Repetida extracción de sangre para pruebas de sangre en adultos de pez cebra

Resumen

La toma repetida de muestras de sangre es necesaria e importante en la investigación con animales. Desarrollamos un método novedoso, no letal y fiable para la recolección repetida de sangre de pez cebra adulto, y aplicamos este método al estudio de la bioquímica sanguínea, incluido el metabolismo de la glucosa.

Resumen

Recogida de sangre repetida es una de las técnicas más comunes que se realizan en animales de laboratorio. Sin embargo, no se ha establecido un protocolo no letal para la recogida de sangre de pez cebra. Los métodos anteriores para la recogida de sangre de pez cebra son letales, como la incisión lateral, la decapitación y la ablación de la cola. Por lo tanto, hemos desarrollado un nuevo método de extracción de sangre "repetida", y presentar aquí un protocolo detallado que describa este procedimiento. Este método es mínimamente invasiva y se traduce en una tasa de mortalidad muy baja (2,3%) para el pez cebra, lo que permite tomar muestras de sangre repetidas del mismo individuo. El volumen máximo de muestreo de sangre es dependiente sobre el peso corporal de los peces. El volumen para el muestreo de sangre repetida a intervalos debe ser ≤0.4% del peso corporal cada semana o ≤1% cada 2 semanas, que fueron evaluados mediante mediciones de la hemoglobina de la sangre. Además, la hemoglobina, glucemia en ayunas, triglicéridos en plasma (TG) yc totalesSe midieron los niveles holesterol en el pez cebra adultos masculinos y femeninos. También se aplica este método para investigar la desregulación del metabolismo de glucosa en la obesidad inducida por la dieta. Este método de extracción de sangre permitirá a muchas aplicaciones, incluyendo la glucosa y el metabolismo de los lípidos y los estudios hematológicos, lo que aumentará el uso de pez cebra como modelo de enfermedad organismo humano.

Introducción

El pez cebra están ganando cada vez mayor popularidad como un modelo valioso de enfermedades humanas debido a que sus órganos y la genética son similares a los de los humanos ^1,2. En el campo de la biología del desarrollo, muchos estudios han demostrado que el pez cebra y el espectáculo humano marcados similitud en la hematopoyesis ^3, hemostasia ^4,5, y mielopoyesis ^6. Pez cebra adulto también se utilizan para el estudio inmunológico ^{7, 8} y las enfermedades neurodegenerativas relacionadas con la obesidad ⁹ porque este organismo modelo comparte vías comunes con los perturbado en enfermedades humanas. Para la obesidad y las enfermedades relacionadas con la obesidad (diabetes, esteatosis hepática y la esteatohepatitis no alcohólica y aterosclerosis), la glucosa en sangre y los niveles de lípidos del pez cebra se han investigado a fondo en varios modelos de obesidad transgénicos y inducidos por la dieta ^10-13.

Muestreo de sangre repetida de animales individuales reducirá el uso de animales y diciembreRease diferencias interindividuales. Sin embargo, la recogida de muestras repetida es técnicamente difícil en animales pequeños, tales como el pez cebra debido a su relativamente pequeño volumen de sangre y la falta de vasos de fácil acceso. Varios métodos para la recogida de sangre de una sola vez de pez cebra se han desarrollado, aunque estos métodos tienen sus propios inconvenientes, incluyendo letalidad, daño tisular asociado y el volumen sanguíneo limitado. Por ejemplo, 1-5 de sangre l puede ser cosechado a partir de una incisión lateral de aproximadamente 0,3 cm de longitud en la región de la aorta dorsal ^5. Decapitación con tijeras de corte a través de la cintura escapular puede cobrar 5-10 l de sangre ^10. Otro método de muestreo de sangre conveniente es la ablación de la cola ^14. Punción cardiaca es una potencial método alternativo para la recogida de sangre repetida de un mismo pescado, pero la cantidad muy pequeña obtenido (aproximadamente 50 nl) con este procedimiento limita el número de análisis que pueden ser PERFORmed ^11. En consecuencia, se necesita un nuevo protocolo para permitir repetido muestreo de sangre no letal, que sería un avance crítica necesaria para este organismo para ser un organismo modelo estándar para enfermedades humanas. Esta técnica permitiría para el ensayo de respuesta farmacológica, el descubrimiento de biomarcadores moleculares para el diagnóstico, determinación del pronóstico y el seguimiento de diversas enfermedades, tales como enfermedades metabólicas, enfermedades degenerativas y varios tipos de tumores malignos.

