Ensayo in vitro para medir Fosfatidiletanolamina metiltransferasa actividad

Resumen

El presente informe describe un ensayo enzimático in vitro para medir la actividad de la fosfatidiletanolamina metiltransferasa utilizando extractos de células de Leishmania. Este ensayo se basa en la transferencia de un grupo metilo radiactivo de S-[Metil-3 H]adenosil-L-metionina a la fosfatidiletanolamina endógena.

Resumen

Las metiltransferasas de fosfatidiletanolamina son enzimas biosintéticas que catalizan la transferencia de uno o más grupos metilo de S-adenosil-L-metionina a fosfatidiletanolamina, monometil-fosfatidiletanolamina o dimetil-fosfatidiletanolamina para dar monometil-fosfatidiletanolamina, dimetil-fosfatidiletanolamina o fosfatidilcolina. Estas enzimas son ubicuas en células animales, hongos y también se encuentran en aproximadamente el 10% de las bacterias. Cumplen varias funciones importantes en la fisiología celular más allá de su papel directo en el metabolismo de los lípidos, como en la resistencia a la insulina, la diabetes, la aterosclerosis, el crecimiento celular o la virulencia. El presente manuscrito informa sobre un ensayo enzimático simple sin células que mide la transferencia de grupos metilo tritiados de S-[Metil-3 H]adenosil-L-metionina a fosfatidiletanolamina utilizando extractos de células enteras como fuente de enzimas. Las formas metiladas resultantes de la fosfatidiletanolamina son hidrofóbicas y, por lo tanto, se pueden separar de la S-[metil-3 H]adenosil-L-metionina soluble en agua mediante extracción orgánica. Este ensayo puede aplicarse potencialmente a cualquier otro tipo de células y utilizarse para probar inhibidores/fármacos específicos de una fosfatidiletanolamina metiltransferasa de interés sin necesidad de purificar la enzima.

Introducción

Metiltransferasa fosfatidiletanolamina (PEMA) enzimas catalizan la unión covalente de uno o más grupos metilo utilizando S -adenosylmethionine (SAM) como donante de metilo en PE grupo, monometil o dimetil-PE-PE para dar monometil-PE, dimetil-PE y / o fosfatidilcolina (PC). Estas enzimas son casi omnipresentes en las células animales y hongos. También se pueden encontrar en algunas plantas ^{1 y} aproximadamente el 10% de las bacterias, particularmente aquellos que interactúan con ² eucariotas.

PEMTs son relevantes para la biología de la célula no sólo contribuyendo a la producción de PC, que es la principal clase de lípidos en las células animales, sino también mediante el cumplimiento de otras funciones celulares importantes. En los mamíferos, PEMTs se expresan principalmente en el hígado donde son requeridas para la secreción normal de la lipoproteína de muy baja densidad y también contribuyen a la obesidad inducida por la dieta ^{3, 4} aterosclerosis, y la insulina se resistenANCE ^5. Además, PEMA mamíferos también se expresan en los adipocitos, aunque a niveles más bajos, y participar en la deposición de grasa ^{6, 7.} PEMA papel en el desarrollo del cáncer ^{8, 9} apoptosis, y ¹⁰ el crecimiento celular también se ha demostrado. En las bacterias, las enzimas PEMA han demostrado ser importantes para el crecimiento normal de las células ^2, la virulencia ^2, y la simbiosis con la planta huésped ^11.

El objetivo y razón de ser del presente protocolo es para medir la actividad PEMA a partir de extractos de células enteras, sin la necesidad de purificar la enzima. Dos protocolos distintos se han desarrollado para medir la actividad PEMA. La primera y más común se mide la transferencia de un grupo metilo tritiada de SAM radiactivo en PE, que es el tema de este artículo. Este protocolo ha sido desarrollado originalmente para medir la actividad de la levadura PEMA ¹² y células de mamíferos (hígado) ¹³ para obtener una understanding de la biosíntesis de PC en estas células, así como para determinar la especificidad de estas enzimas. Más tarde, esta técnica se ha aplicado a otros tipos de células tales como bacterias ² (utilizando un valor de pH básico para el ensayo aunque ¹⁵⁾ y parásitos protozoarios ^14. Esta técnica se puede utilizar con extractos de células enteras, así como enzima purificada, y potencialmente se puede aplicar a cualquier sistema de extracto celular. Un ensayo no radiactivo también se ha diseñado que se basa en la cuantificación enzimática de S -adenosylhomocysteine, el producto de transmetilación de SAM ^16. El último ensayo puede ser más conveniente, ya que no implica la radiactividad pero sólo es adecuado para las enzimas purificadas.

