Las propiedades inmunomoduladoras de las células madre mesenquimales humanas (MSC) aparecen cada vez más relevante para la aplicación clínica. El uso de un sistema de co-cultivo de MSCs y leucocitos de sangre periférica pre-manchado con la succinimidil éster colorante fluorescente carboxifluoresceína (CFSE), se describe la evaluación in vitro de MSC sobre la proliferación de leucocitos inmunomodulación efector y subpoblaciones específicas.
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Artículo de método
Evaluación de las propiedades inmunomoduladoras de las células madre mesenquimales humanas (MSC)
En este artículo
Resumen
Resumen
Las propiedades inmunomoduladoras de las células madre mesenquimales humanas (MSCs) multilinaje parecen ser muy relevantes para su uso clínico en una amplia gama de enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario. Los mecanismos implicados se están dilucidando cada vez más y en este artículo describimos el experimento básico para evaluar la inmunomodulación de MSC mediante el ensayo de supresión de la proliferación de leucocitos efectores. Como representación de la activación, la proliferación de leucocitos se puede evaluar mediante una serie de técnicas, y describimos en este protocolo el uso del colorante celular fluorescente carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) para marcar leucocitos con análisis de citometría de flujo posteriores. Esta técnica no solo puede evaluar la proliferación sin radiactividad, sino también el número de divisiones celulares que se han producido, además de permitir la identificación de la población específica de células en proliferación y la expresión intracelular de citocinas/factores. Además, el ensayo se puede adaptar para evaluar poblaciones específicas de leucocitos efectores mediante la selección de marcadores de superficie de perlas magnéticas de poblaciones de células mononucleares de sangre periférica antes del cocultivo con MSC. La flexibilidad de este ensayo de cocultivo es útil para investigar las interacciones celulares entre las MSC y los leucocitos.
Introducción
Células madre mesenquimatosas humanas (MSCs) son progenitores somáticas que pueden diferenciarse en los linajes mesodérmicos paraxiales de hueso, cartílago, y tejido adiposo 1-4, así como a unos pocos linajes extramesodermal 5. En primer lugar aislado de la médula ósea de adultos, estos progenitores multilinaje ahora se han encontrado en numerosos tejidos y 6-8, de forma inesperada, que se muestra a tener fuertes propiedades inmunomoduladoras que aparecen altamente susceptibles a la aplicación clínica 9-12. Mecanismos detallados implicados en los efectos inmunomoduladores activamente están siendo investigados por la aplicac....
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Protocolo
El consentimiento informado del paciente aprobado por la junta de revisión institucional debe ser obtenido por el uso de las células humanas.
1. Densidad aislamiento degradado de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC)
- Añadir 25 ml de sangre entera heparinizada en un tubo de 50 ml con una pipeta 25 ml.
- Diluir las células con 25 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Añadir 15 ml de gradiente de densidad de Ficoll-Paque en un nuevo tubo de 50 ml, y mientras se inclina el tubo, muy lentamente y cuidadosamente añadir en 25 ml de la suspensión celular diluido a lo largo del ....
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Resultados
La Figura 1 indica el esquema general del experimento, y la Figura 2 muestra el aspecto de las distintas condiciones de cultivo celular como se visualizaron mediante contraste de fase invertida microscopía. MSCs son células adherentes con una fibroblástica, la morfología en forma de huso, mientras que PBMCs y leucocitos son pequeñas células no adherentes redondas. Estos dos tipos de células morfológicamente diferentes pueden verse claramente en el co-cultivo. Al final del ensayo, cuando las.......
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Discusión
Cada vez más, las propiedades inmunomoduladoras de las MSC se están traduciendo en uso clínico más rápidamente que la capacidad multilinaje de estas células madre18-20. Por lo tanto, las técnicas de cocultivo de MSC con leucocitos y los ensayos para evaluar la función inmune son importantes para delinear aún más los mecanismos específicos involucrados en estas propiedades para optimizar la aplicación terapéutica efectiva.
Uno de los aspectos técnicos más críticos para el éxito en e.......
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Divulgaciones
No tenemos nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado en parte por subvenciones de NHRI (CS-104-PP-06 a B.L.Y.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 AG | Densidad grandiosa para el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) |
| Vibrant CFDA-SE Cell Tracer Kit (CFSE) | Life Technologies | V12883 | Marcador celular para la detección de la división celular |
| Fitoaglutinina (PHA) | Sigma | L8902 | Activación de PBMCs humanas |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/28 | Life Technologies | 111.32D | Activación de linfocitos T humanos, p. ej. CD4+ T T CD8+ T etc. |
| autoMACS™ Separador | Miltenyi Biotec | autoMACS™ Separador Separador | células de base magnética |
| autoMACS® Columnas | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | columnas de separación |
| CD14 microperlas, humanas | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | Para la selección positiva de monocitos y macrófagos humanos CD14+ a partir de |
| microperlas CD4 de PBMC, humanos | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | Para la selección positiva de linfocitos T humanos CD4+ de PBMC |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875 | PBMC humano / medio de cultivo de leucocitos |
| DMEM, glucosa baja, piruvato | Life Technologies | 11885 | Medio de cultivo de células madre mesenquimales humanas (MSC) |
| L-glutamina | Life Technologies | 25030-081 | Suplementación para el medio completo MSC |
| Penicilina/estreptomicina | Life Technologies | 15070-063 | Suplementación para PBMC/leucocitos y MSC medio completo |
| Suero fetal bovino (FBS) | 1) Hyclone, para cultivo de MSC 2) Life Technologies, para todas las demás células (es decir, PBMC, poblaciones específicas de leucocitos) | 1) SH30070.03M 2) 10091-148 | Lotes de pruebas previas para el soporte de MSC in vitro |
| placa de cultivo celular de 24 pocillos | Corning | COR3524 | Placa de cocultivo |
| Tubo de centrífuga de 50 ml | Corning | 430291 | Isolation PBMCs de sangre total de Ficoll-Paque PLUS |
| Tubo de centrífuga de 15 ml | Corning | 430766 | Colección de fracciones celulares marcadas y no marcadas |
| Tubos de fondo redondo | BD Falcon | 352008 | Recolección de células para análisis de citometría de flujo |
Referencias
- Friedenstein, A. J. Precursor cells of mechanocytes. Int Rev Cytol. 47, 327-359 (1976).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
- Prockop, D. J.
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Reimpresiones y permisos
