La comparación de la afinidad de unión a proteínas GTPasa-utilizando ensayos de competición

Summary

Este protocolo compara las afinidades relativas de los socios de unión para las GTPasas de la familia Rho, incluyendo Rac1. In vivo, las proteínas de unión a Rac1 compiten por una única interfaz de unión, cuya conformación está dictada por un nucleótido unido. El nucleótido es importante y difícil de controlar experimentalmente, debido a la alta tasa de hidrólisis.

Abstract

En este protocolo demostramos un método para comparar la competencia entre las proteínas de unión a GTPasa. Este enfoque es importante para determinar las capacidades de unión de las GTPasas por dos razones: el hecho de que todas las interacciones involucren la misma cara de las GTPasas significa que los eventos de unión deben considerarse en el contexto de los competidores, y el hecho de que el nucleótido unido también debe controlarse significa que los enfoques convencionales, como la inmunoprecipitación, no son adecuados para la bioquímica de GTPasa. El ensayo se basa en el uso de proteínas purificadas. El Rac1 purificado inmovilizado en perlas se utiliza como proteína de cebo, y puede cargarse con GDP, una versión no hidrolizable de GTP o dejarla libre de nucleótidos, de modo que se pueda controlar la etapa de señalización a investigar. Las proteínas de unión a investigar se purifican a partir de células de mamíferos, para permitir un correcto plegamiento, mediante un marcador GFP. El uso de la misma etiqueta en ambas proteínas es importante porque no solo permite una purificación y elución rápidas, sino que también permite la detección de ambos competidores con el mismo anticuerpo durante la elución. Esto significa que las cantidades relativas de las dos proteínas unidas se pueden determinar con precisión.

Introduction

El citoesqueleto de actina que determina la forma, la polaridad y las propiedades migratorias de las células de mamíferos está regulado por la familia Rho de pequeñas GTPasas. Las GTPasas de la familia Rho incluyen RhoA que estimula la contracción del citoesqueleto, Rac1 que estimula la ramificación de actina y la protrusión de la membrana, y Cdc42 que tiene efectos similares sobre la polimerización de actina a Rac1 y causa la formación de filopodios ^1,2. La actividad de señalización de la GTPasa está determinada por la unión de un nucleótido, que controla la contracción y relajación de los bucles de interruptor I y interruptor II que median las interacciones proteína-proteína con reguladores y efectores. Las GTPasas unidas a guanosina 5'-trifosfato (GTP) activan efectores posteriores, mientras que la forma unida a guanosina 5'-difosfato (GDP) está inactiva. En la célula, los ciclos de hidrólisis de GTP e intercambio de nucleótidos permiten una rápida renovación de las señales de GTPasa que son necesarias para la dinámica del citoesqueleto. El recambio de nucleótidos está regulado por tres mecanismos. Los factores de intercambio de nucleótidos de guanina (GEFs) estabilizan la GTPasa libre de nucleótidos, catalizando el intercambio de GDP por GTP y, por lo tanto, estimulando la actividad de señalización de GTPasa ^3,4. Las proteínas activadoras de GTPasa (GAPasa) catalizan la hidrólisis de GTP a GDP, inhibiendo así la actividad de señalización de GTPasa ⁵. Las moléculas secuestrantes, como el regulador de la condensación de la cromatina 2 (RCC2) y los inhibidores de la disociación de nucleótidos de guanina (GDI), oscurecen los bucles de conmutación y, en el caso de los GDI, eliminan la GTPasa de la membrana por interacción con la cola de prenilo ^6,7. Cada una de las tres clases de moléculas reguladoras interactúa con los bucles de conmutación, al igual que los efectores posteriores y algunos reguladores de tráfico como la coronina-1C ⁷. El propósito de este protocolo es medir la competencia por el sitio de unión del interruptor I/II entre los reguladores putativos y las moléculas de señalización aguas abajo. Cabe señalar que los ensayos de competencia prueban la unión a un sitio de unión compartido, por lo que este protocolo no es adecuado para probar interacciones con otros sitios, como la unión de GDI a la cola de prenyl.

