La toma repetida de muestras de sangre es necesaria e importante en la investigación con animales. Desarrollamos un método novedoso, no letal y fiable para la recolección repetida de sangre de pez cebra adulto, y aplicamos este método al estudio de la bioquímica sanguínea, incluido el metabolismo de la glucosa.
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Artículo de método
Repetida extracción de sangre para pruebas de sangre en adultos de pez cebra
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Resumen
Resumen
Recogida de sangre repetida es una de las técnicas más comunes que se realizan en animales de laboratorio. Sin embargo, no se ha establecido un protocolo no letal para la recogida de sangre de pez cebra. Los métodos anteriores para la recogida de sangre de pez cebra son letales, como la incisión lateral, la decapitación y la ablación de la cola. Por lo tanto, hemos desarrollado un nuevo método de extracción de sangre "repetida", y presentar aquí un protocolo detallado que describa este procedimiento. Este método es mínimamente invasiva y se traduce en una tasa de mortalidad muy baja (2,3%) para el pez cebra, lo que permite tomar muestras de sangre repetidas del mismo individuo. El volumen máximo de muestreo de sangre es dependiente sobre el peso corporal de los peces. El volumen para el muestreo de sangre repetida a intervalos debe ser ≤0.4% del peso corporal cada semana o ≤1% cada 2 semanas, que fueron evaluados mediante mediciones de la hemoglobina de la sangre. Además, la hemoglobina, glucemia en ayunas, triglicéridos en plasma (TG) yc totalesSe midieron los niveles holesterol en el pez cebra adultos masculinos y femeninos. También se aplica este método para investigar la desregulación del metabolismo de glucosa en la obesidad inducida por la dieta. Este método de extracción de sangre permitirá a muchas aplicaciones, incluyendo la glucosa y el metabolismo de los lípidos y los estudios hematológicos, lo que aumentará el uso de pez cebra como modelo de enfermedad organismo humano.
Introducción
El pez cebra están ganando cada vez mayor popularidad como un modelo valioso de enfermedades humanas debido a que sus órganos y la genética son similares a los de los humanos 1,2. En el campo de la biología del desarrollo, muchos estudios han demostrado que el pez cebra y el espectáculo humano marcados similitud en la hematopoyesis 3, hemostasia 4,5, y mielopoyesis 6. Pez cebra adulto también se utilizan para el estudio inmunológico 7, 8 y las enfermedades neurodegenerativas relacionadas con la obesidad 9 porque este organismo modelo comparte vías comunes con los perturbado en enfermedades humanas. Par....
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Protocolo
Todos los animales procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad de Mie, y se realizaron de acuerdo a la regulación del bienestar animal japonesa "Ley para el Bienestar y la Gestión de los Animales '(Ministerio de Medio Ambiente de Japón) y cumplen con las directrices internacionales.
1. Preparación de la Aguja
NOTA: Todos los experimentos se realizaron bajo anestesia, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. Para la eutanasia, los peces se sumergieron en un baño de agua con hielo (5 partes de hielo / 1 parte de agua a ≤4 ° C) durante ≥20 min.
- P....
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Resultados
Este método de extracción de sangre causa daño mínimo para el pez cebra (a <1 mm de punción; Figura 1J) y produce una tasa de mortalidad muy baja de 2,3%. Examinamos el máximo volumen de sangre que podría ser recolectada a partir de un solo pez y se evaluó la relación a su peso corporal (Figura 3). Se encontró que el volumen máximo de sangre recogida se correlaciona linealmente con el peso corporal (R = 0,813). El mayor volumen de sangre recogida de un pez individual (peso corporal =.......
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Discusión
Presentamos aquí un protocolo detallado para la obtención seriada sangre de pez cebra adulto. Este método es sencillo de llevar a cabo y la usamos en el laboratorio en una base diaria. Este método de extracción de sangre se basa en la inserción de una aguja capilar de vidrio en aorta dorsal del pez cebra. Durante este procedimiento, es crítico que tener cuidado para no realizar la ablación de la columna vertebral debido a que es el criterio para la búsqueda de la aorta dorsal. La reducción de la lesión de la columna va .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por JSPS KAKENHI Grant Number 25860294 y 25590073. Nos gustaría agradecer a la Sra. Yui Namie por la ilustración dibujada a mano, y al Sr. Koshi Kataoka y la Sra. Sayuri Ichikawa por su ayuda con el mantenimiento del pez cebra.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Capilares de vidrio con filamento | Narishige | GD-1 de | 1,0 mm de diámetro exterior. |
| Extractor de agujas | Narishige | PC-10 | Para producir las agujas |
| Heparina | Wako Pure Chemical Industries | 081-00136 | Para heparinización |
| Conjunto de tubo de aspiración | Drummond | 2-040-000 | Para extracción de sangre |
| Dispensador de bombillas | Drummond | 1-000-9000 | Para extracción |
| de sangre 2-fenoxietanol | Wako Pure Chemical Industries | 163-12075 | Para anestesiar al pez |
| DRI-CHEM3500V | Fujifilm-Para | medición de la hemoglobina | |
| DRI-CHEM Slides Fujifilm | Hb-WII | Para la medición de la hemoglobina | |
| Glutest Neo Super | Sanwa Kagaku Kenkyusho-Para | la medición | de |
| Wako L-type TG kit | Wako Pure Chemical Industries | 464-44201 | para TG medición |
| Wako tipo L kit CHO Wako | Pure Chemical Industries | 460-44301 | Para la medición del colesterol total |
| Parafilm M | Alcan Packaging | PM996 | Para expulsar la sangre en |
Referencias
- Lieschke, G., Currie, P. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Penberthy, W. T., Shafizadeh, E., Lin, S. The zebrafish as a model for human disease. Front Biosci. 7, d1439-d1453 (2002).
- Stachura, D. L., Traver, D.
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Reimpresiones y permisos
