El cultivo de gotas verticales ex vivo es una alternativa a las técnicas experimentales actuales in vitro e in vivo. Este protocolo es fácil de realizar y requiere cantidades más pequeñas de reactivo, a la vez que permite la capacidad de manipular y estudiar la vascularización, morfogénesis y organogénesis fetal.
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Resumen
Resumen
La investigación de la organogénesis en el útero es un proceso técnicamente difícil en los mamíferos placentarios, debido a la inaccesibilidad de los reactivos a los embriones que se desarrollan dentro del útero. Un método de cultivo de gotas recién desarrollado ex vivo en posición vertical ofrece una alternativa atractiva a los estudios realizados en el útero. El cultivo ex vivo gotita proporciona la capacidad de examinar y manipular las interacciones celulares y diversas vías de señalización a través del uso de diversos bloqueo y compuestos activadores; Además, los efectos de diversos reactivos farmacológicos sobre el desarrollo de órganos específicos pueden ser estudiados sin efectos secundarios no deseados de la administración de fármacos sistémico en el útero. En comparación con otros sistemas in vitro, el cultivo de gota no sólo permite la capacidad de estudio de tres dimensiones morfogénesis y las interacciones célula-célula, que no puede ser reproducida en líneas celulares de mamíferos, sino que también requiere significativamente menos reagents que otros ex vivo e in vitro. protocolos Este trabajo demuestra la disección del ratón correcto fetal órgano y técnicas de cultivo de gotita en posición vertical, seguido por inmunofluorescencia órgano completo para demostrar la eficacia del método. El método de cultivo gotita ex vivo permite la formación de la arquitectura de órganos comparable a lo que se observa in vivo y puede ser utilizado para estudiar los procesos de otro modo difíciles de estudio debido a la letalidad embrionaria en modelos in vivo. Como un sistema de solicitud de modelo, un inhibidor de molécula pequeña se utilizará para investigar el papel de la vascularización en la morfogénesis testicular. Este método de cultivo gotita ex vivo es ampliable a otros sistemas de órganos fetales, como el de pulmón y posiblemente otros, aunque cada órgano debe ser ampliamente estudiados para determinar las modificaciones órgano-específicas en el protocolo. Este sistema de cultivo de órganos ofrece flexibilidad en la experimentación con los órganos fetales, y resulta obtained usando esta técnica ayudará a los investigadores a obtener conocimientos sobre el desarrollo fetal.
Introducción
La regeneración de órganos in vivo en los seres humanos es muy limitada; Por lo tanto, la ingeniería de tejidos, el desarrollo de tejidos y órganos a partir de células individuales donados por un anfitrión, se está convirtiendo en una terapia potencial atractivo para el reemplazo de órganos. Sin embargo, para que esta estrategia terapéutica para tener éxito, los factores y las interacciones celulares implicados en la morfogénesis del órgano deben ser estudiados a fondo y bien entendidos. Debido a la incapacidad para estudiar el desarrollo de los órganos específicos con los enfoques tradicionales, los investigadores han recurrido a embrión conjunto alternativ....
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Protocolo
Todos los ratones utilizados en estos estudios fueron ratones CD-1 obtenidos de Charles River Laboratories. Experimentos de cultivo anteriores también se han realizado en otras cepas, tales como C57BL / 6J (datos no presentados), pero cualquier cepa se puede utilizar. Hembras adultas embarazadas fueron de aproximadamente 2-3 meses de edad y se sacrificaron mediante inhalación de CO2, seguido por dislocación cervical y toracotomía bilateral antes de la eliminación del embrión. Los animales fueron alojados de conformidad con las directrices del NIH, y los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional del ....
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Resultados
El cultivo ex vivo de gota le permite a uno para manipular órganos enteros, como el de las gónadas, para estudiar las interacciones celulares y dinámicas. La figura 1 muestra de manera gradual cómo preparar una cultura E11.5 gonadal gotas. Los primeros pasos en el protocolo de cultivo incluyen la eliminación inicial del útero que contiene embrión del ratón madre (Figura 1A y 1B). Después de la extracción del útero de la madre, la pared uterina se corta y los embriones se liberó.......
