En este trabajo proponemos una estrategia para estudiar el efecto de un factor de transcripción de interés en el transcriptoma de microARN utilizando datos disponibles públicamente, recursos computacionales y datos de alto rendimiento de matrices de microARN después de transfectar células con ARN de horquilla pequeña (sh)dirigido a un factor de transcripción de interés.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Descripción de una regulación dependiente de factor de transcripción del transcriptoma MicroARN
En este artículo
Resumen
Resumen
Mientras que la regulación de la transcripción de genes que codifican proteínas se estudió extensamente, poco se conoce sobre cómo los factores de transcripción están implicados en la transcripción de los ARN no codificantes, específicamente de microARN. A continuación, se propone una estrategia para estudiar el posible papel del factor de transcripción en la regulación de la transcripción de microRNAs utilizando los datos públicamente disponibles, los recursos computacionales y de datos de alto rendimiento. Utilizamos la firma epigenética H3K4me3 para identificar promotores de microARN y la cromatina immunoprecipitation (CHIP) -sequencing datos del proyecto ENCODE para identificar promotores de microARN que se enriquecen con los sitios de unión del factor de transcripción. Mediante la transfección de células de interés con shRNA dirigidas a un factor de transcripción de interés y someter las células a la matriz microARN, se estudia el efecto de este factor de transcripción en el transcriptoma de microARN. A modo de ejemplo ilustrativo usamos nuestro estudio sobre el efecto de STAT3 en el transcriptoma de microARN Ly crónicaleucemia mphocytic (LLC) de células.
Introducción
Los microARN son ARN reguladoras no codificantes pequeñas endógenos que normalmente funcionan como reguladores negativos de la expresión de ARNm a nivel postranscripcional. Aproximadamente 1000 no codificante de 20 a 25 nucleótidos microRNAs largos se encuentran en el genoma humano 1,2. MicroARNs regulan la expresión génica a través de apareamiento de bases entre la secuencia canónica semilla de la microRNA y su secuencia complementaria partido de semillas, que comúnmente se encuentra en la región no traducida 3 '(UTR) de los ARNm diana. Colectivamente, microRNAs regulan más de 30% de los genes de codificación de proteínas 3, pero sólo se conoce poco acerca de la transcripción a partir del ADN de microARN. Se ha sugerido que la regulación de la transcripción microRNA es similar a la de mRNA 4,5. En particular, similar a su actividad en la promoción de la transcripción de genes de codificación de proteínas, se cree que los factores de transcripción para activar la transcripción de microRNAs 6. Factor de Transcripción-microRNA interacción ha sido reportado como un factor modulador de la expresión génica 7, y también pueden formar feed-back y bucles de alimentación hacia adelante. Por ejemplo, Yamakuchi et al. Informó de un bucle de retroalimentación en el que p53 induce la expresión de microRNA34a, que a su vez inhibe la traducción de la SIRT p53 represor y aumentando de este modo la actividad de p53 8.
Considerando que se han reportado ejemplos específicos de expresión dependiente de factor de transcripción de los microARN, un método aceptado que proporciona información sobre cómo un factor de transcripción de interés regula la expresión del microARN-transcriptoma es insuficiente. El propósito del protocolo sugerido en este documento es proporcionar una descripción en profundidad de la transcripción de la regulación dependiente del factor de la microRNA-transcriptoma. Al combinar los datos públicamente disponibles, herramientas bioinformáticas y el uso de la tecnología de microarrays, los investigadores que siguen este algoritmo sería capaz de capturar en una escala genómica cómo cualquierfactor de transcripción en cualquier tipo de célula de interés regula la expresión de la microRNA-transcriptoma y para explorar una contribución putativa del factor de transcripción-mRNA en la regulación de la expresión de microARN.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Identificar factor de transcripción sitios de unión en el promotor de los genes de microARN Usando enfoque de minería de datos
- Utilice el genoma navegador de la Universidad de California en Santa Cruz (UCSC) para extraer los datos de la cromatina immunoprecipitation (CHIP) de secuenciación generados como parte del proyecto Enciclopedia de elementos de ADN (ENCODE).
- Abra el explorador de tablas en la UCSC genoma navegador.
- Utilice las siguientes especificaciones para extraer la tabla: Clade: (mamíferos), genoma: (Ser humano), Asamblea: (Feb2009 (GRch37 / hg18)), grupo: (regulación), pista (TxnFactorChIP), tabla: (weEncoderesTFbsCo7steredv3), región : (Genoma), formato de salida (todos los genes de la tabla seleccionada).
- Guardar la salida de 1.1.2 como un archivo .txt y en una hoja de cálculo.
- Ordenar y filtrar para el factor de transcripción de interés (por ejemplo, STAT2).
- Utilice la lista de promotores de microARN basado en H3K4me3 epigenética firma disponible en Baeer et al. 9 . Copia esta lista en un archivo .txt.
