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Evaluación de las propiedades inmunomoduladoras de las células madre mesenquimales humanas (MSC)

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DOI:

10.3791/53265

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24 de diciembre de 2015

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1Regenerative Medicine Research Group, Institute of Cellular & System Medicine, National Health Research Institutes (NHRI), 2National Institute of Cancer Research, National Health Research Institutes (NHRI), 3Institute of Microbiology & Immunology, National Defense Medical Center

En este artículo

Resumen

Las propiedades inmunomoduladoras de las células madre mesenquimales humanas (MSC) aparecen cada vez más relevante para la aplicación clínica. El uso de un sistema de co-cultivo de MSCs y leucocitos de sangre periférica pre-manchado con la succinimidil éster colorante fluorescente carboxifluoresceína (CFSE), se describe la evaluación in vitro de MSC sobre la proliferación de leucocitos inmunomodulación efector y subpoblaciones específicas.

Resumen

Las propiedades inmunomoduladoras de las células madre mesenquimales humanas (MSCs) multilinaje parecen ser muy relevantes para su uso clínico en una amplia gama de enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario. Los mecanismos implicados se están dilucidando cada vez más y en este artículo describimos el experimento básico para evaluar la inmunomodulación de MSC mediante el ensayo de supresión de la proliferación de leucocitos efectores. Como representación de la activación, la proliferación de leucocitos se puede evaluar mediante una serie de técnicas, y describimos en este protocolo el uso del colorante celular fluorescente carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) para marcar leucocitos con análisis de citometría de flujo posteriores. Esta técnica no solo puede evaluar la proliferación sin radiactividad, sino también el número de divisiones celulares que se han producido, además de permitir la identificación de la población específica de células en proliferación y la expresión intracelular de citocinas/factores. Además, el ensayo se puede adaptar para evaluar poblaciones específicas de leucocitos efectores mediante la selección de marcadores de superficie de perlas magnéticas de poblaciones de células mononucleares de sangre periférica antes del cocultivo con MSC. La flexibilidad de este ensayo de cocultivo es útil para investigar las interacciones celulares entre las MSC y los leucocitos.

Introducción

Células madre mesenquimatosas humanas (MSCs) son progenitores somáticas que pueden diferenciarse en los linajes mesodérmicos paraxiales de hueso, cartílago, y tejido adiposo 1-4, así como a unos pocos linajes extramesodermal 5. En primer lugar aislado de la médula ósea de adultos, estos progenitores multilinaje ahora se han encontrado en numerosos tejidos y 6-8, de forma inesperada, que se muestra a tener fuertes propiedades inmunomoduladoras que aparecen altamente susceptibles a la aplicación clínica 9-12. Mecanismos detallados implicados en los efectos inmunomoduladores activamente están siendo investigados por la aplicación efectiva de entidades patológicas específicas. Una de las formas más sencillas para evaluar la inmunomodulación es mediante la evaluación para la supresión de la proliferación de leucocitos efector 13. La mayoría de los leucocitos efectoras tales como linfocitos y monocitos T proliferan prodigiosamente cuando es estimulado o activado. La función inmunomoduladora se puede evaluar cuando la supresión de laproliferación se evidencia.

Tradicionalmente, la proliferación de leucocitos efector ha sido evaluada por detección de [3 H] timidina en el ADN. Sin embargo, este método tiene inconvenientes significativos debido a las preocupaciones de la radiación y la post-uso disposición, así como el equipo complejo sea necesario. Si bien hay ensayos no radiactivos para evaluar la proliferación celular, el éster de succinimidilo de carboxifluoresceína (CFSE) de ensayo tiene otras ventajas tales como permitir que para la identificación de poblaciones celulares específicas, lo cual es especialmente útil en los experimentos de co-cultivo que implican múltiples tipos de células. CFSE es un colorante fluorescente celular que puede ser evaluado mediante análisis de citometría de flujo. Como las células se dividen, la intensidad de esta etiqueta celular se reduce proporcionalmente; Esto no sólo permite la determinación de la proliferación celular en general, pero también permite la evaluación del número de divisiones celulares hasta 8 divisiones antes de la fluorescencia se vuelve difícil en Detect contra la señal de fondo. Por otra parte, la estabilidad de la CFSE fluorescente permite el seguimiento in vivo de células marcadas tales que las células pueden ser visualizadas hasta muchos meses 14.

