Artículo de método

Campo geomagnético (Gmf) y evolución de las plantas: La investigación de los efectos de Gmf Reversión en

14.6K vistas

⸱

DOI:

10.3791/53286

⸱

30 de noviembre de 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences and Systems Biology, University of Turin, 2Radcliffe Department of Medicine, University of Oxford, John Radcliffe Hospital

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un método para probar la hipótesis de que la inversión del campo geomagnético efectivo (GMF) induce la expresión génica diferencial y altera la morfología de Arabidopsis thaliana. Se utilizó un sistema octogonal triaxial de pares de bobinas de Helmholtz para generar artificialmente condiciones de GMF invertidas en la cámara de crecimiento de la planta.

Resumen

Una de las observaciones más estimulantes en evolución de las plantas es una correlación entre la ocurrencia del campo geomagnético (GMF) reversiones (o excursiones) y el momento de la radiación de las angiospermas. Esto condujo a la hipótesis de que las alteraciones en GMF polaridad pueden desempeñar un papel en la evolución de las plantas. Aquí se describe un método para poner a prueba esta hipótesis mediante la exposición de Arabidopsis thaliana que invierte artificialmente condiciones GMF. Se utilizó un magnetómetro de tres ejes y los datos obtenidos se utilizaron para calcular la magnitud del GMF. Tres fuentes de alimentación de CC se conectan a tres pares de bobinas de Helmholtz y eran controlados por una computadora para alterar las condiciones GMF. Las plantas cultivadas en placas de Petri fueron expuestos a tanto normales como invierten condiciones GMF. También se realizaron experimentos de exposición simulada. Plantas expuestas fueron fotografiados durante el experimento y las imágenes fueron analizadas para calcular la longitud de la raíz y las áreas de las hojas. ARN total fue extraído de Arabidopsis y cuantitativaTime-PCR real (qPCR) se realizaron análisis de la expresión génica de cruciferina 3 (CRU3), protein1 transporte de cobre (COTP1), Redox Responsive Transcripción factor1 (RRTF1), Fe superóxido dismutasa 1, (FSD1), Catalase3 (CAT3), tilacoidales ascorbato peroxidasa (TapX), un ascorbato citosólica Peroxidase1 (APX1), y NADPH / respiratoria proteína estallido oxidasa D (RbohD). Se analizaron cuatro genes de referencia diferentes para normalizar los resultados de la qPCR. El mejor de los cuatro genes fue seleccionado y se utilizó el gen más estable para la normalización. Nuestros datos muestran por primera vez que invirtiendo la polaridad GMF utilizando bobinas triaxiales tiene efectos significativos en el crecimiento de plantas y la expresión génica. Esto apoya la hipótesis de que GMF reversión contribuye a inducir cambios en el desarrollo de plantas que podrían justificar una mayor presión selectiva, llevando eventualmente a pevolución lant.

Introducción

El campo magnético de la Tierra (o equivalentemente el campo geomagnético, GMF) es un factor ambiental ineludible para todos los organismos vivos en el planeta, incluyendo las plantas. El GMF siempre ha sido una característica natural de la Tierra, por lo que durante la evolución, todos los organismos vivos experimentado su acción. Un creciente cuerpo de evidencia muestra que el GMF es capaz de influir en muchos procesos biológicos 1. El GMF no es uniforme y hay diferencias locales significativos en su magnitud y dirección en la superficie de la Tierra. El GMF en la superficie de la Tierra muestra una amplia gama de magnitudes, que van desde menos de 30 mT a casi 70 mT. El GMF protege a la Tierra y su biosfera de los efectos letales de viento solar al desviar la mayor parte de sus partículas cargadas a través de la magnetosfera 2.

Las plantas responden a los estímulos del medio ambiente; y las respuestas clásicas a factores abióticos como la luz y la gravedad han sido thoroughly descrito mediante la definición de las denominadas respuestas fototrópicos y gravitrópica. Muy poco, o nada, que se conoce sobre los mecanismos de la percepción y las respuestas de las plantas a los campos magnéticos, a pesar de la gran cantidad de trabajos publicados sobre este tema y recientemente revisados ​​1. A diferencia del campo gravitatorio, el GMF cambió consistentemente durante la evolución planta que representa por lo tanto un importante factor estrés abiótico que ha sido considerado recientemente una fuerza impulsora potencial con el tiempo que contribuye a plantar la diversificación y la especiación 2. Reversiones geomagnéticas (o excursiones) son los cambios en la polaridad de la GMF. Durante la historia de vida de la Tierra, las reversiones GMF ocurrieron varias veces. Estos expuestos al planeta a periodos de menor resistencia GMF durante cada transición de polaridad. Algunos autores han planteado la hipótesis de que estas transiciones períodos de baja resistencia GMF podrían haber permitido a las radiaciones ionizantes del viento solar para llegar a la superficie de la Tierra, lo que induce unatensión constante a los organismos vivos, lo que podría haber sido lo suficientemente fuerte como para inducir alteraciones genéticas que finalmente llevan a plantar evolución 2.