La sutileza de las diferencias de conformación entre las formas activas e inactivas, combinada con la naturaleza lábil del nucleótido unido, ha dificultado el estudio de los eventos de unión a GTPasa. El papel del nucleótido unido significa que los ensayos de unión convencionales, como la inmunoprecipitación o la resonancia de plasmones de superficie, no son adecuados para la investigación, ya que el nucleótido no se puede controlar. Este obstáculo se ve agravado por la superposición de los sitios de unión de los GEF, los GAPs, los efectores, las moléculas secuestrantes y las moléculas de tráfico, lo que hace que los datos de unión de una sola interacción sean difíciles de interpretar en el contexto de la competencia que se producirá en la célula. La inmunoprecipitación, en particular, se ve comprometida por la competencia entre socios de unión, ya que bajo ciertas condiciones celulares, un socio de unión podría ser identificado a expensas de todos los demás, mientras que bajo otras condiciones, otro socio podría dominar. La naturaleza dinámica de la señalización de GTPasa es esencial para la función de GTPasa y debe tenerse en cuenta al analizar las relaciones entre las interacciones de unión de diferentes reguladores. De hecho, recientemente describimos una vía que dependía en gran medida de la consolidación competitiva. Identificamos la coronina-1C como una molécula de tráfico que se une a los bucles de conmutación de GDP-Rac1 ⁷. En las zonas de baja actividad del FMAM, predominaría el tráfico, eliminando el Rac1 de esas regiones. Sin embargo, cuando Rac1 se administra a regiones de la célula donde la actividad del GEF es alta, el GEF superaría a la coronina-1C, activando así a Rac1 y evitando la eliminación de Rac1 mediada por coronina-1C de esa área. El modelo va más allá, porque la acción de los intercambios del FMAM consolidó el PIB por el GTP, desplazando aún más el equilibrio de la coronina-1C. En consecuencia, la actividad de Rac1 podría explicarse enteramente en términos de competencia y afinidad relativa.

En este protocolo, describimos un método para comparar las afinidades relativas de diferentes socios de unión para GTPasas pequeñas, utilizando Rac1 como ejemplo. Mediante el uso de un enfoque de proteína purificada, es posible reconstruir una cadena de eventos de señalización mediante la comparación por pares, en un experimento en el que el nucleótido unido se puede controlar de cerca.

Protocol

1. Purificación de la GTPasa GST-etiquetados

1. Cultura una E. cepa de E. coli tales como BL21 transformadas con pGEX-Rac1 O / N a 37 ° C, agitando a 220 rpm, en 500 ml de medio de autoinducción (25 mM Na ₂ HPO _4, 25 mM KH ₂ PO _4, 50 mM NH ₄ Cl, 5 mM Na ₂ SO _4, 2 mM MgSO _4, 2 mM CaCl _2, 0,5% de glicerol, 0,05% de glucosa, 0,2% de lactosa, 5 g de triptona, 2,5 g extracto de levadura, 100 mg / ml de ampicilina).
2. Cosecha bacterias por centrifugación durante 10 min a 10.000 xg, 4 ° C.
3. Resuspender sedimento bacteriano en 20 ml de reactivo de extracción de proteínas, inhibidor de la proteasa 1x y se incuba durante 20 min a TA con inversión.
4. Aclarar el lisado por centrifugación a 40.000 xg durante 30 min.
5. Añadir perlas magnéticas 2 ml de glutatión, se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS: 10 mM Na ₂ HPO _4, 1,8 mM KH ₂ PO _4, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM).
6. Incubar durante 2 horas, mezclando por inversión a 4 ° C.
7. Lavar perlas de proteína cargada por cuatro veces con 10 ml de PBS, usando un clasificador de partículas magnéticas para precipitar las perlas en cada paso.
8. Resuspender perlas en 2 ml de PBS y tienda de proteína cargada-a -80 ° C en 100 ml de alícuotas hasta que se necesite.