Este ensayo también se puede variar para evaluar tipos específicos de leucocitos efectoras o la función inmunomoduladora de las poblaciones específicas de MSC inducida por leucocitos-tales inmunomoduladores como la interleucina-10 (IL-10) que produce monocitos CD14 + 15 mediante la realización de talón marcador de selección superficie magnética del poblaciones de células de interés antes o después de co-cultivo según sea apropiado. Nuestro protocolo describe el ensayo básico de la evaluación de los efectos inmunomoduladores de MSCs en los leucocitos efectoras (diagrama de flujo mostrado en la Figura 1) y una variación de este ensayo básico para la evaluación de la inducida por MSC inmunomodulación de leucocitos en alogénicas CD4 + efectoras linfocitos T (diagrama de flujo mostrado en la Figura 4).

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Protocolo

El consentimiento informado del paciente aprobado por la junta de revisión institucional debe ser obtenido por el uso de las células humanas.

1. Densidad aislamiento degradado de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC)

  1. Añadir 25 ml de sangre entera heparinizada en un tubo de 50 ml con una pipeta 25 ml.
    1. Diluir las células con 25 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
  2. Añadir 15 ml de gradiente de densidad de Ficoll-Paque en un nuevo tubo de 50 ml, y mientras se inclina el tubo, muy lentamente y cuidadosamente añadir en 25 ml de la suspensión celular diluido a lo largo del gradiente de densidad de manera que no hay mezcla de la sangre entera con el gradiente de densidad, es decir., ninguna perturbación de la interfaz de gradiente de densidad de sangre.
  3. Centrifugar la suspensión de la etapa 1.2 a 400 × g durante 30 a 40 min en un rotor oscilante-cubo de temperatura controlada sin freno a 20 ° C.
    Nota: Tres capas distintas deben ser evidentes después de la centrifugación: THe plasma ser capa superior; la capa transparente de fondo es el gradiente de densidad de Ficoll-Paque; y una capa celular fina, medio estando las PBMCs
  4. Aspirar y descartar la capa superior por aspiración con una pipeta Pasteur, con cuidado de no alterar la capa de interfase de células mononucleares (es decir, linfocitos, monocitos y plaquetas).
  5. Recoger cuidadosamente esta capa de células mononucleares con una pipeta de 10 ml a un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml.
  6. Llenar el tubo con 20 ml de PBS, se mezcla bien, y se centrifuga a 300 xg durante 10 min a 20 ° C. Eliminar el sobrenadante por completo después de la centrifugación.
  7. Resuspender el sedimento celular en 20 ml de PBS y centrifugar a 200 × g durante 10-15 minutos a 20 ° C. Eliminar el sobrenadante por completo después de la centrifugación.
    Nota: Este paso elimina las plaquetas-que no son deseados, dentro de los PBMCs; este paso se puede repetir para asegurar la eliminación completa de las plaquetas.
  8. Si no hay selección de poblaciones específicas esdeseada, sedimento celular se resuspende en medio completo de leucocitos (suero bovino fetal al 10% (FBS), 1% de L-glutamina, y 1% de penicilina / estreptomicina en medio RPMI-1640) para el cultivo después de realizar un recuento de células 16 para suspender 1 ml de medio por cada 10 7 PBMC antes de proceder al siguiente paso.