- Para hacer coincidir de acuerdo con coordenadas en el genoma humano, asignar los datos a partir de 1,1 y 1,2 (por ejemplo, STAT3 de unión en los promotores de microARN putativo) y determinar la afinidad de unión mediana utilizando el código escrito en C agudo como se indica en suplementario archivo 1 de codificación.
2. Uso shRNA para regular a la baja la expresión de un factor de transcripción de interés
- Plate 1,5 x 10 6 células de la línea celular 293 de riñón embrionario humano en 10 cm de placas a aproximadamente 50% de confluencia (DMEM con 10% FBS).
- transfectar células de la línea celular 293 de riñón embrionario humano con 5 g de lentivirus proteína verde fluorescente (GFP) que contiene shRNA dirigidos al factor de transcripción de interés y con 5 g de vectores de empaquetamiento usando el reactivo de transfección de células adherentes de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Como control, transfectar las células de la línea celular 293 de riñón embrionario humano conrevueltos shRNA y los vectores de envasado de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Mantenga mezcla de transfección en las células durante 16 horas (a 37 ° C, incubadora de CO 2), a continuación, cambiar el medio a 10 ml fresco 10% de medio DMEM con 10% de FBS.
- Espere 48 horas después de la transfección, se centrifuga el cultivo celular (300 xg, 5 min) y recoger el sobrenadante infeccioso. Se filtra el sobrenadante a través de un filtro de jeringa de 0,45 m (25 mm tensioactivo de celulosa libre de membrana de acetato) para eliminar cualquier célula flotante.
- Se concentra el sobrenadante y recoger el lentivirus utilizando un dispositivo de filtro de ultracentrifugación con umbral de 100 kDa. Giran a 950 xg durante 30 - 60 min hasta que el volumen ha sido concentrado a menos de 250 l. Almacenar el virus concentrado a -80 ° C.
- Transfectar las células con el lentivirus. Eliminar lentivirus congelado de -80 ° C congelador y descongelar a temperatura ambiente. Transferir 100 l de sobrenadante viral a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Bring hasta el volumen en el tubo a 1 ml con medio con suero reducido. Añadir bromuro de hexadimetrina a 1 ml de suspensión de virus para la concentración final de 10 ng / ml, mezclar suavemente y se deja reposar la mezcla durante 5 min.
- Centrifugar 5 x 10 6 células por cada transducción y suavemente volver a suspender el sedimento celular en 0,5 ml de medio que contiene virus. Deje que las células permanecen en la incubadora 4 - 24 horas, a continuación, añadir 0,5 ml de medio con FBS al 20% a una concentración final de 10% de SFB.
- Espere 48 a 72 hr y teñir las células con yoduro de propidio (PI) y la proteína fluorescente verde (GFP) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Proteger a las células de la luz y utilizar un clasificador FACS para medir las tasas de GFP + / PI - células. Dado que las manchas de IP única célula muerta, esta tasa es una estimación de la eficacia de transfección en células vivas.
- Clasificar la población de células positivas para la expresión de GFP (GFP +) por FACS clasificador como se describió anteriormente 10.
- uso Westeblotting inmune rn como se describió previamente 10 para determinar los niveles de un factor de transcripción de interés antes y después de la infección de las células de interés (por ejemplo, células LLC) con shRNA designado.
3. Determinar el nivel de expresión de microARN transcriptoma en células transfectadas con factor de transcripción-shRNA
- Aislar el ARN utilizando un kit comercial de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Etiquetar el ARN y se hibridan a microARN microarrays 11.
- Determinar el microRNA expresado diferencialmente en las células transfectadas con factor de transcripción-shRNA o con los controles de vector vacío 5.
- Validar los resultados de microarrays para los microRNAs más expresados diferencialmente utilizando PCR en tiempo real 5.
4. Determinar la superposición entre la Bioinformática y el Enfoque shRNA Al describir el transcriptoma dependiente factor de transcripción
- para detERMINE las proporciones esperadas y observadas de los genes de microARN que albergan factor de transcripción sitios de unión en sus promotores y fueron regulados a la baja en el factor de transcripción shRNA células transfectadas, haga lo siguiente:
- Obtener la relación de los genes que albergan el factor de transcripción de interés en su promotor / micro ARN total a partir de la lista generada en 1.3. Esta lista es la proporción esperada (por ejemplo, los genes de microARN con los sitios de unión de STAT3 / total de genes de microARN probados = 0,25).
- Determinar el número de genes que son regulados negativamente en las células transfectadas factor de transcripción shRNA de la lista generada en 3.3 y tiene factor de transcripción de sitios de unión de interés de la lista generada en 1.3. Este número / número total de genes regulados negativamente es la proporción observada (por ejemplo, los genes microRNA con sitios de unión de STAT3 / número total de microRNAs downregulated = 0,6).