Un análisis detallado de los experimentos que describen los efectos de los campos magnéticos sobre las plantas muestran un gran número de informes contradictorios, que se caracteriza por la escasez de mecanismos plausibles interacción biofísicos. Muchos experimentos son simplemente poco realista, mientras que otros carecen de una hipótesis comprobable y, en definitiva, no son convincentes 3. En los últimos años, el progreso y el estado de la investigación sobre el efecto de los campos magnéticos en la planta se ha revisado 2,4-11. Recientemente, el efecto del campo magnético de baja y alta se ha discutido a fondo 1, con un enfoque particular en la participación de eventos de reversión GMF en evolución de las plantas 2.

Los medios más directos para fundamentar la hipótesis de que las inversiones de GMF afectan evolución de las plantas es sintetizar un GMFreversión en el laboratorio mediante pruebas de la respuesta de las plantas a las condiciones normales de campo magnético y invertidos. Para probar la hipótesis, por lo tanto, construimos una bobina de Helmholtz-pares campo magnético sistema octogonal triaxial compensación (bobinas triaxiales), que es capaz de revertir con precisión las condiciones normales GMF.

Se utilizó Arabidopsis thaliana como planta modelo y probamos el efecto de revertido GMF sobre la expresión génica de algunos genes importantes: cruciferina 3 (CRU3), que codifica una proteína de almacenamiento 12S semilla que es tirosina fosforilada y su estado de fosforilación se modula en respuesta a ABA en semillas de Arabidopsis thaliana 12,13; Transporte protein1 de cobre (COTP1), que codifica una proteína de la superfamilia de transporte de metales pesados ​​/ desintoxicación con la función predominante en la adquisición de Cu suelo y el desarrollo del polen 14; y Redox Responsive Transcripción factor1 (RRTF1),que codifica un miembro de la ERF (factor de respuesta de etileno) subfamilia B-3 de la familia del factor de transcripción ERF / AP2 que contiene un dominio AP2 que facilitan la co-activación sinérgica de las vías de la expresión génica y confiere tolerancia cruzada a abiótico y biótico subraya 15.

Por otra parte también se analizó cinco genes implicados en las respuestas de estrés oxidativo: Fe superóxido Dismutase1, (FSD1), que codifica una enzima citoplasmática que enzimáticamente y rápidamente convierte el anión superóxido (O 2 -) y agua (H 2 O) a peróxido de hidrógeno (H 2 O 2) y oxígeno molecular (O2) 16; Catalase3 (CAT3), que codifica y que enzima que cataliza la descomposición de H 2 O 2 en agua y oxígeno 17,18; tilacoidales ascorbato peroxidasa (TapX), que codifica una peroxidasa tilacoide cloroplástica que neutraliza H2O2 19; ascorbato Peroxidase1 (APX1), que codifica una peroxidasa citosólica que neutraliza H 2 O 2 y representa uno de los posibles objetivos de las modificaciones post-traduccionales mediadas por moléculas derivadas-NO 20; y NADPH-oxidasa estallido respiratorio proteína D (RbohD) que codifica una enzima que genera O 2 - y juega un papel fundamental en la regulación del crecimiento, el desarrollo y las respuestas de estrés en Arabidopsis 21.

Nuestra metodología de campo-reversión proporciona la primera evidencia de que GMF reversión puede inducir un cambio significativo en la morfología y la expresión génica de A. raíces y brotes thaliana. Este protocolo proporciona una forma innovadora de evaluar el efecto de reversión en GMF morfología de la planta y la expresión génica y se puede utilizar para evaluar el efecto potencial de GMF reversión en otros aspectos del comportamiento de la planta, y de este modo guiar la discusión de la role de GMF reversión en la evolución de las plantas.

Protocolo

1. Ajuste del triaxial Bobinas

NOTA: La Figura 1 muestra las bobinas triaxiales utilizados para revertir la GMF.

  1. Encienda el magnetómetro de tres ejes, cuya sonda se inserta en las bobinas triaxiales.
  2. Encienda el ordenador e inicie el software magnetómetro que permite que los datos se recogen de magnetómetro de tres ejes.
  3. Usa los valores de los componentes reportados por el magnetómetro para calcular la magnitud de la GMF. Por ejemplo, con valores magnetómetro: Bx = 6,39 mT, By = 36,08 mT, Bz = 20,40 mT calcular la intensidad de campo de 41.94 mT utilizando la siguiente ecuación: B = B GMF + B adicional, donde B adicional = (Bx 2 + Por 2 + Bz 2) ½ (es decir, el 41,9 mT en el ejemplo.)
  4. Encienda las tres fuentes de alimentación de corriente continua (doble rango: 0-8V / 5A y 0-20V / 2.5A, 50W), cada uno conectado a tres couples de bobinas de Helmholtz y conectado a un ordenador a través de una conexión GPIB (Figura 1B).
  5. Set tensiones de las fuentes de alimentación para generar el campo magnético deseado con un vector de campo magnético invertido. Por ejemplo, con B GMF como en el paso 1.3 y con el tamaño de la bobina de la instrumentación se describe aquí, establecer los voltajes a V x = 0,00 V, V y = 30,52 V, V z = 0,00 V con el fin de generar una nueva resultante B = bobinas triaxiales B GMF + B = (6.38, -36.08, 20.39) mT. es decir, un nuevo campo con la misma magnitud que B GMF, pero que apunta a una dirección diferente.
  6. Verificar el nuevo campo con el software magnetómetro utilizando el procedimiento descrito en 1.3.
  7. Exponer a las plantas normales y revertido condiciones GMF utilizando placas de Petri como se describe en la sección 2.
  8. Realizar experimentos de exposición simulada manteniendo la magnitud del campo igual a | B GMF | y mantenimientola componente vertical del campo igual a la de la GMF, pero la alteración de la dirección (es decir, "Norte, Este u Oeste") de la componente horizontal del campo con corrientes iguales en las bobinas triaxiales en comparación con la condición de inversión de campo. Para ello, mediante la alteración de la tensión de las bobinas como se describe en 1.5.
    Nota: Esta exposición simulada descarta potencial de calentamiento sutil o efectos vibracionales de cualquiera de las bobinas de ellos mismos o de los componentes electrónicos utilizados para controlar las bobinas.
  9. Ejecutar experimentos de doble ciego mediante la aplicación de condiciones de campo a partir de los ciegos el personal que realiza el resto de los experimentos y / o interpretar los datos.