2. Expresión de proteínas de unión a GTPasa-

1. El día antes del experimento, los plásmidos que codifican transfectar proteína fluorescente verde (GFP)-etiquetados versiones de cada proteína de unión GTPasa en una separada de 75 cm ² frasco de HEK293T como sigue. Para la validación de la carga de nucleótidos, marcado con GFP transfectar TrioD1 en una tercera de 75 cm ² frasco de HEK293T.
   1. Diluir polyethylamine a 1 mg / ml en 100 l estéril NaCl 150 mM.
   2. Añadir 27 l polyethylamine diluido a 223 l de suero reducido de medios de comunicación.
   3. Añadir 12 g de ADN plasmídico a 250 l de suero reducido de medios de comunicación.
   4. Incubar cada tubo durante 2 minutos a RT.
   5. Combinar el polyethylamine y el ADN se mezcla en un solo tubo y agitar durante 2 min.
   6. Incubar durante 15 a 20 minutos a temperatura ambiente.
   7. Reemplazar los medios de crecimiento (medio Eagle modificado por Dulbecco, 10% de suero bovino fetal, 2 mM L-glutamina, sin antibióticos) en 90% confluentes HEK293T con 5 ml de medio de crecimiento fresco.
   8. Añadir la mezcla de polyethylamine / ADN combinado al matraz y se incuba O / N a 37 ° C, 5% de CO _2.

3. Purificación de proteínas de unión a GTPasa-

1. Enjuague frascos de células transfectadas en PBS y drene matraz durante 5 minutos, aspirar líquido libre.
2. Raspe células en 500 l de tampón de lisis (50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 1% Nonidet P-40, 1x inhibidor de la proteasa) en tubo de microcentrífuga.
3. Lisar células mediante la mezcla por inversión a 4 ° C durante 30 min.
4. Durante la lisis, lavar dos lotes de 40 mu l perlas de GFP-TRAP tres veces con tampón de lisis fresco, perlas sedimentan en 2700 xg durante 2 min entre lavados.
5. Aclarar los lisados ​​por centrifugación a 21.000 xg durante 10 min.
6. Transferencia aclaró lisado de cada una de las proteínas de la competencia para separar las perlas lavadas GFP-trampa y permiten proteínas GFP-fusión que se unen durante 2 horas, mezclando por inversión a 4 ° C. Mantenga lisado de células GFP-TrioD1 en hielo.
7. Lavar perlas de GFP-TRAP cargados dos veces en 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), NaCl 50 mM, 0,7% (w / v) de Nonidet P-40 y dos veces en 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), mM MgCl 20 ₂ , sedimentación cuentas a 2700 xg durante 2 minutos entre lavados.
8. Eluir proteínas de fusión GFP-mediante la adición de 40 l 0,2 M glicina (pH 2,5) y pipeteando arriba y abajo durante 30 segundos. Cuentas inmediatamente los sedimentos a 21.000 xg durante 60 s y traslade el líquido a un nuevo tubo de microcentrífuga que contiene 4 l 1 M Tris-HCl (pH 10,4). Haga esto rápidamente para limitar el daño a la proteína purificada.
9. Analizar 1 l de cada proteína purificada por Western blot y la sonda con un anticuerpo anti-GFP para establecer rendimiento relativo usando un blott cuantitativasistema ing según el protocolo del fabricante. Alternativamente, determinar las concentraciones de proteínas por ácido (BCA) de ensayo bicinconínico pero esto introduce errores si las proteínas no reaccionan con el ensayo de una manera idéntica o hay proteínas contaminantes.
10. Igualar la concentración de proteínas molar mediante la adición de 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl _2.