Protocolo

1. Preparación de la célula Extracto

1. Cultivar las células de Leishmania en una botella de plástico estéril sellado con tapa de aire ajustado a 26 ºC en un medio hecho de 1x M199 suplementado con 20 mM HEPES pH 7,4, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 5 mg / ml heme , 0,35 g / L NaCO ₂ H, adenina 0,1 mM y 2 g / ml biopterina sin agitación. Recoger las células por centrifugación a 1500 g durante 5 min a 4 ºC cuando alcanzan una densidad celular de 1-2 x 10 ⁷ / ml.
2. Descartar el sobrenadante con una pipeta y se lavan las células resuspendiendo el sedimento celular con una pipeta serológica en medio del volumen de la cultura de solución salina tamponada con fosfato fría (NaCl 137 mM, 2,7 mM KCl, mM Na 10 ₂ HPO _4, 1,8 mM KH ₂ PO _4, pH 7,4). Deseche sobrenadantes de células de acuerdo con los lineamientos de seguridad BL2.
3. Centrifugar las células de nuevo a 1.500 g durante 5 min a 4 ºC. Descartar el sobrenadante con una pipeta. Proceda to el siguiente paso o complemento congelar el sedimento de células en nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo a -80 ºC (hasta tres meses).
4. Preparar tampón de lisis 2x (0,5 M de sacarosa, 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, EDTA 2 mM, y el inhibidor de la proteasa cóctel 2x) y conservarse a 4 ° C en hielo.
5. Resuspender el sedimento celular (fresco o congelado) en un volumen igual de tampón de lisis 2x. Añadir 1 x volumen de perlas de vidrio. Vortex vigorosamente a 4 ºC durante 10 min.
6. Añadir 2 volúmenes de tampón de lisis 1x y mezclar. Extractos de células se centrifuga a 1500 xga 4 ºC durante 10 minutos para sedimentar las células intactas y núcleos.
7. Transferir el sobrenadante con una pipeta en un tubo de centrífuga fresco y mantenerla extractos de células en hielo hasta la finalización del experimento.

2. Determinar la concentración de proteína del extracto celular utilizando el kit de Estimación de proteínas como Ensayo de Ácido bicinconínico

1. Preparar la solución de ácido bicinconínico (BCA) (1 ml / tubo) por mezcla de los BCA y cobre (II) sulfate en una proporción de 49: 1 (v / v).
2. Preparar los estándares de proteína de 0, 10, 20, 30, 40, 50, y 60 g / ml por dilución de una solución madre de 10 mg / ml de albúmina de suero bovino (BSA) en alícuotas de 1 ml de la solución de BCA.
3. Añadir 2 l de extractos de células en 1 ml de solución BCA en los duplicados. Incubar los estándares y muestras de proteína durante 10 min en un baño de agua 60 ° C pre-calentado.
4. Muestras de Transferencia de hielo durante 3 min. Medir la absorbancia de los estándares y las muestras de proteínas con un espectrofotómetro a una longitud de onda de 562 nm.
5. Calcular la concentración de proteína de los extractos celulares utilizando el estándar de BSA como referencia como se describe en el protocolo del fabricante. Diluir los extractos de células a una concentración de proteína de 10 mg / ml con tampón de lisis 1x.

3. ensayo enzimático en 200 l por tubo

NOTA: Realice los siguientes pasos en una campana química.

1. Pruebe cada muestra por duplicado en unos 15 mltubo cónico. Preparar 20 l 1 M Tris HCl pH 7,5 por tubo y mantenerlo en hielo. Preparar 2 ml de cloroformo / metanol (1: 1 (v / v); solución de parada) a TA durante cada tubo.
2. Pipetear 20 l de 1 M Tris HCl pH 7.5 en cada tubo cónico de 15 ml en hielo.
3. Siga las normas de seguridad radiológica de aquí en adelante. Añadir el equivalente de 0,06 m (0,2 Ci) S - [metil- ³ H] adenosil-L-metionina y 50 mM frío SAM por tubo para un total de 50,06 M de SAM. Añadir x l de agua fría donde x = 200 (20 (de buffer) + 20 (para los extractos celulares) + volumen de frío y radiactivo SAM) por tubo.
4. Traslado cada tubo cónico a un baño de agua precalentado 30 ºC. Añadir a cada tubo 20 l de extractos de células (equivalente a 200 g de proteína) para iniciar la reacción. Incubar durante el tiempo deseado (0 a 45 min).
5. Detener la reacción mediante la adición de 2 ml de cloroformo / metanol (1: 1; v / v; solución de parada) a cada tubo. Transferir el tubo cónico a RT (20-256; C).

