microscopio como una gotita de 17 l (A, B, B '). Suficiente espacio se deja entre las gotas agregadas para evitar su fusión. Los espaciadores están hechas con cinta de doble cara y se colocan en cada esquina del portaobjetos de microscopio (A, A ', B). Es sobre estos que se coloca un cubreobjetos de vidrio. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3. El efecto de diferentes tratamientos sobre la morfología de las células ES agregados. Después de 2 días en N2B27, las células ES se han formado agregados. La adición de factores específicos, ya sea como un pulso de 1 día (A) o de manera continua (B) puede alterar el fenotipo de los agregados con respecto a la polaridad de la expresión génica, el potencial de alargamiento, o su forma general. Los ejemplos de esta figura son agregados formados desde cualquier sujetador :: GFP 30 (A) o Sox1 :: GFP 27 (B) células ES de ratón fotografiados después de 120 horas y tratados como se indica. Chi: CHIR 99021 31; SB43: SB 431542 32; DM: DorsomorphinH1 33,34; PD03:. PD0325901 Haga clic aquí para ver una versión más grande de les figura.

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Figura 4. Análisis cuantitativo de Áridos. Un total típica formada de Bra :: mESCs GFP 25,30 después de un pulso de 24 h de Chi y fotografiados a 120 horas. Imagen fusionada del campo luminoso y canal de GFP se muestra con línea segmentada que marca la 'columna vertebral' del agregado del punto A al B (A), a lo largo de la cual la fluorescencia y la longitud del agregado se pueden medir (B). La longitud (C) y 'redondez' (D) a partir de 24 agregados dentro de la misma experimento se muestran. Descriptores de forma tal como la redondez (D), la circularidad, perímetro y el área se pueden medir mediante el Análisis de Imágenes Cookbook plugin desde el software de análisis de imágenes FIJI 35. La media indicada por la línea horizontal en cada punto del tiempo;barras de error indican la desviación estándar; barra de escala en (A) indica 200 micras. Como hay diferencias sutiles entre líneas celulares reportero, se espera que después de un pulso de Chi, la longitud máxima media y la redondez mínima promedio de los agregados variarán. Entre las diferentes líneas celulares, nos encontramos con que la longitud máxima promedio puede estar dentro del rango de ~ 400 a 800 micras y la redondez mínima promedio entre 0,4 y 0,6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5. Ejemplos de fallos en la formación de agregados. La capacidad de generar agregados reproducibles (A) depende de factores críticos, tales como (Bi) medio secundario fresco y bien mezclado, (Bii, BIII) la exactitud en el conteo de la inicial número de células y (BIV), lo que garantiza los agregados no forman colonias adherentes, es decir., 'accidente' en la superficie del pozo. Se muestran ejemplos típicos de los errores en la formación de agregados para cada una de las condiciones mencionadas (B). Escala-bar como se indica; véase la tabla de solución de problemas para obtener más información (Tabla 1). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Tabla 1. Guía para la solución de problemas. Los errores típicos asociados con el protocolo de agregación se dan con sugerencias en cuanto a su resolución.

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Tabla 2. Tabla de líneas celulares ensayadas para la formación de aggRegates. Un número de líneas celulares 19,22,27,30,36-40 se han caracterizado por la formación de agregados y, aunque se espera que las diferencias sutiles entre líneas celulares y han sido observados, todas las líneas anteriores muestran dinámicas similares en términos de la elongación y la morfología. En términos de la expresión génica, el patrón de expresión es específica para el gen expresado, pero dentro de cada línea celular, el patrón de expresión es generalmente constante durante un número de pasajes. Para mantener la coherencia, generamos agregados de células que no han superado los 15 pasajes en cultivo.

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Tabla 3. Lista de anticuerpos representativos utilizados en estos estudios. Una selección de los anticuerpos y los factores de dilución utilizados para la inmunotinción agregado.

Discusión

La técnica descrita en este manuscrito de manera eficiente y reproducible genera agregados de células madre embrionarias de ratón (mESCs) que display organizada ruptura de la simetría y el alargamiento 19, combinando tanto la cultura gota colgante descrito por Marikawa et al. 14 y EB formación. Estos agregados pasan a desarrollar alargamientos axiales, complementando los métodos existentes para la generación de órganos anteriores de células ES tales como tazas óptica 11 y la corteza cerebral 13, y contienen células con identidades de las capas que procesos similares a los durante la gastrulación pantalla de tres germinales tales como rápido 19,21 movimiento celular.