4. nucleótidos carga de GTPasa

1. Descongelar una alícuota de perlas magnéticas GST-Rac1, preparado en el paso 1.
2. Tomar 90 l de perlas de GST-Rac1 y lavar tres veces con 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), NaCl 25 mM, DTT 0,1 mM, EDTA 4 mM, usando un clasificador de partículas magnéticas para precipitar las perlas en cada paso.
3. Tampón Aspirar a partir de perlas y añadir 100 l 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), NaCl 25 mM, DTT 0,1 mM, EDTA 4 mM.
4. De acuerdo a si el PIB, GTP o ninguna carga de nucleótidos se requiere para el experimento de competición, añadir 12 l PIB 100 mM, 12 mM l gu 10anosine 5 '- [γ-tio] trifosfato (GTP? S) o no nucleótidos a 60 mu l perlas de GST-Rac1.
5. Para los controles de nucleótidos de carga, dividir las perlas restantes en tres alícuotas de 10-mu l y añadir 2 l PIB mM 100, 2 l 10 mM GTP? S o ninguna de nucleótidos a cada tubo.
6. Incubar las mezclas de perlas durante 30 minutos a 30 ° C con agitación.
7. Estabilizar Rac1 de nucleótidos unida por la adición de 1 M _MgCl 2: 3 l a la mezcla experimental (paso 4,4), 0,5 mu l a cada una de las mezclas de control (paso 4.5).

5. Competencia vinculante.

1. Configure 6 tubos de microcentrífuga, conteniendo cada uno:
   200 l 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl ₂
   10 l experimentales cuentas Rac1 nucleótidos cargadas (desde el paso 4.7)
   Proteína 5 l Rac1 vinculante A (proteína de unión constante)
2. A cada tubo, añadir unión Rac1-0, 1, 2,5, 5, 10 o 20 l de proteína B (proteína de unión variable). Estos volúmenes asumen unaproximadamente pueden necesitar ser ajustado concentraciones madre iguales de las proteínas de unión constantes y variables y.
   1. Ajuste el volumen de proteínas de unión A y B si hay grandes diferencias en las afinidades de unión de las dos proteínas y esto debe determinarse empíricamente a través de las repeticiones experimentales. Completar el volumen total de la mezcla de unión a 235 l mediante la adición de 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl _2.
3. Establecer un tubo de microcentrífuga que contiene:
   200 l 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl ₂
   10 l experimentales cuentas Rac1 nucleótidos cargadas (desde el paso 4.7)
   Proteína 10 l Rac1 vinculante A (proteína de unión constante)
4. Configure el PIB, GTPyS y no hay tubos de control de nucleótidos:
   200 l 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl ₂
   10 cuentas de Rac1 de control mu l cargados en el paso 4.5 con el PIB, GTPyS o ninguna de nucleótidos y se estabilizaron en el paso 4.7.
   180 l HLisado EK293T GFP-TrioD1, preparado como en el paso 3.6
   4 l 1 M de MgCl ₂
5. Incubar la mezcla durante 2 horas, mezclando por inversión a 4 ° C.
6. Lavar las perlas tres veces con 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de MgCl _2.
7. Eluir con destino proteínas en 20 l tampón de muestra reductor (50 mM Tris-HCl (pH 7), 5% SDS, 20% de glicerol, 0,02 mg / ml de azul de bromofenol, 5% β-mercaptoetanol).