Por lo tanto, hemos desarrollado un método mínimamente invasivo para la obtención de sangre de pez cebra en serie ^15. Aquí se demuestra el procedimiento visual y proporcionar un protocolo detallado para esta técnica. Usando este método, se evaluó el valor normal basado en diversos parámetros, incluyendo la hemoglobina, glucemia en ayunas y lípidos en la sangre de pez cebra adultos sanos. Además, también se evaluó si este método es adecuado para estudios que requieren muestras seriadas de mONITOREO los cambios temporales en los niveles de glucosa en la sangre durante los experimentos de sobrealimentación.

Protocolo

Todos los animales procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad de Mie, y se realizaron de acuerdo a la regulación del bienestar animal japonesa "Ley para el Bienestar y la Gestión de los Animales '(Ministerio de Medio Ambiente de Japón) y cumplen con las directrices internacionales.

1. Preparación de la Aguja

NOTA: Todos los experimentos se realizaron bajo anestesia, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. Para la eutanasia, los peces se sumergieron en un baño de agua con hielo (5 partes de hielo / 1 parte de agua a ≤4 ° C) durante ≥20 min.

1. Preparar las agujas microcapilares vidrio tirando de un capilar de vidrio 1,0 mm de diámetro externo con un extractor de aguja (Figura 1A).
2. Cortar las puntas de las agujas de forma oblicua con unas tijeras finas (Figura 1B). El diámetro ideales punta debe ser de aproximadamente 100 a 200 micras (Figura 1C). Si el diamete puntar es demasiado estrecho, la sangre no va a entrar en la aguja.
3. Disolver la heparina en solución salina a una concentración de 5 mg / ml.
4. Coloque una aguja de precorte en el extremo revólver de un conjunto de tubo aspirador y mantenga la boquilla en la boca, o conecte la aguja a un dispensador bombilla. Sumerja la punta de la aguja en la solución de heparina y heparinizar la aguja de aspiración y sopla a través de la solución (Figura 1D y 1E).
   Nota: El conjunto de tubo aspirador se ha utilizado para la crioconservación de esperma de pez cebra ^16. Tubo de goma largo puede detener cualquier sangre volando en la boca. Configuración de un filtro en la mitad de camino del tubo puede evitar los peligros.
5. Almacenar las agujas heparinizados en un plato de Petri de 10 cm y secar al aire durante al menos 1 hr. Un gran número de agujas se puede preparar con antelación.

2. Anestesia

1. Preparar la solución anestésica en una pequeña caja de plástico mediante la mezcla de 200 ml de agua de pescado con 100 l de 2-fenoxietanol (2-EDUCACIÓN FÍSICA). La concentración final de los anestésicos es de 500 ppm.
   ¡CUIDADO! 2-PE tiene un efecto rápido.
2. Retire número deseado de pescado (cepa AB) desde el sistema de circulación.
3. Utilice una red para transferir el pescado en los anestésicos por 1 - 2 min (Figura 1F). Observar a los peces nadar gradualmente, difundir las aletas pectorales horizontalmente, jadeo, y tienen movimientos opérculo rápidos dentro de 1 min.
4. A medida que el tiempo pasa, observar los peces yacía en el fondo de la caja y, finalmente, dejar de nadar. El plano quirúrgico de anestesia alcanzará cuando los peces se detiene a jadear y los movimientos opérculo son lentos. En este punto, el pescado está listo para recogida de sangre.
5. El uso de un skimmer levantar el pescado anestesiado de la 2-PE y suavemente colóquela sobre una toalla de papel empapada con los anestésicos (Figura 1G). Cubra la cabeza del pescado con papel tisú suave también empapado con solución 2-PE para evitar la sequedad de los ojos y usar otro pañuelo de papel suave y seco para suavementesecar la superficie del cuerpo.