Es interesante especular sobre la naturaleza del evento de simetría de ruptura, ya que se produce en ausencia de tejidos externos de modelado y la asimetría cigóticos Tacos de 19. La formación espontánea de un eje rudimentaria podría surgir de pre-existente heterogeneities en el cultivo de partida de células, que forman la base para el desarrollo de asimetría. De hecho, las poblaciones de células cultivadas en condiciones ESLIF muestran una mezcla de auto-renovación y diferenciación de las células, las proporciones relativas de los cuales pueden variar de un agregado a otro. Por otra parte, los trabajos preliminares en nuestro laboratorio sugiere que los agregados de una población totalmente pluripotentes de células muestran retraso en el desarrollo y los defectos en el patrón, lo que sugiere un papel para la heterogeneidad en la formación de patrones organizada (DA Turner y A. Martínez Arias, en preparación). También vale la pena considerar que un mecanismo de reacción-difusión puede generar el modelo, con la difusión de un inhibidor de distancia de la superficie del agregado. Warmflash et al., 41 sugieren que un mecanismo de ese tipo podría ser responsable del desarrollo de la asimetría radial en la cultura adherente, por lo que es un posible candidato para modelar en tres dimensiones.

Durante el initial periodo de agregación de 48 horas, las células llegar a un estado similar al que dentro del epiblasto postimplantación, en las que son competentes para responder a las señales del medio de secundaria 19,21,24. Típicamente, el protocolo descrito aquí proporciona células con un pulso de medio secundario que contiene factores (tales como los agonistas Wnt / β-catenina) que proporcionan las señales suficientes para la elongación. Métodos de cultivo anteriores descritos por Lancaster et al. (Utilizando los CES humanos 13) y Eiraku et (con mESCs 11) al. Usa un corto período de agregación en baja adhesión placas de 96 pocillos antes de células agregadas se transfirieron a gotas de Matrigel para situ va cultura. Aunque el tiempo entre la agregación y la inserción Matrigel fue diferente entre los estudios, en ambos casos, se usaron grandes cantidades de células para la formación de agregados (aproximadamente 3,000-4,500 células). Por el contrario, el protocolo descrito aquí 19 utiliza un número mucho menor de células (aproximadamente 400 célulaspor agregado) que se ha determinado que es absolutamente esencial para el proceso de elongación, ruptura de la simetría y la polarización que se observa 19. Además, estas estructuras alargadas son capaces de ser generada en un periodo de tiempo mucho más corto sin incorporar en matrices artificiales: compara la generación de regiones cerebrales definidas por Lancaster et al (> 20-30 días) 13 y la óptica tazas de Eiraku. et al. (~ 11 días) 11 con los 5 días requeridos para la generación de estructuras alargadas polarizadas.

Una de las limitaciones con el método de cultivo descrito aquí, sin embargo, es que sólo pueden ser cultivadas para aproximadamente 5-6 días Post chapado hasta que su tamaño los hace competente en virtud de la gravedad para hundirse hasta el fondo de los pocillos y forzar una adhesión incluso en non recubierta de plástico-ware. Otros experimentos utilizando matrices artificiales tales como los mencionados anteriormente, pueden nos permitirá aumentar el período dela observación y la experimentación, y el trabajo está en curso para determinar los efectos de restringir los agregados de tal manera. Otra limitación de esta técnica es que con el fin de cambiar el medio sin la eliminación de los agregados, un pequeño volumen de medio debe quedar en la parte inferior del pozo. Las consecuencias para los enfoques de genética químicos son la necesidad de considerar esta dilución y los efectos residuales de los medios de comunicación anterior: en el día de la 3 M Chi pulso, 2,37 M solución se entrega realmente, y cambios de medio posteriores da lugar a una prórroga de 0.499 M (72-96 h) y 0.105 m (96-120 h) entre los puntos de tiempo. El trabajo actual no ha corregido para la dilución y se supone que los cambios medianas diarias minimizarán los efectos residuales.

Hay una serie de pasos críticos en el protocolo para asegurar la reproducibilidad tanto intra e inter-experimental. En primer lugar, la cultura a partir de mESCs debe estar bien mantenido y no sobre confluent y medio siempre debe ser bueno, es decir la calidad., fresco y bien mezclado (Figura 5 A, B). Condiciones de cultivo pobres afectan negativamente a la agregación (Figura 5BI). Conteo preciso de las células para obtener una suspensión de células ~ 400 células / 40 l es esencial, ya que los agregados más grandes no pueden auto-organizarse y son más propensos a formar agregados dobles dentro de cada pocillo (Figura 5Bii) mientras que los agregados más pequeños son incapaces de llegar a la correcta densidad de donde son capaces de responder al estímulo (Figura 5Biii). Un paso de optimización clave fue la inclusión de un segundo lavado con PBS que elimina el suero contaminante de la suspensión celular (Paso 2.6); esto mejoró la frecuencia de agregación y aceleró el desarrollo de los agregados en aproximadamente 24 hr. Siguiente, asegurando cambios de medio se aplican con fuerza suficiente para desalojar cualquier agregados que tienen el potencial para adherirse a la superficie del pozo; de no hacerlo, results en 'estrellarse' los agregados (Figura 5Biv). Además, y como se ha mencionado anteriormente (y por debajo), es esencial para asegurar que los agregados se mantienen en cultivo en suspensión y se impide que se adhiera a cualquier superficie. Una vez que los agregados se han adherido, el patrón de expresión génica y su potencial de elongación se interrumpen.