2. Etiquetado magnética de leucocitos Poblaciones (vaya al paso 4 si no hay selección de poblaciones específicas es necesario)

  1. Centrifugar la suspensión de PBMC a 300 × g durante 10 min y el sobrenadante aspirado por completo.
  2. Resuspender el sedimento celular en 80 l de PBS por 10 7 células totales.
  3. Añadir 20 l de perlas magnéticas especificados (es decir, perlas magnéticas CD14 para el aislamiento de monocitos, perlas magnéticas CD4 para el aislamiento de linfocitos T) por 10 7 células totales.
  4. Mezclar bien e incubar durante 15 min a entre 2 y 8 ° C en el refrigerador.
  5. Añadir 1-2 ml de PBS por 10 7 células para lavar y centrifugara 300 × g durante 10 min.
  6. Aspirar el sobrenadante y resuspender completamente hasta 10 8 células en 500 l de PBS.

3. Selección magnética de subpoblaciones de leucocitos

Nota: Una variedad de separadores de cuentas magnéticas y las columnas están disponibles para el aislamiento de la población específica de leucocitos por marcador de superficie celular de un número de fabricantes. El aislamiento puede ser por selección positiva basada en uno o unos pocos marcadores positivos o por selección negativa después de la depleción de las poblaciones no deseados. Un enfoque general de la realización de la selección positiva utilizando un marcador (es decir, CD4 de los linfocitos T helper, o CD14 de monocitos) se describe a continuación.

  1. Preparar y separador magnético prime incluyendo la columna de separación de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  2. Aplicar tubo que contiene la muestra de PBMCs etiquetados. Proporcionar dos 15 ml tubos de centrifugación para la recogida del y unlabel marcado positivamentefracciones celulares ed, siguiendo las instrucciones del fabricante.
  3. Contar el número de células 15 y resuspender los leucocitos seleccionados positivamente (es decir, linfocitos T CD4 + CD14 + o células) en medio completo de leucocitos, utilizando 1 ml de medio por 10 7 células.

4. CFSE tinción de leucocitos para la Evaluación de la proliferación

Nota: CFSE ha sido ampliamente utilizado en las investigaciones inmunológicas, por tanto in vivo e in vitro. Nuestro protocolo ha sido optimizado para el estudio in vitro de MSC / PBMC (u otros leucocitos) interacciones. Si bien los pasos generales involucrados en la realización de marcaje in vitro CFSE son similares, puede haber diferencias en la dosis específica y el momento del protocolo 14. Esto puede ser debido a un número de factores, es decir, el tipo de célula específico utilizado, el número de células utilizadas-que probablemente puede afectar a la intensidad de la señal fluorescente CFSE.

  1. Diluir la solución CFSE madre (10 mM) en PBS a la concentración de trabajo deseada de 10 M (solución CFSE-trabajo). Preparar 10 7 células (es decir, PBMCs o células T) para el etiquetado con la solución CFSE-trabajo.
  2. Centrifugar a 300 × g durante 10 min para obtener un sedimento de células y aspirar el sobrenadante.
  3. Resuspender las células suavemente en 1 ml de solución (37 ° C) CFSE-trabajo precalentado y se incuban las células durante 10 minutos a 37 ° C.
  4. Para lavar el exceso de CFSE, se diluye la suspensión celular con 10 veces (en volumen) de preenfriado (4 ° C) medio RPMI que contenía 10% de FBS. Sedimentar las células por centrifugación a 300 xg durante 5 min y descartar el sobrenadante. Lavar el sedimento celular de esta manera dos veces más.
  5. Re-sedimentar las células por centrifugación y contar el número de células 15. Resuspender 10 7 células (ya sea PBMCs o células T) en 1 ml de medio completo de leucocitos precalentado fresco.