- Utilice χ2 estadísticas para comparar las proporciones observadas y esperadas que se generaron por encima y determinar si la lista de genes que se downregulated en las células transfectadas factor de transcripción shRNA están enriquecidas con factor de transcripción sitios de unión en su promotor.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
STAT3 es un factor de transcripción que normalmente induce la transcripción de genes que tienen propiedades anti efectos proliferativos 12 apoptótica y. Ya sea STAT3 también afecta a la ARN no codificante transcriptoma es actualmente desconocido. En todas las células de CLL STAT3 es constitutivamente fosforilada en serina 707 residuos de 10,13. Fosfoserina STAT3 servicio de enlace con el núcleo, se une al ADN, y activa los genes conocidos para ser activado por tiros...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El mecanismo subyacente a la polimerasa de transcripción de ARN II- dependiente de proteínas de codificación de genes ha sido ampliamente estudiado. Si bien estos elementos constituyen sólo el 1% - 2% del genoma humano, la evidencia del proyecto ENCODE sugieren que más del 80% del genoma humano puede someterse a transcripción 17 y lo regula la transcripción de los elementos de ADN no codificantes sigue siendo en gran parte desconocida 6 .
Varios estudios, que indicaban ...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por una beca de la Fundación de Investigación Global de la LLC. La Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center está apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud a través de un Centro de Grant la ayuda del cáncer (P30CA16672).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Lipofectamin 2000 | Life Technologies | 11668027 | |
| 0.45 µ m filtro de jeringa | Thermo Scientific (Nalgene) | 190-2545 | |
| Dispositivo de filtro ultracentrífugo Amicon con umbral de 100 kDa | Merck Millipore | ||
| Polybrene | Merck Millipore | TR-1003-G | |
| TRIzol reactivo | Life Tachnologies (Invitrogen) | 15596-026 | |
| 293 Línea celular humana | Sigma-Aldrich | 85120602 |
Referencias
- Bentwich, I., et al. Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs. Nat Genet. 37, 766-770 (2005).
- Hata, A. Functions of microRNAs in cardiovascular biology and disease. Annu Rev Physiol. 75, 69-93 (2013).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
- Piriyapongsa, J., Jordan, I. K., Conley, A. B., Ronan, T., Smalheiser, N. R. Transcription factor binding sites are highly enriched within microRNA precursor sequences. Biol Direct. 6, 61(2011).
- Rozovski, U., et al. Signal transducer and activator of transcription (STAT)-3 regulates microRNA gene expression in chronic lymphocytic leukemia cells. Mol Cancer. 12, 50(2013).
- Turner, M. J., Slack, F. J. Transcriptional control of microRNA expression in C. elegans: promoting better understanding. RNA Biol. 6, 49-53 (2009).
- Cui, Q., Yu, Z., Pan, Y., Purisima, E. O., Wang, E. MicroRNAs preferentially target the genes with high transcriptional regulation complexity. Biochem Biophys Res Commun. 352, 733-738 (2007).
- Yamakuchi, M., Lowenstein, C. J. MiR-34, SIRT1 and p53: the feedback loop. Cell Cycle. 8, 712-715 (2009).
- Baer, C., et al. Extensive promoter DNA hypermethylation and hypomethylation is associated with aberrant microRNA expression in chronic lymphocytic leukemia. Cancer Res. 72, 3775-3785 (2012).
- Hazan-Halevy, I., et al. STAT3 is constitutively phosphorylated on serine 727 residues, binds DNA, and activates transcription in CLL cells. Blood. 115, 2852-2863 (2010).
- Melo, S. A., et al. A TARBP2 mutation in human cancer impairs microRNA processing and DICER1 function. Nat Genet. 41, 365-370 (2009).
- Akira, S. Functional roles of STAT family proteins: lessons from knockout mice. Stem Cells. 17, 138-146 (1999).
- Frank, D. A., Mahajan, S., Ritz, J. B lymphocytes from patients with chronic lymphocytic leukemia contain signal transducer and activator of transcription (STAT) 1 and STAT3 constitutively phosphorylated on serine residues. J Clin Invest. 100, 3140-3148 (1997).
- Calin, G. A., et al. MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 11755-11760 (2004).
- Consortium, E. P. A user's guide to the encyclopedia of DNA elements (ENCODE). PLoS biology. 9, e1001046(2011).
- Miranda, K. C., et al. A pattern-based method for the identification of MicroRNA binding sites and their corresponding heteroduplexes. Cell. 126, 1203-1217 (2006).
- Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489, 57-74 (2012).
- Lau, J. C., Hanel, M. L., Wevrick, R. Tissue-specific and imprinted epigenetic modifications of the human NDN gene. Nucl Acids Res. 32, 3376-3382 (2004).
- Corcoran, D. L., et al. Features of mammalian microRNA promoters emerge from polymerase II chromatin immunoprecipitation data. PLoS One. 4, e5279(2009).
- Bhattacharyya, M., Feuerbach, L., Bhadra, T., Lengauer, T., Bandyopadhyay, S. MicroRNA transcription start site prediction with multi-objective feature selection. Stat Appl Genet Mol Biol. 11, Article 6 (2012).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