3. Blood Collection

1. Coloque una aguja heparinizada al final revólver del conjunto del tubo de aspiración (o el dispensador bombilla) y mantenga el extremo de la boquilla del conjunto del tubo de aspiración en la boca.
2. Sujete el extremo boquilla y la aguja juntos, y retirar con cuidado las escalas que interfieren con la punta de la aguja. Inserte la aguja en un 30 - ángulo ° 45 en el sitio de la extracción de sangre. Evitar la punción del tracto gastrointestinal (Figura 1H). En caso de utilizar dispensador de bulbo, presione la bombilla con el pulgar y el dedo medio, y bloquear el agujero en la punta de la bombilla con el dedo índice, a continuación, inserte la aguja como se describe anteriormente.
   Nota: El sitio para la recogida de sangre es lo largo del eje del cuerpo y posterior al ano en la región de la aorta dorsal. La aorta dorsal (DA) y la vena cardinal posterior (PCV) son sólo ventral de la columna vertebral (Figura 2).
3. Comience a chupar lala boquilla extremo del conjunto de tubo de aspiración cuando se siente la aguja tocando la columna vertebral. Si la sangre no se eleva, mover la punta de la aguja de manera sutil con la mano para estimular el flujo de sangre. Tenga en cuenta que una vez que la sangre se está levantando en la aguja, para inmediatamente sacudidas y chupar suavemente (Figura 1I). En caso de utilizar dispensador de bulbo, liberar la presión de la bombilla para aspirar la sangre.
4. Observe la sangre se elevará lentamente en la aguja de una manera pulsátil sin aspiración, que es probablemente debido a la presión de la sangre arterial. Por lo tanto, no es necesario para aspirar si la aguja penetra correctamente la arteria.
5. Deja de succión después se recoge el volumen apropiado de la sangre. Retire la aguja de los peces y pulse el sitio de punción usando un pañuelo de papel suave para detener cualquier sangrado. Observar la parada de sangrado después de aproximadamente 10 a 20 segundos de la presión de los dedos (Figura 1J).
6. Después de que se detenga el sangrado, transferir inmediatamente el pescado de nuevo a un CLEuna de agua caliente (~ 28 ° C) tanque. Ayudar a los peces para recuperar girando suavemente agua hacia las branquias hasta que empiece a nadar.
   Nota: Mantenga hasta 5 postmuestreo peces en un tanque de 2 L y conectar el tanque para el sistema de circulación para oxigenar el pescado. La adición de antibióticos para el agua de pescado no es necesario. Mantener el pescado con una vivienda normal y la alimentación.
7. Expulsar a la sangre de la aguja en un área limpia de un trozo de parafina (Figura 1C).
8. Medir la glucosa en sangre usando cualquier glucómetro comercial de mano (Figura 1L).
   Nota: El glucómetro utiliza una adenina dinucleótido electrodo de deshidrogenasa de glucosa-flavina y requiere un volumen de muestra de 0,6 l.
   1. Inserte una tira reactiva por completo en el metro y tocar directamente la gota de sangre. Observe la extracción de sangre en la tira reactiva automáticamente y obtener la glucosa en la sangre número 5 seg en el área de visualización. Registre el resultado y deseche la tira reactiva. Usar unanueva tira de prueba para cada medición.
9. (etapa opcional) Tomar cantidades precisas de sangre por un pipeteo y la transferencia de la sangre a un tubo de microcentrífuga para análisis posteriores (hemoglobina, triglicéridos (TG), colesterol total, etc.). Si es necesario, diluir la sangre entera de un pez con solución salina. Centrifugar las muestras de sangre durante 3 minutos a 680 xg a TA y cosechar el plasma. Transferir el plasma en un nuevo tubo. En este punto, está listo para ser utilizado en los análisis bioquímicos.

Resultados

Este método de extracción de sangre causa daño mínimo para el pez cebra (a <1 mm de punción; Figura 1J) y produce una tasa de mortalidad muy baja de 2,3%. Examinamos el máximo volumen de sangre que podría ser recolectada a partir de un solo pez y se evaluó la relación a su peso corporal (Figura 3). Se encontró que el volumen máximo de sangre recogida se correlaciona linealmente con el peso corporal (R = 0,813). El mayor volumen de sangre recogida de un pez individual (peso corporal =...

Discusión

Presentamos aquí un protocolo detallado para la obtención seriada sangre de pez cebra adulto. Este método es sencillo de llevar a cabo y la usamos en el laboratorio en una base diaria. Este método de extracción de sangre se basa en la inserción de una aguja capilar de vidrio en aorta dorsal del pez cebra. Durante este procedimiento, es crítico que tener cuidado para no realizar la ablación de la columna vertebral debido a que es el criterio para la búsqueda de la aorta dorsal. La reducción de la lesión de la columna va ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Capilares de vidrio con filamento	Narishige	GD-1 de	1,0 mm de diámetro exterior.
Extractor de agujas	Narishige	PC-10	Para producir las agujas
Heparina	Wako Pure Chemical Industries	081-00136	Para heparinización
Conjunto de tubo de aspiración	Drummond	2-040-000	Para extracción de sangre
Dispensador de bombillas	Drummond	1-000-9000	Para extracción
de sangre 2-fenoxietanol	Wako Pure Chemical Industries	163-12075	Para anestesiar al pez
DRI-CHEM3500V	Fujifilm-Para		medición de la hemoglobina
DRI-CHEM Slides Fujifilm		Hb-WII	Para la medición de la hemoglobina
Glutest Neo Super	Sanwa Kagaku Kenkyusho-Para	la medición	de
Wako L-type TG kit	Wako Pure Chemical Industries	464-44201	para TG medición
Wako tipo L kit CHO Wako	Pure Chemical Industries	460-44301	Para la medición del colesterol total
Parafilm M	Alcan Packaging	PM996	Para expulsar la sangre en

la glucosa