2. Preparación de los materiales y condiciones para el crecimiento de la planta de la planta

  1. Utilice semillas de Arabidopsis thaliana, ecotipo Columbia 0 (0 Col), a continuación, colocar en un tubo de 1,5 ml y la superficie esterilizar mediante tratamiento con un 5% (w / v) Solución de hipoclorito de calcio y 0,02% (v / v) de Triton X-100% de etanol en 80 (EtOH), 10-12 min a 25-28ºC, con agitación continua. Luego enjuague dos veces con 80% de EtOH, se lava con EtOH al 100% y finalmente enjuagar con agua destilada estéril.
  2. Preparar 1 l de Murashige y Skoog 22 (MS) modificado mediante la adición: 2.297 g de MS (0,5 x MS basal Sal Mezcla), 10 g de sacarosa, agua desionizada hasta 1 litro, pH 5,8 a 6,0 ajustado con KOH. Añadir 16 g de agar y autoclave durante 20 minutos, 120 ° C.
  3. Antes de la solidificación, verter 80 ml ​​de medio en cada uno (120 x 120 mm 2) cuadrados placas de Petri. Siembre treinta semillas estériles en la placa, y luego sellar placas con una película de cera.
  4. Vernalize las placas horizontalmente en la oscuridad a 4 ° C durante 2 días para potenciar y sincronizar la germinación, y luego exponer las placas de Petri ya sea normal o invertido GMF.
  5. Expose semillas en un entorno de clima controlado a 22 ° C en una posición vertical en experimentos paralelos tanto en el interior de las bobinas triaxiales y fuera de las bobinas triaxialesbajo un horario fotoperíodo de 8 horas oscuridad y 16 horas de luz, con lámparas de vapor de sodio (220 x 10 -6 E m -2 s -1). Utilice una película de gelatina azul para el centro de atención para reducir el componente rojo de las lámparas.
  6. Exponer las plantas durante 10 días antes de la extracción de ARN tanto normal (control) y la inversión (tratamiento) condiciones GMF.
  7. Después de la exposición, tomar fotos de placas de Petri.
  8. Utilice el software ImageJ para calcular áreas de la longitud de la raíz y las hojas.
    1. En pocas palabras, medir el lado de la placa de Petri, a continuación, abra la imagen de la placa de Petri y mediante el uso de la opción de línea "recta" para dibujar una línea que cruza exactamente el lado de la placa.
    2. En el menú de "analizar", seleccione "escala set" e inserte la distancia real en el cuadro "distancia conocida" (por ejemplo, 120 mm), a continuación, inserte la unidad de longitud (mm); por último, en la opción "global" para realizar los ajustes disponibles para todas las mediciones.
    3. Para root longitud, siga cuidadosamente la forma de la raíz con la función manos libres. Medir la longitud mediante la opción "medida" en el menú "analizar". Continuar para medir todas las raíces en la imagen y guardar el archivo para otros análisis estadísticos.
    4. Para el área foliar, en el menú "imagen" utilice la opción y luego "umbral de color" ajustar. Seleccione la hoja individual y en el menú "analizar", seleccione "analizar partículas". Guarde las mediciones individuales para los análisis estadísticos.

3. Extracción de ARN total de Arabidopsis, Cuantitativa en Tiempo Real-PCR (qPCR) condiciones de reacción y cebadores para Arabidopsis