6. Análisis de la competencia

1. Resolver 10 l de la proteína unida (paso 5.6) por electroforesis en gel de poliacrilamida sodio dodecil sulfato (SDS-PAGE) y Western blot.
2. Incubar la membrana a 4 ° CO / N en anticuerpo anti-GFP diluyó 1/1000 en tampón de bloqueo a 1x diluyó en PBS, 0,1% de Tween-20 para detectar tanto de las proteínas de unión a GTPasa-etiquetados.
3. Se lava la membrana tres veces durante 10 min con PBS, 0,1% de Tween-20.
4. Incubar la membrana durante 30 min a TA en DyLight 800 sec-conjugado anti-conejoanticuerpo secundaria, se diluyó 1 / 10.000 en tampón de bloqueo a 1x diluyó en PBS, 0,1% de Tween-20.
5. Se lava la membrana tres veces durante 10 min con PBS, 0,1% de Tween-20.
6. Analiza la membrana usando un sistema de imagen de infrarrojos, utilizando el software para medir la intensidad de la banda de acuerdo con el protocolo del fabricante.
7. Trazar la intensidad de la banda de cada proteína en función del volumen del competidor variable (proteína B).
8. Divida el volumen de competidor variable al punto en el que las líneas se cruzan por el volumen de competidor constante (Proteína A, 5 l) para determinar la relación de competidor a la cual se alcanza el equilibrio.
9. Para la validación de la condición de nucleótidos de carga, las membranas de la sonda de p21-quinasa activada 1 (PAK1) (un efector) y GFP-TrioD1 (un FMAM), como se describe en los pasos 6.1-6.6.

Results

Este protocolo está diseñado para calcular las afinidades relativas de los socios de unión para Rac1, sin la necesidad de conocer la concentración exacta de los competidores (Figura 1). Determinación de la concentración de proteína introduce errores y cuando se considera la competencia entre las moléculas en una vía de señalización no es necesario. Sin embargo, es importante saber que los dos competidores tienen la misma concentración molar en las soluciones madre para permitir relaciones simples para ser calculada cuando la adición de diferentes volúmenes para el ensayo. 40 l de perlas de GFP-TRAP tienen una capacidad de unión de ~ 300 pmol por lo que un confluente 75 ^cm 2 frascos de altamente células que expresan saturará los granos, con el resultado de que las preparaciones de las dos proteínas de unión diferentes serán similares antes del ajuste (Figura 2A). Si una de las proteínas expresa pobremente, este problema se puede superar mediante la purificación de que la proteína de más de un matraz de células.

8 (Figura 2B). GEFs unirse preferentemente al nucleótido libre de GTPasa para estabilizar el estado de transición. Como GEFs son de baja abundancia, por lo general inactivo y con frecuencia blot mal, es mejor que sobreexpresan un FMAM o fragmento del FMAM a prueba GTPasa nucleótidos libres. Con frecuencia usamos la primera homología Dbl de Trio, expresado como una fusión GFP (GFP-TrioD1 ⁹⁾ (Figura 2B) pero cualquier FMAM iba a funcionar. Las proteínas que se unen a la GTPasa PIB cargadas son más raros. Recientemente hemos informado de rcc2 como una de esas proteínas ^7, o el PIB de carga puede ser validado simplemente como binding a ni GEF ni efector.

La salida del experimento será una transferencia Western que representa las dos parejas de unión GFP-etiquetados unidos a la GTPasa. Mediante el uso de un único anticuerpo para detectar ambas proteínas, las concentraciones a las que cantidades similares de ambos competidores se unen pueden ser determinados y por lo tanto las afinidades relativas reales. En este ejemplo, la competencia entre el dominio de la hélice de la proteína Rac1 la trata, coronin-1C (Rac1-proteína de unión a A), y la proteína Rac1-secuestro, rcc2 (Rac1-proteína de unión B), se demuestra (Figura 3A). Mediante el uso de un volumen constante de la hélice coronin-1C (5 l), y la adición de volúmenes crecientes de rcc2, podemos ver de la GFP blot que el equilibrio se alcanza a 1,25-2,5 l de rcc2 (asterisco), lo que demuestra que tiene un fuerte rcc2 afinidad por Rac1 que coronin-1C. Mediante la medición de la intensidad de las bandas utilizando transferencia Western cuantitativa, y el trazado de los valores medios para cada competitor, el punto de equilibrio se puede calcular con precisión mediante la identificación de los volúmenes en el que las curvas se cruzan (Figura 3B).