5. Co-cultura de MSC con leucocitos y activación de los leucocitos

  1. Medio Pre-caliente MSC completa (10% de FBS (previamente probado para un crecimiento óptimo MSC), 1% de L-glutamina, y 1% de penicilina / estreptomicina en medio DMEM de baja glucosa) a 37 ° C durante no más de 30 min.
  2. MSCs semilla a 50.000 células en 1 ml de medio completo MSC en placas de 24 pocillos (densidad MSC: 25.000 células / cm 2) para la fijación O / N en una incubadora a 37 °, lo que permite que las células madre para alcanzar 80% de confluencia.
  3. Medio Aspirar, y en base a los números de MSC sin semillas, añadir PBMC marcadas con CFSE (previamente marcado con consulte protocolo Paso 4 arriba) para las MSC cultivadas (sembradas el día anterior en placas de 24 pocillos) en 1 ml de medio completo de leucocitos en una 1:10 (proporción de células) Relación de co-cultivo de MSCs a PBMCs.
  4. Añadir la fitohemaglutinina mitógeno (PHA), un activador de leucocitos no específica, a una concentración final de 10 mg / ml en un volumen total de 1 ml de medio completo por pocillo de leucocitos.
    1. AlternativEly, para estimular para la activación de los linfocitos T específicamente: utilizar alfa-CD3 / 28 microperlas y añadir a la de dos células de co-cultivo para obtener una relación de linfocitos bead-a-T de 1: 1.
  5. Para el control negativo, la placa de 500.000 PBMCs / pocillo (o una población específica de leucocitos efector; densidad celular: 250.000 leucocitos / cm 2) en una placa de 24 pocillos con 1 ml de medio completo de leucocitos solamente; para el control positivo, además de chapado en el mismo número de PBMC / pocillo, añadir PHA a una concentración final de 10 mg / ml.
  6. En el tercero y quinto día del experimento de co-cultivo, evaluar la proliferación de leucocitos marcados con CFSE (colocados en tubos de fondo redondo) por análisis de citometría de flujo 17 con filtros adecuados para fluoresceína 488 nm de excitación y de emisión.
    Nota: tinción intracelular de citoquinas para el análisis de citometría de flujo también se puede realizar para estos leucocitos marcados con CFSE en este punto para evaluar los cambios en el perfil de expresión de citocinas de leucocitos como Modulated por MSC. Desde CFSE se evalúa con un apropiado filtro para fluoresceína, los anticuerpos seleccionados para evaluar diversas citoquinas necesitan ser conjugados a fluorocromos distintos de fluoresceína o espectro similar (es decir, ficoeritrina, peridinina clorofila complejo de proteína (PerCP)).

6. Variación: Ensayo Supresión Efector Magnetic Bead-seleccionado, MSC inducida inmunomoduladora leucocitos en Activado marcadas con CFSE células T efectoras CD4 +

  1. MSC semilla a 250.000 células en 3 ml de medio completo MSC en placas de 6 pocillos (densidad MSC: 25.000 células / cm 2) para la fijación O / N en una incubadora a 37 °, lo que permite a las células madre para llegar a 80% de confluencia. Al menos 3 placas de 6 pocillos son necesarios para garantizar PBMCs-MSC cocultured suficientes para la selección sub-población.
  2. Aspirar medio, y agregue PBMCs separados según el Paso 1, pero en placas de 6 pocillos a 2,5 x 10 6 células / pocillo (densidad celular: 250 000 leukocytes / cm 2) con 3 ml de medio completo de leucocitos. Co-cultivo durante 48 a 72 horas en una incubadora a 37 °.
  3. Magnética talón seleccionar población específica de leucocitos inmunomoduladores inducidos por el MSC (es decir, células CD14 +) como por las Secciones 2-3.
    Notas: tinción intracelular de citoquinas para el análisis de citometría de flujo se pueden realizar en este punto para evaluar los cambios en el perfil de expresión de citocinas de leucocitos, es decir, la expresión de la interleucina-10-como moduladas por MSCs.
  4. Agregar CFSE marcado con células T CD4 + alogénicas generadas según las Secciones 2-4 en placas de 24 pocillos en 1 ml de leucocitos completa (densidad de células T: 250.000 células / cm 2) medio de leucocitos inducida por MSC talón-seleccionados en diversas proporciones , es decir, 1:10, 1: 5, 1: 2, y 1: 1 (una célula a otra) ratios.
  5. Para estimular las células T CD4 +, añadir alfa-CD3 / 28 microperlas conjugados para obtener una proporción de grano a célula de 1: 1.
  6. Para un control negativo, placa 500.000 células T CD4 + / pocillo en un (densidad de células T: 250.000 células / cm 2) placa de 24 pocillos con 1 ml de medio completo de leucocitos solamente; para el control positivo, además de chapado en el mismo número de células T CD4 + / pocillo, añadir alfa-CD3 / 28 microperlas conjugados para obtener una proporción de grano a célula de 1: 1.
  7. En el día 3 rd de co-cultivo, evaluar la proliferación de las células T CD4 + marcadas con CFSE (colocados en tubos de fondo redondo) por el flujo de análisis de citometría de 16 con filtros apropiados para fluoresceína 488 nm de excitación y de emisión.