4. Extracción de lípidos

NOTA: Realice los siguientes pasos en una campana química.

1. Añadir 700 l de agua a cada tubo que contiene la muestra de reacción enzimática. Vortex vigorosamente durante 30 seg. Centrifugar a 1500 xg durante 5 min a temperatura ambiente para separar el orgánica de la fase agua.
2. Transferir la fase orgánica inferior en un nuevo tubo cónico de 15 ml con una pipeta. Añadir 1 ml de agua a cada "fase inferior" que contiene el tubo y agitar vigorosamente durante 30 seg. Centrifugar de nuevo a 1500 xg durante 5 min para separar el orgánica de la fase agua.
3. Transferir la fase orgánica inferior en un tubo de centelleo con una pipeta. Las muestras secas bajo una _corriente de N2. Deseche las fases de agua que contienen el SAM radiactivo no incorporado y los tubos cónicos radiactivos como por las directrices de radiación.
4. Añadir 2 ml / tubo de líquido de centelleo. Medir la radiactividad incorporada con un cou de centelleonter acuerdo con el protocolo del fabricante y el uso del instrumento.
5. Calcular la actividad enzimática en mg de proteína / nmol utilizando la siguiente ecuación general:
   valor cpm x 10 x ³ [Total (radiactivos y frío) concentración de SAM (mM)] x 5 actividad específica de SAM radiactivo (Ci / mmol) x [concentración de SAM radiactivo (mM)]
   NOTA: el protocolo anterior se puede alterar para una concentración SAM dependiente o un ensayo de PEMA dependiente de la proteína. Para la concentración SAM ensayo enzimático dependiente, el tiempo se mantiene constante (15 min, que está en el intervalo lineal) y varias cantidades de frío SAM se añaden al ensayo, mientras que para el ensayo de PEMA dependiente de la proteína, la concentración de SAM (elegimos 0,05 mM) y la hora se mantuvo constante (15 min). También el pH del tampón se puede cambiar según sea necesario si algunas enzimas PEMA tienen un valor de pH óptimo diferente.

Resultados

La Figura 1 muestra un ensayo de PEMA dependiente del tiempo, que se llevó a cabo con extracto de células enteras Leishmania como una fuente de enzima usando PE endógena como sustrato. La cantidad de radiactividad en la fase orgánica se cuantificó por recuento de centelleo. Los números resultantes se utilizan para calcular la cantidad de grupos metilo tritiados transferidos a PE. La actividad PEMA fue lineal durante aproximadamente 20 min. A continuación, alcanz...

Discusión

Este ensayo PEMA simple, rápida permite la cuantificación de las formas metiladas de PE que resulta de la transferencia de grupos metilo radiactivos de SAM en PE utilizando extracto de células enteras como fuente de proteína. Es rápido, sensible, reproducible, y también es adecuado para las enzimas purificadas ^17. Monometil- o dimetil-PE se pueden añadir a el ensayo si el metiltransferasa de interés es específica para estos sustratos en lugar de PE ^12,13,18,19. Si se utiliza la enzima purificada PE...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
S-[Metil-3H]adenosil-L-metionina (actividad específica de 5-15 Ci/mMole)	Perkin Elmer	NET155050UC	Alícuota el reactivo y congelar a -20 ° C; siga las pautas de seguridad de la radiación mientras usa este reactivo
Cóctel de inhibidores de proteasa	Roche Life Sciences 11836170001		diluirlo fresco
Perlas de vidrio, lavadas con ácido, 425-600 mm	Sigma Aldrich	G8772
Solución de ácido bicinconínico	Sigma Aldrich	B9643
Sulfato de cobre (II)	Sigma Aldrich	C2284
Contador de centelleo MicroBeta2 con 1 detector	Perkin Elmer	2450-0010
Espectrofotómetro Biomate 3	Thermo Scientific	840208300
BSA solución madre (10 mg/ml)	New England Biolabs	B9001S
Líquido de centelleo	Producto de investigación International Corp	111198
S-(5'-adenosil)-L-cloruro de metionina (clorhidrato)	Cayman Chemicals	13956	diluye el reactivo en 20 mM de HCl y congela las alícuotas a -80 ° C