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Artículo de método

Nasal Toallitas para Influenza A Detección de Virus y aislamiento de los cerdos

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DOI:

10.3791/53313

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4 de diciembre de 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Veterinary Preventive Medicine, The Ohio State University

En este artículo

Resumen

Los autores presentan un protocolo para recolectar toallitas nasales de cerdos para detectar y aislar los virus de la influenza A.

Resumen

La vigilancia de los virus de la gripe A en cerdos es fundamental para la salud humana y animal debido a la influenza A virus evoluciona rápidamente en poblaciones porcinas y las nuevas cepas están surgiendo continuamente. Los cerdos son capaces de ser infectados por diversos linajes del virus de la gripe A haciéndolos anfitriones importantes para la aparición y el mantenimiento de la nueva influenza A cepas del virus. Muestreo cerdos en diversos entornos, como las granjas comerciales de cerdos, ferias agrícolas y mercados de animales vivos es importante proporcionar una visión completa de las cepas circulantes de IAV. La técnica actual estándar de oro ante mortem de muestreo (es decir, colección de hisopos nasales) es mano de obra intensiva, ya que requiere la restricción física de los cerdos. Toallitas nasales implican frotar un trozo de tela a través del hocico del cerdo con mínima o ninguna restricción del animal. La nasal limpie procedimiento es sencillo de realizar y no requiere personal con veterinaria profesional o capacitación manejo de animales. While ligeramente menos sensible que hisopos nasales, las tasas de detección de virus y de aislamiento son adecuados para hacer nasal limpia una alternativa viable para el muestreo de los cerdos individuales cuando se requieren métodos de muestreo de baja tensión. El protocolo de procedimiento describe los pasos necesarios para cobrar una nasal viable limpie de un cerdo individual.

Introducción

Los virus de influenza A (IAV) causan enfermedades respiratorias en muchas especies, incluyendo aves domésticas, cerdos y seres humanos. Debido al reordenamiento del genoma segmentado IAV rápida evolución viral puede ocurrir y nuevas cepas IAV surgir con frecuencia. Cerdos son una especie que puede servir como un recipiente de mezcla para la redistribución de los virus de este tipo a partir de múltiples especies huésped. 1 Actualmente hay tres subtipos principales de IAV comúnmente circulan entre los cerdos de América del Norte (H1N1, H1N2, H3N2), pero múltiples introducciones IAV de los seres humanos tienen llevó a una extensa diversidad IAV dentro de esos subtipos. 2 La rápida evolución de virus de este tipo que infectan cerdos ha sido evidente desde 1998 cuando un triple recombinante IAV que contiene segmentos de genes de virus humanos, aviares y porcinos 3 se generalizó entre los cerdos en los Estados Unidos. 4 El gen interno segmentos de esa IAV triple recombinante siguen siendo muy frecuente entre los virus de este tipo actualmente infectan a los cerdos. 5

"> A nivel mundial, IAV es una causa importante de enfermedad respiratoria en cerdos en la que los signos clínicos típicos incluyen fiebre, anorexia, letargo, tos, dificultad para respirar, estornudos, secreción nasal y poco aumento de peso. IAV puede ser particularmente costosa para sembrar fincas donde reproductiva fracaso debido a la fiebre inducida IAV y lechones débiles nacido se han documentado. 6,7 Dentro de los Estados Unidos, IAV se detecta comúnmente en piaras comerciales y la amplia diversidad antigénica y genómica y la evolución continua entre IAV porcina infectar ha dificultado el control de este virus 8-11.

Problemas de salud pública acerca de la aparición de una cepa IAV pandemia resultante de reordenamiento en el cerdo se dio cuenta en 2009 cuando una IAV porcina linaje que contiene segmentos de genes del linaje porcina norteamericana-triple recombinante y el linaje porcina aviar-como Eurasia causó una pandemia mundial en los seres humanos. 12 El virus pandémico (A (H1N1) pdm09) tiene desderedistribución génica con porcina endémica IAV cepas 13,14 y algunas de estas cepas recién reordenadas se han transmitido de nuevo a los seres humanos. 15 La frecuencia de eventos de reordenamiento y la aparición de nuevas cepas IAV con potencial pandémico hace que la vigilancia activa de los virus circulantes IAV en cerdos imprescindible, sobre todo en la interfase porcina humano.

La interfaz porcina humana es importante para interespecies bidireccional transmisión de IAV. De humano a los cerdos de transmisión que ocurre en la producción porcina comercial es responsable de una gran cantidad de IAV diversidad actualmente presente en la población porcina. Ferias agrícolas son los parámetros más importantes para el comingling de las personas y los cerdos en los Estados Unidos y son conocidos sitios para la transmisión zoonótica de IAV. 15-21 En 2012, durante el brote de una variante H3N2 IAV, el 93% de los casos reportados asistencia a una feria agrícola en los días antes de la aparición de la enfermedad. 15 Análisis genómicode los aislamientos virales de cerdos de exhibición frente a las cepas humanas confirmado la transmisión zoonótica. porcina 21 Exposición infectado con IAV menudo no muestran signos clínicos de la enfermedad, 21-23 que indican la necesidad de pruebas diagnósticas directas.