  1. Recoger por separado 30 brotes y 30 raíces y congelar inmediatamente en nitrógeno líquido. Luego moler en nitrógeno líquido con mortero.
  2. Aislar ARN total utilizando un kit de purificación y kit de tratamiento RNasa libre de DNasa usando Productoresinstrucciones del er.
  3. Comprobar la calidad y cantidad de la muestra mediante el uso de un kit de electroforesis de ARN nano y gel capilar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Confirme la cuantificación de RNA por espectrofotometría.
  4. Utilice 2 g de ARN total y cebadores aleatorios utilizando un kit de transcripción reversa cDNA para obtener primeras cadenas de cDNA de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
  5. Realizar todos los experimentos en un tiempo real del sistema utilizando SYBR verde I con ROX como un estándar de carga interna.
  6. Realizar la reacción con 25 l de mezcla consistente en 12,5 l de 2x SYBR Green qPCR Master Mix, 0,5 l de cDNA y 100 nM primers. Usa los cebadores listados en la Tabla 1. Incluir en los controles controles no-RT (usando ARN total y sin transcripción inversa para supervisar la contaminación de ADN genómico) y controles sin plantilla (agua en lugar de la plantilla).
  7. Calcular la eficiencia de imprimación para todos los pares de cebadores utilizando el estándarmétodo de la curva 23.
  8. Utilice las siguientes condiciones de PCR: CRU3, COTP1, RRTF1. 10 min a 95 ° C, 40 ciclos de 15 s a 95 ° C, 30 segundos a 58 ° C y 30 segundos a 72 ° C; UBP6, eEF1Balpha2, ACT1, GAPC2, CAT3, TapX, APX1, RbohD, FeSOD1 10 min a 95 ° C, 40 ciclos de 15 s a 95 ° C, 20 segundos a 57 ° C y 30 segundos a 72 ° C.
  9. Leer fluorescencia después de cada fase de recocido y la extensión. Para todas las corridas, realizar un análisis de curva de fusión a partir de 55 a 95 ° C mediante la inclusión del segmento de disociación en el perfil térmico. Utilice la pantalla curva de disociación, se accede a través de la pestaña de resultados para ver el perfil de disociación (parcela de la fluorescencia en función de la temperatura). Asegúrese de que se selecciona el conjunto de datos recogidos durante el segmento de la disociación del experimento para el análisis utilizando la pantalla Análisis / Configuración.
  10. Determinar el linear rango de la concentración de plantilla a valor de ciclo umbral (Ct valor) mediante la realización de una serie de dilución de diez veces (de 1 a 10 3 -fold) usando cDNA a partir de tres extracciones de ARN independientes analizadas en tres repeticiones técnica 24,25.
  11. Analizar todas las parcelas de amplificación con el Real-Time PCR software del instrumento para obtener los valores de Ct. Calibrar y normalizar los niveles de ARN en relación con el nivel de los mejores genes de limpieza de la siguiente manera: 3.11.1) accede a la pantalla de amplificación parcelas a través de la ficha Resultados, seleccione la rampa o meseta para las que los datos deben ser analizados mediante la pantalla / Configuración de Análisis de Selección, y luego seleccione el DRN (fluorescencia normalizada de referencia corregido) en el menú de la fluorescencia en el panel de comandos. Acceda a la placa de pantalla Valores de ejemplo a través de la pestaña Resultados para mostrar los valores de Ct de los pozos muestreados.
  12. Utilice cuatro genes de referencia diferentes [por ejemplo, citoplásmica deshidrogenasa gliceraldehído-3-fosfato, (GAPC2), specif ubiquitinaic proteasa 6 (UBP6), actina 1 (ACT1) y el factor de elongación 1B subunidad alfa 2 (eEF1Balpha2)] para normalizar los resultados de la PCR en tiempo real. Seleccione el mejor clasificado de genes usando un software de análisis de 26; y utilizar el gen más estable para la normalización.
    1. En pocas palabras, organizar los datos de entrada en una hoja Excel con la primera columna que contiene los nombres de genes y primera fila que contienen los nombres de las muestras. A continuación, seleccione el software de análisis de la barra de menú. Utilice el cuadro de diálogo para seleccionar los datos de entrada.
    2. A continuación, compruebe los campos nombres de ejemplo, los nombres de genes y de salida sencilla solamente. Haga clic en el botón Go para realizar el análisis. Seleccione el gen mejor clasificado (que tiene el valor más pequeño de estabilidad) como gen candidato más establemente expresada.
  13. Datos de trazado, mostrando el cambio de la expresión diferencial de pliegue en ambos brotes y raíces.

4. Análisis estadísticos

  1. Expresar los datos como valores medios ± error estándar. Comparación de la control y los grupos de tratamiento mediante la realización de análisis de la varianza (ANOVA) y la prueba de Tukey con Bonferroni y Dunn-Sidak prueba de probabilidad ajustada (0,95% de confianza).

Resultados

El objetivo de este protocolo es proporcionar un método para evaluar si la inversión del campo geomagnético (GMF) puede afectar el desarrollo de la planta y la expresión de genes de Arabidopsis thaliana ecotipo Col 0. bobinas triaxiales como se muestra en la Figura 1A se utilizan para revertir la GMF en conjunto con las tensiones de accionamiento adecuados (Figura 1B), obtenida como se describe en el paso 1.5 en el protocolo. Las dimensiones de las bobinas triaxiales son ~ 2 x 2 x 2 m 3, lo que permitió un espacio suficiente con condiciones GMF invertidas para acoger varias placas de Petri. Los controles se cultivaron en las mismas condiciones ambientales y a valores normales GMF. Después de 10 días de exposición a la normalidad y revertido condiciones GMF, el fenotipo de las plantas mostraron alteraciones morfológicas evidentes. Como se muestra en la Figura 2, las plantas de control (es decir, cultivadas en condiciones normales GMF) mostraron longitudes de raíz con Prob significativamente (Dunn-Sidak y Bonferroni Ajustado <0,001;T de Student = 10,68, df = 31) valores más altos (29,41 mm; SEM = 1,04; N = 32) con respecto a las plantas expuestas a invertido GMF (17,53 mm; SEM = 0,58; N = 36). En las plantas invertidas-GMF, la morfología de los brotes también fue alterada por mostrando una reducción del desarrollo de la expansión del prospecto. Las plantas expuestas a condiciones normales mostraron una superficie media de la hoja de 4,95 mm 2 (SEM 0.025, N = 54), mientras que las plantas expuestas a condiciones GMF invertidos mostraron significativamente (Dunn-Sidak y Bonferroni ajustado prob = <0,001; t de Student = 31,32, df = 53) los valores más bajos de la hoja de área (3,71 mm 2; SEM = 0,032, n = 54). Por lo tanto, la exposición de Arabidopsis a condiciones GMF invertidos indujo una reducción en longitud de la raíz y el área foliar.