Uno de los posibles obstáculos para un ensayo de competición éxito es si las parejas de unión se unen entre sí, así como la unión a Rac1. En la Figura 3A + B se demuestra la competencia entre rcc2 y el dominio de la hélice de coronin-1C, en lugar de larga duración coronin-1C. La razón para usar el coronin truncada es que coronin-1C también se une rcc2 a través del dominio de la cola. Cuando de larga duración coronin-1C se valora contra rcc2, se detecta la unión de ambas proteínas, debido a la formación ternario complejo, en lugar de la competencia (Figura 3C). Si la competencia se está produciendo, la unión de una proteína aumentará, mientras que la otra disminuye, y total unida GFP-fusión se mantendrá constante. En los casos en que se forma un complejo ternario es necesario truncar una de la proteína de unión a GTPasa de modo que la competITORS ya no interactúan.

Figura 1. Flujo de trabajo. Representación esquemática del flujo de trabajo para determinar la afinidad de unión a proteínas GTPasa-utilizando ensayos de competición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Validación de proteínas purificadas. (A) purificada GFP-etiquetados Rac1 proteínas analizadas por Western blot de unión, sondando con anti-GFP para determinar el rendimiento relativo de las dos proteínas. Este tipo de ecualización durante el experimento permite la concentración de las dos proteínas que se puede modificar para que coincidan en el experimento de unión. (B) GDP, GTPyS y ningún nucleótido-cargado GST-Rac1 se incubó con lisado de HEK293T que expresan GFP-TrioD1 y proteínas detectadas por el trazado de PAK1 endógena o sobreexpresado GFP-TrioD1 obligados. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Western blot de proteína en relación vinculante. Salidas Ejemplo de ensayos de unión con la competencia. Cargó-PIB (A) Rac1 se mezcló con 5 l GFP-coronin-1C dominio hélice y el aumento de los volúmenes de las buenas prácticas agrarias-rcc2 se valora en. Por Western Blot proteínas unidas para GFP, problemas con la detección diferencial de las dos proteínas se evitan y la señal de GFP informes de la relación molar entre las dos proteínas de fusión. Los asteriscos indican las relaciones de competencia en eithelado r del punto de equilibrio. (B) Banda intensidades de proteínas de fusión GFP encuadernados de tres experimentos independientes se midieron mediante transferencia Western cuantitativa, usando anticuerpos y promedios secundarios fluoróforo conjugado conspiraron para calcular la cantidad de rcc2 necesario para alcanzar el equilibrio. (C ) Ejemplo de salida de un experimento donde las proteínas de unión a Rac1 se unen entre sí y forman un complejo ternario, en lugar de competir. PIB-cargado Rac1 se mezcló con 5 l GFP-rcc2 y volúmenes crecientes de-GFP coronin-1C de larga duración se titularon. El aumento de la cota GFP-coronin-1C sin pérdida de cota GFP-rcc2 indica la formación del complejo ternario. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Este protocolo describe un método para comparar las afinidades relativas de pares de pequeñas proteínas de unión a GTPasa. Los pasos clave son la preparación de proteínas purificadas de unión a GTPasa y la carga de nucleótidos de la GTPasa. El uso de proteínas de unión a GTPasa con la misma etiqueta GFP permite determinar con precisión las concentraciones a las que se unen cantidades similares de cada competidor. El uso de GTPasa cargada de nucleótidos recombinantes permite interrogar las propiedades de unión de la GTPasa en condiciones de actividad específicas. Este paso también es el más sensible, ya que los nucleótidos se hidrolizarán y se desprenderán de la GTPasa si las condiciones de magnesio no se mantienen con precisión.

En la célula, la gran cantidad de proteínas de unión a GTPasa combinadas con el rápido recambio de nucleótidos hace que tales vías sean difíciles de interpretar. La simplicidad de este método para comparar solo pares de proteínas de unión y utilizar condiciones de carga de nucleótidos cuidadosamente controladas permite dilucidar las vías de señalización. Sin embargo, la mayor fortaleza del protocolo es también la mayor debilidad, ya que es una simplificación de la situación in vivo . Los ensayos de competencia se pueden usar para construir una hipótesis sólida, pero esto debe probarse en células mediante experimentos de derribo.