Como esta técnica es relativamente sencillo, y así de la competencia de los individuos con buenas técnicas de cultivo de tejidos, la mayoría de los problemas asociados con la agregación se pueden resolver con relativa rapidez si se siguen estos pasos críticos; una mesa llena de solución de problemas está disponible (Tabla 1). Una vez dominado, esta técnica puede ser utilizada para estudiar el desarrollo axial, eventos ruptura de la simetría y célula-decisión. Más específicamente, estos agregados tienen el potencial de generar grupos de células que han sido hasta ahora no disponible en cultivo, tales como la médula espinal y motoneuronas r.

Nota ético: Debe tenerse en cuenta con la debida precaución de que la traducción de este protocolo a ES humanos o cultivo de células iPS podría traer el experimentador cerca de la base jurídica del límite de catorce días en la investigación con embriones humanos, a saber, la generación de una línea primitiva, como se detalla en la Ley de Fertilización Humana y Embriología de 2008 (Reino Unido) 42. Dado que la ley se aplica a todos los embriones humanos vivos, independientemente de su modo de creación, la cultura de gastruloids humanos más allá de lo primitivo de rayas como etapa sería más allá del alcance de la investigación a licencia.

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo está financiado por un Premio Investigador ERC Advanced para AMA (DAT, TB), con una contribución de una subvención para el proyecto de la Wellcome Trust para AMA, una beca EPSRC para PB-J y Erasmus, Stichting dr. De Hendrik Muller Vaderlandsch Fonds y Fundatie van de Vrijvrouwe van Renswoude te 's-Gravenhage a SCvdB. Queremos dar las gracias a J. Briscoe, S. Muñoz-Descalzo, C. Schroeter, y T. Rodríguez, para el debate y las críticas constructivas, Joaquín de Navascués para el protocolo de medio de montaje y ambos AK Hadjantonakis y C. Budjan para compartir protocolos de su laboratorio relativa a la tinción de embriones todo el montaje. Una versión anterior de este artículo se hizo previamente disponible en el servidor de impresión final bioRxiv 29.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2-MercaptoethanolGibco/Invitrogen31350-010
25 cm2 MatrazGrenier Bio-one690 175
Centrífuga de sobremesaMSEMSB020. CX1.5
BES Solución salina tamponada (BBS)Sigma-AldrichB2891BBS+CaCl2 elaborada disolviendo 50 mM de sal sódica BES, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4 en agua destilada con 1 mM de CaCl2 ajustado a pH 6.96 con 1 M de HCl 
Tubos de centrífuga (15 o 50 ml)Greiner Bio-One 118271 o 227261
CHIR 99021 (Chi)CSCRComprado a través del Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute. Concentración de existencias: 10 mM en
pocillo de disección DMSO (30 mm de diámetro interno)Fisher Scientific12678586
ESLIF500 ml GMEM, 5 ml de piruvato de sodio, 5 ml de aminoácidos no esenciales, 5 ml de Glutamax, 1 ml de beta-mercaptoetanol, 50 ml de FBS y 550 µ l LIF (1.000 unidades).
Suero fetal bovino (FBS)BioseraFB-1090/500
GelatinaSigma-AldrichG1890-100GDisuelto en agua destilada en una solución al 1 % (p/v), esterilizado en autoclave y diluido al 0,1 % en PBS (ver más abajo) para uso individual.
esencial mínimo (GMEM) de GlasgowGibco11710-035
GlutaMAXGibco35050-038
GlicerolSigma-AldrichG5516
Hemocitómetro de NeubauerHawksleyAS1000
Factor inhibidor de la leucemia (LIF), CSCRrecombinanteProducido internamente por el Wellcome Trust-Medical Research Council, Cambridge Stem Cell Institute.
n-propil-galatoSigma-Aldrich02370
N2B27/NDiff 227Stemcells, Inc.SCS-SF-NB-02http://www.stemcellsinc.com/_literature_40366/Technical_Specifications_Ndiff
Aminoácidos no esencialesGibco/Invitrogen11140-035
Paraformaldehído en polvoSigma-AldrichP6148Se disuelve en agua para formar una solución madre de formaldehído al 8%. Diluido con BBS+CaCl2 para dar una solución de trabajo al 4%
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Sigma-AldrichD8662con calcio y magnesio
Piruvato de sodioInvitrogen11360-039
Depósito estérilSTARLABE2310-1010
Placa estéril, sin tratamiento para cultivo de tejidos, con fondo en U Grenier Bio-one650185
Triton X-100Sigma-AldrichX100
Trypsin-EDTAGibco25300-054
de cultivo celular Medio

Referencias

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