Expansión de las hojas y el crecimiento de la raíz son depende tanto de la división y el alargamiento de las células 27. Por lo tanto, el desarrollo de la planta, la productividad y el estado físico general dependen de un DISPARO y sistema radicular arquitectura óptima 28. La longitud de la raíz y la hoja de tamaño reducido de las plantas expuestas a condiciones GMF invertidos indican la presencia de un sistema de detección capaz no sólo de percibir las variaciones en la intensidad del campo magnético, sino también para responder a los cambios en el campo "dirección" magnética en comparación con la gravedad. La hipótesis de que GMF reversión puede afectar el crecimiento de plantas encuentra evidencia convincente en nuestros experimentos, que demuestran que las condiciones de reversión GMF pueden afectar de manera significativa el desarrollo de la planta.

Los cambios morfológicos también fueron acompañados por cambios en la expresión génica. Entre los genes de limpieza, el gen más estable fue el factor de elongación 1B subunidad alfa 2. El primer grupo de genes (CRU3, COTP1, RRTF1) mostró una alteración drástica en la expresión de genes (Figura 3). Shoot expresión de los tres genes se incrementó significativamente (P <0.05) en aproximadamente 2,5 veces mayor en las plantas expuestas a la reservad condiciones GMF. Expresión Raíz de CRU3 se upregulated en las raíces de las plantas expuestas a condiciones normales GMF, pero fue significativamente (P <0,05) downregulated en condiciones GMF invertidos. Lo opuesto se encontró para COTP1 y RRTF1, que fueron downregulated en condiciones normales y upregulated en la presencia de GMF reversión (Figura 3).

Cruciferina (una globulina 12 S) es la proteína más abundante de almacenamiento en las semillas de A. thaliana y otras crucíferas y se sintetiza como un precursor en el retículo endoplásmico rugoso. A continuación, se transporta a las vacuolas de almacenamiento de proteínas 13. Planta de semillero de germinación requiere la ruptura de cruciferina, que se utiliza como fuente inicial de nitrógeno. Down-regulación de cruciferina degradación reduce el desarrollo de los embriones al dañar las estructuras celulares o componentes celulares de desarrollo 29,30. Nuestros resultados muestran que la regulación positiva de CRU3 se correlaciona conuna expansión inferior de las hojas y una longitud reducida de la raíz, lo que indica que este gen en sensibles a GMF reversión y que su sobreexpresión puede contribuir a la reducción del desarrollo de la planta. Por otra parte, GMF reversión induce una regulación a la baja significativa de CRU3 en las raíces, que se correlaciona con una longitud de la raíz reducida. El cobre es un cofactor esencial para procesos clave en las plantas, pero que ejerce efectos dañinos cuando están en exceso; por lo tanto, que sobreexpresa el transporte de cobre compromete el crecimiento vegetal. El efecto de GMF reversión fue una sobreexpresión significativa de COTP1 en ambos brotes y raíces, lo que explica el crecimiento vegetal reducida. Ion estrés afecta el metabolismo del cloroplasto, que está estrechamente vinculada con el estado redox de la célula. En Arabidopsis el factor de transcripción RRTF1 es importante para la expresión de genes asociados a la capacidad de adaptarse a los cambios redox 31. Por lo tanto, cuando las plantas están expuestas a los estímulos externos capaz de alterar su desarrollo fisiológico yprogramas de AL se espera que una sobreexpresión de este factor de transcripción importante. La inversión de la GMF indujo una sobreexpresión significativa de RRTF1 en ambos brotes y raíces, lo que indica las respuestas al estrés oxidativo más altos de las plantas a condiciones GMF invertidos.

Interés resultados se obtienen mediante el análisis de los cinco genes implicados en el estrés oxidativo. En general, todos los genes extraídos y analizados en los brotes no mostraron diferencias significativas (P> 0,05) cuando las plantas se cultivan en condiciones normales o invertidas GMF (Figura 4 y Figura 5). Sin embargo, una baja regulación significativa siempre se observó en las raíces de las plantas expuestas a condiciones GMF invertidos. En particular, CAT3 mostró la mayor regulación a la baja (Figura 5), seguido en orden de regulación a la baja por APX1, FSD1, RBOHD y TapX (Figura 4).