Hay tres características que deben tenerse en cuenta al seleccionar las proteínas de unión a GTPasa marcadas con GFP que se utilizarán en el experimento. Primero, las proteínas de fusión deben expresarse bien en células de mamíferos, como HEK293T, ya que los ensayos de competencia requieren una cantidad razonable de proteína. En segundo lugar, debe ser posible purificar la proteína recombinante sin una degradación significativa y, cuando esto no sea posible, se debe considerar la clonación de un fragmento de unión a GTPasa. En tercer lugar, las dos proteínas de unión a GTPasa deben resolverse entre sí en SDS-PAGE para permitir el análisis en la sección 6.

Hay una serie de advertencias potenciales para el experimento que deben considerarse y posiblemente abordarse:

Posible desnaturalización de proteínas purificadas de unión a GTPasa durante el paso de elución ácida o impedimento estérico por la etiqueta GFP. En nuestras manos, estos no han sido un problema, pero deben ser probados. Las proteínas purificadas se pueden probar en ensayos funcionales ¹⁰. Ahora existen kits comerciales para probar la actividad de GEF o GAP sin la necesidad de nucleótidos marcados con isótopos. Las proteínas secuestrantes, por su naturaleza, protegen las GTPasas de la actividad de GEF o GAP, por lo que pueden usarse como inhibidores competitivos en los ensayos comerciales GEF o GAP, como lo hicimos en nuestra reciente publicación ⁷. La característica relevante de las proteínas que trafican con GTPasa es la capacidad de unirse a la GTPasa, y esto se puede probar fácilmente en un ensayo pull-down. Un enfoque alternativo para probar la integridad de las proteínas que es aplicable a todas las proteínas de unión es valorar la proteína eluida de las perlas de la trampa de GFP con glicina con la misma proteína eliminada de las perlas de la trampa de GFP por escisión enzimática. El experimento se analizaría probando tanto la proteína marcada como la escindida con GFP con un anticuerpo contra la proteína en sí. Si la proteína no está dañada por la elución, el equilibrio debe lograrse en una proporción de 1:1. Este enfoque también indicaría si la presencia de la etiqueta GFP en sí misma compromete las propiedades de unión de la proteína candidata, aunque esto requiere la producción de una construcción con un sitio de escisión enzimática entre la etiqueta y la proteína de unión. Ya sea que la proteína se vea comprometida por la etiqueta o el paso de elución, el problema podría abordarse modificando el protocolo para usar un método de purificación alternativo. En lugar de GFP, las proteínas de unión podrían marcarse con His, purificarse con Ni-NTA y analizarse con un anticuerpo contra la etiqueta His. La característica importante es que ambas proteínas de unión deben compartir una etiqueta común, aunque, si es necesario, se podrían agregar dos etiquetas a una proteína, una para la purificación y la otra para la detección.

El protocolo está diseñado para investigar la competencia entre las interacciones con los dominios I/II del switch. Aunque la mayoría de las interacciones de GTPasa están mediadas por este motivo, hay algunas excepciones, sobre todo las interacciones de los GDI que se unen a la cola de prenil, además de oscurecer los dominios de cambio. En principio, el protocolo podría adaptarse para utilizar GTPasa purificada a partir de células de mamíferos, de modo que la GTPasa se prenila, sin embargo, la presencia de múltiples sitios de unión o efectos alostéricos complican la interpretación de los datos de unión a la competencia. Otros problemas asociados con tal modificación son que las GDI se copurifican con GTPasa de células de mamíferos, comprometiendo la pureza de las proteínas aisladas y la naturaleza hidrofóbica de los grupos prenilo significa que las GTPasas preniladas están asociadas con GDI o membrana lipídica y tales factores deberían considerarse en el experimento.