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Resultados

La Figura 1 indica el esquema general del experimento, y la Figura 2 muestra el aspecto de las distintas condiciones de cultivo celular como se visualizaron mediante contraste de fase invertida microscopía. MSCs son células adherentes con una fibroblástica, la morfología en forma de huso, mientras que PBMCs y leucocitos son pequeñas células no adherentes redondas. Estos dos tipos de células morfológicamente diferentes pueden verse claramente en el co-cultivo. Al final del ensayo, cuando las...

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Discusión

Cada vez más, las propiedades inmunomoduladoras de las MSC se están traduciendo en uso clínico más rápidamente que la capacidad multilinaje de estas células madre18-20. Por lo tanto, las técnicas de cocultivo de MSC con leucocitos y los ensayos para evaluar la función inmune son importantes para delinear aún más los mecanismos específicos involucrados en estas propiedades para optimizar la aplicación terapéutica efectiva.

Uno de los aspectos técnicos más críticos para el éxito en e...

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Divulgaciones

No tenemos nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado en parte por subvenciones de NHRI (CS-104-PP-06 a B.L.Y.).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare71-7167-00 AGDensidad grandiosa para el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs)
Vibrant CFDA-SE Cell Tracer Kit (CFSE)Life TechnologiesV12883Marcador celular para la detección de la división celular
Fitoaglutinina (PHA)SigmaL8902Activación de PBMCs humanas
Dynabeads Human T-Activator CD3/28Life Technologies111.32DActivación de linfocitos T humanos, p. ej. CD4+ T T CD8+ T etc.
autoMACS™ SeparadorMiltenyi BiotecautoMACS™ Separador Separadorcélulas de base magnética
autoMACS® ColumnasMiltenyi Biotec130-021-101columnas de separación
CD14 microperlas, humanas Miltenyi Biotec130-050-201Para la selección positiva de monocitos y macrófagos humanos CD14+ a partir de
microperlas CD4 de PBMC, humanos Miltenyi Biotec130-045-101Para la selección positiva de linfocitos T humanos CD4+ de PBMC
RPMI 1640 MediumLife Technologies11875PBMC humano / medio de cultivo de leucocitos
DMEM, glucosa baja, piruvatoLife Technologies11885Medio de cultivo de células madre mesenquimales humanas (MSC)
L-glutaminaLife Technologies25030-081Suplementación para el medio completo MSC
Penicilina/estreptomicinaLife Technologies15070-063Suplementación para PBMC/leucocitos y MSC medio completo
Suero fetal bovino (FBS)1) Hyclone, para cultivo de MSC                                    2) Life Technologies, para todas las demás células (es decir, PBMC, poblaciones específicas de leucocitos)1) SH30070.03M 2) 10091-148Lotes de pruebas previas para el soporte de MSC in vitro
placa de cultivo celular de 24 pocillosCorningCOR3524Placa de cocultivo
Tubo de centrífuga de 50 mlCorning430291Isolation PBMCs de sangre total de Ficoll-Paque PLUS
Tubo de centrífuga de 15 ml Corning430766Colección de fracciones celulares marcadas y no marcadas
Tubos de fondo redondoBD Falcon 352008Recolección de células para análisis de citometría de flujo
de