La tolerancia cruzada a unestrés biótico y biótico es proporcionada por la activación de diferentes genes implicados en varias vías bioquímicas. factor de transcripción RRTF1 facilita la co-activación sinérgica de la expresión génica de estas vías 15,31, y puede ser potencialmente implicados en el estrés oxidativo 32. Por lo tanto, se espera que cuando se reduce la eliminación de oxígeno regulación al alza de RRTF1. Regulación a la baja de las enzimas de barrido de la raíz se correlaciona con la regulación al alza de RRTF1, que actúa en respuesta a un aumento del estrés oxidativo. La regulación a la baja de la raíz dramática de CAT3, APX1 y TapX indica la disminución de la capacidad de células de la raíz para secuestrar H 2 O 2, que se acompaña por la reducida capacidad de dismutan el anión superóxido por regulación a la baja de FSD1. Las respuestas al estrés oxidativo es mayor en las raíces, que parecen ser el sitio principal de la percepción GMF invertido.

figure-results-1
Figura 1. Sistema de Compensación campo geomagnético. (A) bobinas triaxial (que comprenden un par de bobinas octogonales para cada uno de tres ejes perpendiculares) utilizados para invertir el vector del campo geomagnético. (B) Una fuente de alimentación controlado por ordenador se conecta a cada par de bobinas de Helmholtz. (Tensiones en estas cifras son arbitrarias) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2. Efectos de la inversión del campo geomagnético en Arabidopsis morfología. Después de diez días de exposición, las plantas de control (es decir, las personas expuestas a condiciones normales GMF) muestran una significativamente mayor longitud de la raíz y más expanfolletos ded en comparación con las plantas que fueron expuestos a condiciones GMF invertidos. Bar Métricas = 18 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-3
Figura 3. Efectos de la inversión del campo geomagnético en la expresión de genes de Arabidopsis. Después de diez días de la exposición, el ARN total de control y las plantas tratadas se extrajo y se analizó por PCR en tiempo real para el análisis de la expresión. El efecto de la inversión de la GMF era para inducir un cambio drástico en la expresión del gen de todos los genes que se probaron CRU3, Cruciferina 3;. COTP1, Copper Transporte protein1; RRTF1, Redox Responsive Transcripción factor1. Las barras indican el error estándar; asteriscos indica significativas (P <0,05) entre plhormigas expuestas a condiciones GMF invierte y normales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-4
Figura 4. Efectos de la inversión del campo geomagnético en Arabidopsis la expresión de genes relacionados con antioxidantes. Después de diez días de la exposición, el ARN total de control y las plantas tratadas se aísla y se empleó para el análisis de la expresión génica mediante PCR en tiempo real. El efecto de la inversión de la GMF era para inducir cambios significativos en la expresión génica rodaje; sin embargo, una regulación a la baja drástica se observó en la raíz de la expresión génica de las plantas cultivadas bajo condiciones GMF invertidos TapX, tilacoidales ascorbato peroxidasa;. APX1, ascorbato Peroxidase1; FSD1, Fe superóxido Dismutase1; RbohD, NA. DPH / respiratoria ráfaga oxidasa proteína D Las barras indican el error estándar; asteriscos indica significativas (P <0,05) las diferencias entre las plantas expuestas a condiciones GMF invertidas y normales. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-5
Figura 5. Efectos de la inversión del campo geomagnético en Arabidopsis catalasa 3 (CAT3) la expresión génica. Después de diez días de la exposición, el ARN total de control y las plantas tratadas se aísla y se empleó para el análisis de la expresión génica mediante PCR en tiempo real. El efecto de la inversión de la GMF era para inducir cambios significativos en la expresión génica rodaje; sin embargo, una regulación a la baja drástica se observó en la raíz de la expresión de genes de plantas que crecen bajo condiciones GMF invertidos. Las barras indican erro estándarr; asteriscos indica significativas (P <0,05) las diferencias entre las plantas expuestas a condiciones GMF invertidas y normales. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Recientemente hemos demostrado que existe una correlación sorprendente entre las inversiones GMF y el momento en que la desviación de la mayoría de los linajes familiares Angiospermas produjo 2. Sin embargo, a pesar de las hipótesis estimulantes y la gran cantidad de estudios sobre el efecto de variadas intensidades GMF, la suposición de que GMF reversión puede en sí inducir cambios significativos en la expresión de genes de plantas y morfología nunca se ha demostrado. Aquí nos muestran por primera vez, un método que utiliza una bobina de Helmholtz octogonal triaxial para revertir GMF en nuestro laboratorio, y que la inversión del campo magnético ambiental puede causar cambios fenotípicos y la modulación de la expresión génica en las plantas.

A fin de obtener GMF reversión (o modificación) en un volumen suficiente para los experimentos de crecimiento de las plantas (2 x 2 x 2 m 3), hemos construido un sistema de bobina de Helmholtz octogonal. Este sistema no está disponible comercialmente (bobinas de Helmholtz están generalmente en forma de anillo y más pequeño)y los costos para la construcción fueron considerables. Es importante destacar que este sistema ofrece la modificación del campo robusta, con el tiempo-estabilidad y homogeneidad excepcional en los campos magnéticos modificados.

