Ensayo in vitro para medir Fosfatidiletanolamina metiltransferasa actividad

Resumen

El presente informe describe un ensayo enzimático in vitro para medir la actividad de la fosfatidiletanolamina metiltransferasa utilizando extractos de células de Leishmania. Este ensayo se basa en la transferencia de un grupo metilo radiactivo de S-[Metil-3 H]adenosil-L-metionina a la fosfatidiletanolamina endógena.

Resumen

Las metiltransferasas de fosfatidiletanolamina son enzimas biosintéticas que catalizan la transferencia de uno o más grupos metilo de S-adenosil-L-metionina a fosfatidiletanolamina, monometil-fosfatidiletanolamina o dimetil-fosfatidiletanolamina para dar monometil-fosfatidiletanolamina, dimetil-fosfatidiletanolamina o fosfatidilcolina. Estas enzimas son ubicuas en células animales, hongos y también se encuentran en aproximadamente el 10% de las bacterias. Cumplen varias funciones importantes en la fisiología celular más allá de su papel directo en el metabolismo de los lípidos, como en la resistencia a la insulina, la diabetes, la aterosclerosis, el crecimiento celular o la virulencia. El presente manuscrito informa sobre un ensayo enzimático simple sin células que mide la transferencia de grupos metilo tritiados de S-[Metil-3 H]adenosil-L-metionina a fosfatidiletanolamina utilizando extractos de células enteras como fuente de enzimas. Las formas metiladas resultantes de la fosfatidiletanolamina son hidrofóbicas y, por lo tanto, se pueden separar de la S-[metil-3 H]adenosil-L-metionina soluble en agua mediante extracción orgánica. Este ensayo puede aplicarse potencialmente a cualquier otro tipo de células y utilizarse para probar inhibidores/fármacos específicos de una fosfatidiletanolamina metiltransferasa de interés sin necesidad de purificar la enzima.

Introducción

Metiltransferasa fosfatidiletanolamina (PEMA) enzimas catalizan la unión covalente de uno o más grupos metilo utilizando S -adenosylmethionine (SAM) como donante de metilo en PE grupo, monometil o dimetil-PE-PE para dar monometil-PE, dimetil-PE y / o fosfatidilcolina (PC). Estas enzimas son casi omnipresentes en las células animales y hongos. También se pueden encontrar en algunas plantas ^{1 y} aproximadamente el 10% de las bacterias, particularmente aquellos que interactúan con ² eucariotas.

PEMTs son relevantes para la biología de la célula no sólo contribuyendo a la producción de PC, que es la principal cla....

Protocolo

1. Preparación de la célula Extracto

1. Cultivar las células de Leishmania en una botella de plástico estéril sellado con tapa de aire ajustado a 26 ºC en un medio hecho de 1x M199 suplementado con 20 mM HEPES pH 7,4, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 5 mg / ml heme , 0,35 g / L NaCO ₂ H, adenina 0,1 mM y 2 g / ml biopterina sin agitación. Recoger las células por centrifugación a 1500 g durante 5 min a 4 ºC cuando alcanzan una densidad celular de 1-2 x 10 ⁷ / ml.
2. Descartar el sobrenadante con una pipeta y se lavan las células resuspendiendo el sedimento celular con una pipeta serológica en medio ....

Resultados

La Figura 1 muestra un ensayo de PEMA dependiente del tiempo, que se llevó a cabo con extracto de células enteras Leishmania como una fuente de enzima usando PE endógena como sustrato. La cantidad de radiactividad en la fase orgánica se cuantificó por recuento de centelleo. Los números resultantes se utilizan para calcular la cantidad de grupos metilo tritiados transferidos a PE. La actividad PEMA fue lineal durante aproximadamente 20 min. A continuación, alcanz.......

Discusión

Este ensayo PEMA simple, rápida permite la cuantificación de las formas metiladas de PE que resulta de la transferencia de grupos metilo radiactivos de SAM en PE utilizando extracto de células enteras como fuente de proteína. Es rápido, sensible, reproducible, y también es adecuado para las enzimas purificadas ^17. Monometil- o dimetil-PE se pueden añadir a el ensayo si el metiltransferasa de interés es específica para estos sustratos en lugar de PE ^12,13,18,19. Si se utiliza la enzima purificada PE.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
S-[Metil-3H]adenosil-L-metionina (actividad específica de 5-15 Ci/mMole)	Perkin Elmer	NET155050UC	Alícuota el reactivo y congelar a -20 ° C; siga las pautas de seguridad de la radiación mientras usa este reactivo
Cóctel de inhibidores de proteasa	Roche Life Sciences 11836170001		diluirlo fresco
Perlas de vidrio, lavadas con ácido, 425-600 mm	Sigma Aldrich	G8772
Solución de ácido bicinconínico	Sigma Aldrich	B9643
Sulfato de cobre (II)	Sigma Aldrich	C2284
Contador de centelleo MicroBeta2 con 1 detector	Perkin Elmer	2450-0010
Espectrofotómetro Biomate 3	Thermo Scientific	840208300
BSA solución madre (10 mg/ml)	New England Biolabs	B9001S
Líquido de centelleo	Producto de investigación International Corp	111198
S-(5'-adenosil)-L-cloruro de metionina (clorhidrato)	Cayman Chemicals	13956	diluye el reactivo en 20 mM de HCl y congela las alícuotas a -80 ° C