La cantidad de GST-Rac1 que se utiliza en el ensayo. La proteína de unión a GTPasa constante debe estar en una concentración mayor que la Rac1, o cuando se agrega el competidor, simplemente se unirá a Rac1 libre. Será inmediatamente obvio si esto ha sucedido como unión del competidor, sin pérdida de la proteína constante, se detectará de la misma manera que cuando las dos proteínas competidoras se unen entre sí, como se muestra en la Figura 3B. Como control adicional (Paso 5.3), se debe incluir una reacción de unión que contenga el doble de la cantidad de proteína de unión constante y ninguna proteína de unión variable (Paso 5.3). Si el Rac1 en el experimento de titulación está saturado, duplicar la cantidad de proteína de unión constante no tendrá ningún efecto en la salida. Los volúmenes sugeridos en el protocolo deberían ser apropiados, pero la cantidad de Rac1 se puede reducir fácilmente. Si se observa la unión del competidor sin pérdida del compañero de unión constante, se debe intentar reducir la cantidad de Rac1 antes de intentar mapear los sitios de unión para evitar la formación de complejos ternarios.

Interacción no específica de las proteínas de unión a GTPasa con el GST o la perla, así como específicamente con Rac1. Este problema se manifestaría por la unión residual de la proteína de unión a GTPasa constante, incluso cuando la proteína de unión a GTPasa variable ha alcanzado una meseta a alta concentración. La identificación de este problema se verá favorecida por la realización de experimentos recíprocos en los que se intercambian las proteínas de unión a GTPasa constantes y variables. Los experimentos recíprocos también mejorarán en gran medida la precisión de la estimación del punto de equilibrio, por lo que siempre deben incluirse. En los casos de unión no específica, las concentraciones relativas a las que se logra el equilibrio aún se pueden calcular comparando la intensidad de la banda entre los máximos y mínimos para cada proteína, o midiendo el alcance de la unión no específica utilizando perlas GST como cebo, en lugar de GST-Rac1.

Se deben utilizar ensayos de arrastre que utilicen diferentes condiciones de carga de nucleótidos para complementar el ensayo de competencia descrito en este protocolo. Determinar la preferencia de nucleótidos de los socios es importante tanto para comprender los eventos de competencia como para comprender la vía de señalización en la que está involucrada la proteína de unión a GTPasa. En la Figura 2B analizamos la unión de proteínas con preferencia establecida por GTPasa cargada o libre de nucleótidos como un medio para validar la carga de nucleótidos. Sin embargo, es sensato investigar también el efecto de la carga de nucleótidos en cada uno de los competidores. Si los competidores hipotéticos muestran preferencias diferentes, la competencia contribuirá menos a la vía de señalización y, de hecho, es probable que el recambio de nucleótidos sea el mecanismo que dirija el intercambio de las proteínas de unión.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bugbuster	Novagen	70584-3
COMPLETO inhibidor de la proteasa	Roche	05 056 489 001
Perlas magnéticas de glutatión	Pierce	88821
Polietilenimina, ramificada, media Mw ~25.000	Sigma Aldrich	408727-100ML
OPIMEM	Life Technologies	31985-047
Dulbecco's Modified Eagle Media	Sigma Aldrich	D5796
Suero fetal bovino	Technologies	10270-1-6
L-Glutamina	Life Technologies	25030-024
GFP-Trap_A	Chromotec	gta-20
GDP	Sigma Aldrich	G7127	Altamente inestable. Alícuota y almacenamiento a -80 inmediatamente después de la reconstrucción
: GTPγ S	Sigma Aldrich	G8634	Altamente inestable. Alícuota y almacenamiento a -80 inmediatamente después de la reconstrucción
. Tampón de bloqueo	Sigma Aldrich	B6429
Tween-20	Sigma Aldrich	P9416
Anticuerpo anti-GFP	Living Colors	632592	Uso con dilución 1/1000
DyLight 800 cabra conjugada Anticuerpo secundario anti-conejo	Fisher Scientific	10733944
Anticuerpo anti-PAK1	Señalización celular	2602S	Uso con dilución 1/1000
Odyssey SA Sistema de imágenes infrarrojas	Li-cor	9260-11PC