El sistema está diseñado y construido para reducir el valor de la GMF a una milésima parte de las condiciones normales o revertir cualquiera de las tres dimensiones del campo magnético. Sin embargo, el diseño de las bobinas no permite generar una alta intensidad de campo magnético. Por lo tanto, este instrumento en la forma actual no es adecuado para los experimentos diseñados para evaluar el efecto de la alta intensidad del campo magnético en las plantas u otros organismos.

En el laboratorio, la alteración de la GMF similares a los descritos en este método se ha obtenido por diferentes métodos, incluyendo blindaje rodeando la zona experimental por placas metálicas ferromagnéticas con alta permeabilidad magnética, que se desvían los campos magnéticos y se concentran en el seno del propio metal. The ventaja de utilizar bobinas de Helmholtz es que el sistema permite que las plantas sean expuestos a condiciones más naturales (luz, de circulación de aire, etc.), por lo que es ideal no sólo para los estudios in vitro (como con el uso de placas de Petri), sino también en vivo crecimiento de las plantas y los experimentos de desarrollo. Las dimensiones de nuestro sistema de crear un espacio que permita la supresión de hasta <1 / 1.000 de la GMF natural a lo largo de 25 x 25 x 25 cm 3 volumen esférico (ver Figura 1 A), lo que permite acoger varias placas de Petri o algún pequeño ollas para el crecimiento vegetal.

El método que aquí se presenta se ha aplicado a estudios de biología vegetal; Sin embargo, el sistema permite una amplia gama de experimentación, incluyendo virología y microbiología, así como los estudios sobre los nematodos (por ejemplo, Caenorhabditis elegans), artrópodos y animales pequeños (incluyendo ratones y ratas). Por lo tanto, las pruebas de la hipótesis de que la inversión de la GMF es capazpara inducir cambios morfológicos y transcripcionales también podrían extenderse a muchos otros sistemas vivos, tal vez en última instancia, incluso a las células humanas.

El GMF está en constante cambio y fluctuante. Por lo tanto, en nuestros experimentos Un desafío importante es proporcionar una compensación constante de la GMF el fin de obtener los nuevos valores GMF deseados. Esto sólo se puede lograr mediante un control continuo de valores de los campos magnéticos a través de la lectura de los valores del magnetómetro y compensación de voltaje. Por lo tanto, el sistema puede compensar la parte que varía lentamente de la GMF pero no hace nada por las fluctuaciones de frecuencia más alta.

En conclusión, el uso de bobinas triaxiales para invertir el vector GMF fue fundamental para demostrar que esta inversión de la GMF vector es capaz de inducir cambios morfológicos de plantas y la expresión génica diferencial. Los resultados obtenidos con el método presentado proporcionan una evidencia convincente en apoyo de la hipótesis de que la re GMFversales podrían haber sido una de las fuerzas motrices de la evolución de plantas en escalas de tiempo geológicas 2.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por una beca al MEM del Departamento de Ciencias de la Vida y Biología de Sistemas de la Universidad de Turín, Italia. Los autores agradecen a G. Gnavi por la asistencia técnica durante algunos experimentos. El CTR está financiado por el Wellcome Trust y la Royal Society (subvención número 098436/Z/12/Z).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Magnetómetro de tresejes Bartington Magnetómetro de puerta de flujo triaxialMag-03MC Fuente de
alimentación del magnetómetroBartington  Mag-03PSUmagnetómetro de puerta de flujo triaxial
Software del magnetómetroBartington magnetómetro de flujo triaxialMag03DAM
 Agilent TechnologiesE3642A
Hipoclorito de calcio Sigma211389
Triton X-100 SigmaX100 
Etanol Sigma2860
GroLux Lámparas de vapor de sodio OSRAM Sylvania600W
RNeasy Kit de ARN de planta Qiagen74903
DNasa libre de ARNasa Qiagen79254
Agilent 2100 BioanalizadorAgilent TechnologiesG2938B
NanoDrop ND-1000 Thermo Fisher Scientificno disponible
Kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad Applied Biosystems4368813
Mx3000PAgilent Technologies401512
2x MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix Fermentas International, IncK0221
ParafilmSigmaP7793-1EA
Murashige y Skoog Medio BasalSigmaM5519 
Placa de Petri cuadrada (120 x120 mm2)SigmaZ692344 
Fuente de alimentación de CC del