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Discusión
Este estudio demuestra un método ex vivo gotita entera órgano que tiene muchas aplicaciones potenciales para el estudio del desarrollo fetal. Esta técnica se puede utilizar para múltiples órganos, y permite al investigador para abordar cuestiones biológicas que son difíciles de examinar usando enfoques in vivo debido a la inaccesibilidad de los embriones y el potencial letalidad embrionaria. Este método de cultivo tiene beneficios adicionales sobre otros enfoques in vitro, tales como líneas ce.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Los autores fueron apoyados por: una Beca de Investigación CancerFree KIDS, un Premio Basil O'Connor Starter Scholar de March of Dimes (#5-FY14-32), un Premio de Subvención del Fideicomisario del Centro Médico del Hospital Infantil de Cincinnati (CCHMC); un Premio de Innovación en Investigación y Financiamiento Piloto de CCHMC; y fondos de desarrollo de CCHMC. Los autores también reconocen al laboratorio Capel por la optimización inicial de esta técnica.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Portaobjetos de microscopio Superfrost Plus | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Cubrevases: Cuadrados (22 mm x 22 mm, n.º 1,5) | Fisherbrand | 12-541B | |
| Sally Hansen Xtreme Wear Esmalte de uñas, invisible | Sally Hansen | ||
| 8 tiras 0,2 ml Tubos de PCR & Tapas planas desmontables | GeneMate | T3218-1 | |
| Pipetman L P1,000L, P200L, P20L, P10L, P2L | Gilson | FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M | |
| Pinzas Dumont #5 FST | 91150-20 | ||
| Tijeras finas | FST | 91460-11 | |
| Posi-Click Tubos de microcentrífuga de 1,7 ml | Denville | C2170 | |
| Posi-Click Tubos de microcentrífuga de 0,6 ml | Denville | C2176 | |
| 10 μ l Puntas de barrera de precisión SHARP | Denville | P1096FR | |
| 20 μ l Puntas de barrera de precisión SHARP | Denville | P1121 | |
| 200 μ l Puntas de barrera de precisión SHARP | Denville | P1122 | |
| 1,000 μ l SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1126 | |
| jeringa de 1 ml con agujas de calibre 27 | BD PrecisionGlide | 309623 | |
| jeringa de 10 ml | BD | 305559 | |
| 0.2 μ M Filtro de jeringa PES | VWR | 28145-501 | |
| Grado 3 Papel de filtro cualitativo Grado estándar, círculo, 185 mm | Whatman | 1003-185 | |
| Primaria 35 mm Plato de cultivo celular estilo fácil agarre | Falcon/Corning | 353801 | |
| Placas de Petri, estériles (100 mm x 15 mm) | VWR | 25384-088 | |
| Incubadora New Brunswick Galaxy 14 S CO2 | Eppendorf | CO14S-120-0000 | |
| Gabinete de bioseguridad | Nuare | NU-425-400 | |
| Minicentrífuga | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| BioExpress GyroMixer Variable XL | GeneMate | R-3200-1XL | |
| Mastercycler Pro Termociclador con panel de control | |||
| SMZ445 | Nikon | SMZ445 | |
| Gabinete de luz multiimagen con software AlphaEase Alpha | Innotech Corporation | Descontinuado | |
| Etanol absoluto de 200 grados | Fisher | BP2818-500 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| Fosfato de sodio (Dibásico MW 142) Na2HPO4 | Fisher | S374-1 | |
| Fosfato de potasio (monobásico MW 136) KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379-1KG | |
| Cloruro de sodio (NaCl) | Fisher | S671-3 | |
| Cloruro de potasio (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911-1KG | |
| Cloruro de magnesio (MgCl2) | Sigma | M2393-100g | |
| Cloruro de calcio (CaCl2) | Sigma | C5670-100g | |
| Ambion Nucleasa Tecnologías de vida de agua libre de nucleasas | AM9938 | ||
| Cartilla de PCR XY | IDT | N/A | |
| Ácido acético glacial | Fisher | A38-500 | |
| Ácido etilendiamina tetraacético (EDTA) | Fisher | BP2482-1 | |
| Solución de bromuro de etidio al 1% | Fisher | BP1302-10 | Agarosa tóxica |
| GeneMate | E-3120-500 | ||
| Hidróxido de sodio (NaOH) | Sigma-Aldrich | 367176-2.5KG | |
| Trizma Base | Sigma | T1503-1KG | |
| dNTP Set, 100 mM Soluciones | Thermo Scientific | R0182 | |
| DNA Choice Taq polimerasa con tampón 10x | Denville | CB-4050-3 | |
| Paraformaldehído | Fisher | O4042-500 | Tóxico |
| FluorMount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Cloruro de hidrógeno ( HCl) | |||
| (BSA), polvo, fracción V, aislamiento de choque térmico | Bioexpress | 0332-100g | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Suero fetal bovino (FBS), triple filtrado de 100 nm | Fisher | 03-600-511 | Inactivación por calor antes de usar |
| penicilina-estreptomicina (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | Uso a 1:100 |
| Dimetilsulfóxido (DMSO), Hybri-max, filtrado estéril | Sigma | D2650 | |
| VEGFR Inhibidor de tirosina quinasa II - CAS 269390-69-4 - Calbiochem | EMD Millipore | 676481 | |
| Conejo Anticuerpo Anti-Sox9 | Millipore | AB5535 | Uso en dilución: 1:4.000 |
| Rata Anti-Ratón PECAM1 (CD31) Anticuerpo | BD Pharmingen | 553370 | Uso en dilución: 1:250 |
| Conejo Hendido Caspasa-3 (Asp175) Anticuerpo | Señalización Celular | 9661S | Uso en dilución: 1:250 |
| Rata E-cadherina / CDH1 Anticuerpo (ECCD-2) | Life Technologies | 13-1900 | Uso en dilución: 1:500 |
| Hoechst 3342, triclorhidrato, trihidrato | Invitrogen (sondas moleculares) | H1399 | Uso en 2 ug/ml |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-165-153 | Uso en dilución: 1:500 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-605-153 | Uso en dilución: 1:500 |
| Anticuerpo secundario anti-Conejo IgG (H+L) de Burro, conjugado Alexa Fluor 555 | Life Technologies | A31572 | Uso en la dilución: 1:500 |
| Anticuerpo secundario anti-IgG (H+L) anti-Conejo de Burro, conjugado Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21206 | Uso en la dilución: 1:500 |
| Anticuerpo secundario Anticuerpo IgG (H+L) anti-Rata Anti-Rata IgG (H+L), conjugado Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21208 | Uso en la dilución: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Anticuerpo secundario, Alexa Fluor 647 conjugado | Life Technologies | A31573 | Uso en la dilución: 1:500 |
Referencias
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. J. Vis. Exp. (85), e50803(2014).
- Maatouk, D. M., et al. Stabilization of beta-catenin in XY gonads causes male-to-female sex-reversal. Hum. Mol. Genet. <....
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Reimpresiones y permisos