Referencias

  1. Friedenstein, A. J. Precursor cells of mechanocytes. Int Rev Cytol. 47, 327-359 (1976).
  2. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
  3. Prockop, D. J. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. Science. 276, 71-74 (1997).
  4. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
  5. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  6. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7, 211-228 (2001).
  7. Yen, B. L., et al. Isolation of multipotent cells from human term placenta. Stem Cells. 23, 3-9 (2005).
  8. Erices, A., Conget, P., Minguell, J. J. Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood. Br J Haematol. 109, 235-242 (2000).
  9. Bartholomew, A., et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol. 30, 42-48 (2002).
  10. Chang, C. J., et al. Placenta-derived multipotent cells exhibit immunosuppressive properties that are enhanced in the presence of interferon-gamma. Stem Cells. 24, 2466-2477 (2006).
  11. Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8, 726-736 (2008).
  12. Chen, P. M., Yen, M. L., Liu, K. J., Sytwu, H. K., Yen, B. L. Immunomodulatory properties of human adult and fetal multipotent mesenchymal stem cells. J Biomed Sci. 18, 49-59 (2011).
  13. Muul, L. M., et al. Measurement of proliferative responses of cultured lymphocytes. Curr Protoc Immunol. , Wiley & Sons, Inc. (2011).
  14. Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).
  15. Chen, P. M., et al. Induction of immunomodulatory monocytes by human mesenchymal stem cell-derived hepatocyte growth factor through ERK1/2. J Leukoc Biol. 96, 295-303 (2014).
  16. Oughton, J. A., Kerkvliet, N. I. UNIT 18.8 Immune cell phenotyping using flow cytometry. Curr Protoc Toxicol. Costa, L. G., Davila, J. C., Lawrence, D. A., Reed, D. J., Will, Y. , Wiley & Sons, Inc. 18.8.1-18.8.24 (2005).
  17. Phelan, M. C., Lawler, G. APPENDIX 3A Cell counting. Curr Protoc Cytom. Robinson, J. P., et al. , Wiley & Sons, Inc. A.3A.1-A.3A.4 (2001).
  18. Gebler, A., Zabel, O., Seliger, B. The immunomodulatory capacity of mesenchymal stem cells. Trends Mol Med. 18, 128-134 (2012).
  19. Le Blanc, K., et al. Mesenchymal stem cells for treatment of steroid-resistant, severe, acute graft-versus-host disease: a phase II study. Lancet. 371, 1579-1586 (2008).
  20. Tan, J., et al. Induction therapy with autologous mesenchymal stem cells in living-related kidney transplants: a randomized controlled trial. JAMA. 307, 1169-1177 (2012).
  21. Le Blanc, K., et al. Mesenchymal stem cells inhibit and stimulate mixed lymphocyte cultures and mitogenic responses independently of the major histocompatibility complex. Scand J Immunol. 57, 11-20 (2003).
  22. Li, X. Y., et al. Long-term culture in vitro impairs the immunosuppressive activity of mesenchymal stem cells on T cells. Mol Med Rep. 6, 1183-1189 (2012).
  23. Moll, G., et al. Do cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunomodulatory and therapeutic properties? Stem Cells. 32, 2430-2442 (2012).
  24. Ho, P. J., Yen, M. L., Tang, B. C., Chen, C. T., Yen, B. L. H2O2 accumulation mediates differentiation capacity alteration, but not proliferative decline, in senescent human fetal mesenchymal stem cells. Antioxid Redox Signal. 18, 1895-1905 (2013).

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