Referencias

  1. Maffei, M. E. Magnetic field effects on plant growth, development, and evolution. Front. Plant Sci. 5, (2014).
  2. Occhipinti, A., De Santis, A., Maffei, M. E. Magnetoreception: an unavoidable step for plant evolution. Trends Plant Sci. 19 (1), 1-4 (2014).
  3. Harris, S. R., et al. Effect of magnetic fields on cryptochrome-dependent responses in Arabidopsis thaliana. J. Royal Soc. Interf. 6 (41), 1193-1205 (2009).
  4. Phirke, P. S., Kubde, A. B., Umbarkar, S. P. The influence of magnetic field on plant growth. Seed Sci. Technol. 24 (2), 375-392 (1996).
  5. Abe, K., Fujii, N., Mogi, I., Motokawa, M., Takahashi, H. Effect of a high magnetic field on plant. Biol. Sci. Space. 11, 240-247 (1997).
  6. Volpe, P. Interactions of zero-frequency and oscillating magnetic fields with biostructures and biosystems. Photochem. Photobiol. Sci. 2 (6), 637-648 (2003).
  7. Belyavskaya, N. A. Biological effects due to weak magnetic field on plants. Adv. Space. Res. 34 (7), 1566-1574 (2004).
  8. Weber Bittl, R., S, Transient radical pairs studied by time-resolved EPR. Biochim. Biophys. Acta- Bioenerg. 1707 (1), 117-126 (2005).
  9. Pazur Galland, P., A, Magnetoreception in plants. J. Plant Res. 118 (6), 371-389 (2005).
  10. Minorsky, P. V. Do geomagnetic variations affect plant function. J. Atm. Solar-Terrestr. Phys. 69 (14), 1770-1774 (2007).
  11. Burda Vanderstraeten, J., H, Does magnetoreception mediate biological effects of power-frequency magnetic fields. Sci. Tot. Environ. 417, 299-304 (2012).
  12. Job, C., Rajjou, L., Lovigny, Y., Belghazi, M., Job, D. Patterns of protein oxidation in Arabidopsis seeds and during germination. Plant Physiol. 138 (2), 790-802 (2005).
  13. Wan, L. L., Ross, A. R. S., Yang, J. Y., Hegedus, D. D., Kermode, A. R. Phosphorylation of the 12 S globulin cruciferin in wild-type and abi1-1 mutant Arabidopsis thaliana (thalecress) seeds.. Biochem J. 404, 247-256 (2007).
  14. Sancenon, V., Puig, S., Mira, H., Thiele, D. J., Penarrubia, L. Identification of a copper transporter family in Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 51 (4), 577-587 (2003).
  15. Foyer, C. H., Karpinska, B., Krupinska, K. The functions of Whirly1 and Redox-Responsive Transcription Factor 1 in cross tolerance responses in plants: A hypothesis. Philos.Trans.Royal Soc.B-Biol.Sci. 369 (1640), 20130226(2014).
  16. Myouga, F., et al. A heterocomplex of iron superoxide dismutases defends chloroplast nucleoids against oxidative stress and is essential for chloroplast development in Arabidopsis. Plant Cell. 20 (11), 3148-3162 (2008).
  17. Mhamdi, A., Queval, G., Chaouch, S., Vanderauwera, S., Van Breusegem, F., Noctor, G. Catalase function in plants: a focus on Arabidopsis mutants as stress-mimic models. J. Exper. Bot. 61 (15), 4197-4220 (2010).
  18. Bassham Contento, A. L., C, D. Increase in catalase-3 activity as a response to use of alternative catabolic substrates during sucrose starvation. Plant Physiol. Biochem. 48 (4), 232-238 (2010).
  19. Kangasjarvi, S., et al. Diverse roles for chloroplast stromal and thylakoid-bound ascorbate peroxidases in plant stress responses. Biochem. J. 412, 275-285 (2008).
  20. Begara-Morales, J. C., et al. Dual regulation of cytosolic ascorbate peroxidase (APX) by tyrosine nitration and S-nitrosylation. J. Exper. Bot. 65 (2), 527-538 (2014).
  21. Li, N., et al. AtrbohD and AtrbohF negatively regulate lateral root development by changing the localized accumulation of superoxide in primary roots of Arabidopsis. Planta. 241 (3), 591-602 (2014).
  22. Skoog Murashige, T., F, A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15, 473-497 (1962).
  23. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nuc. Acids Res. 29 (9), (2001).
  24. Bustin, S. A., et al. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clin. Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
  25. Phillips, M. A., D'Auria, J. C., Luck, K., Gershenzon, J. Evaluation of candidate reference genes for real-time quantitative PCR of plant samples using purified cDNA as template. Plant Mol. Biol. Rep. 27 (3), 407-416 (2009).
  26. Andersen, C. L., Jensen, J. L., Orntoft, T. F. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: A model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets. Cancer Res. 64 (15), 5245-5250 (2004).
  27. Tsukaya, H. Developmental genetics of leaf morphogenesis in dicotyledonous plants. J. Plant Res. 108 (1092), 407-416 (1995).
  28. Szymanowska-Pulka, J. Form matters: morphological aspects of lateral root development. Ann. Bot. 112 (9), 1643-1654 (2013).
  29. Black Bewley, J. D., Seeds, M. Physiology of development and germination. , Plenum Press. New York. (1994).
  30. Kato-Noguchi, H., Ota, K., Kujime, H., Ogawa, M. Effects of momilactone on the protein expression in Arabidopsis germination. Weed Biol. Manage. 13 (1), (2013).
  31. Khandelwal, A., Elvitigala, T., Ghosh, B., Quatrano, R. S. Arabidopsis transcriptome reveals control circuits regulating redox homeostasis and the role of an AP2 transcription factor. Plant Physiol. 148 (4), 2050-2058 (2008).
  32. Haddad, J. J. Oxygen-sensing mechanisms and the regulation of redox-responsive transcription factors in development and pathophysiology. Respirat. Res. 3 (1), (2002).

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Inversi n del campo geomagn ticobobinas de Helmholtzan lisis de la expresi n g nicamedici n del crecimiento vegetalPCR cuantitativa en tiempo realan lisis de la longitud de la ra zmedici n del rea foliarexposici n a campos magn ticosnormalizaci n mediante genes de referencia

Artículos relacionados