El muestreo de los cerdos visiblemente enfermos por sí sola no identificar con éxito prevalencia IAV en los cerdos y no puede ser invocada para identificar nuevas cepas de IAV emergentes entre los cerdos. La vigilancia activa es absolutamente necesario para la detección de cepas emergentes de IAV en cerdos y para evaluar su amenaza tanto para los cerdos y la salud pública. La mayoría de las actividades de vigilancia IAV son voluntarios y por lo tanto se necesitan métodos mínimamente perturbadores. Los tres principales procedimientos de recogida de muestras ante mortem para IAV infectar cerdos son: hisopos nasales, fluidos orales, nasales y toallitas. Las recomendaciones actuales para el muestreo de los cerdos individuales para detectar lista IAV la inserción de fibra sintética con punta de hisopos en las fosas nasales como el método preferidopara recoger las secreciones nasales y células epiteliales. 24,25 Debido a que los cerdos pueden tratar de evitar este procedimiento, un equipo de personal capacitado debe contener cerdos ya sea manualmente o con una trampa en función del tamaño del animal. 26 El proceso de retención es laboriosa para el personal y estresante para los cerdos. Además, porcina exposiciones suelen participar en varias competiciones en una feria por lo que la percepción de estrés añadido en un animal de la competencia puede hacer que los propietarios resistente a los esfuerzos de vigilancia.

Con probabilidades de detección IAV que van desde 80-100% en IAV rebaños infectados, fluidos orales se han convertido en una alternativa popular a hisopos nasales para la detección molecular de IAV en las poblaciones de la especie porcina. 27,28 Además, los fluidos orales pueden proporcionar una ventana más amplia de detección IAV de hisopos nasales después de la infección inicial. Sin embargo, el aislamiento a partir de fluidos orales IAV ha sido problemático con sólo el 50% de los intentos de aislamiento del virus resultante en IAV recuperación. 29

El uso de toallitas nasales en lugar de hisopos nasales durante la vigilancia IAV en cerdos supera las limitaciones descritas anteriormente. Toallitas nasales no requieren el uso de una trampa de restricción y se puede realizar sin hacer hincapié en los animales o los testigos del procedimiento. Es necesaria una formación técnica mínima para recoger trapos nasales, lo que permite a los profesionales no veterinarios, incluidos los propietarios de cerdos, para recoger las muestras de vigilancia. Toallitas nasales fueron previamente en comparación con hisopos nasales para la detección y el aislamiento de virus de influenza A 30 y el protocolo detallado para este método no invasivo de muestreo se describe a continuación.

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Protocolo

Todos los cerdos utilizados en la recogida de los siguientes datos estaban protegidos bajo el Comité de Animales Institucional de Cuidado y Uso Universidad Estatal de Ohio (uso de animales número de protocolo 2009A0134-R1).

1. Preparación de Viral Medio de Transporte y Recogida de muestras Viales

  1. Añadir 37 g de Brain Heart Infusion a 900 ml de agua purificada y mezclar bien con una barra de agitación y un agitador magnético mientras se calienta a 70 ° C para disolver completamente el polvo.
  2. Autoclave el caldo a 121 ° C durante 15 min. Dejar enfriar en la mesa de trabajo hasta que el caldo alcanza la temperatura ambiente. Refrigerar a 4 ° C durante la noche si es necesario.
  3. Disolver, mediante la mezcla con una barra de agitación magnética, 6,02 g de sal sódica de penicilina G y 10 g de sulfato de estreptomicina en 50 ml de agua purificada a temperatura ambiente. Añadir agua purificada adicional para llevar el volumen total a 100 ml. Filtrar la solución a través de una membrana de polietersulfona 0,22 m en un frasco estéril.
  4. Agregar asépticamente la solución de penicilina y estreptomicina filtrada en el enfriado caldo de infusión de cerebro y corazón y mezclar bien (barra de agitación o remolino matraz a mano) para hacer que el medio de transporte viral.
  5. Asépticamente probar el pH del medio de transporte viral; si es necesario, ajustar el pH a 7,4 ± 0,2 utilizando HCl o NaOH.
  6. Realizar pruebas de control de calidad sobre el medio de transporte viral mediante pruebas de influenza A virus proteína de la matriz por RT-PCR, como se describe por Zhang y Harmon. 22
  7. Dispense 5 ml del medio de transporte viral en botellas de polietileno de alta densidad estériles con capacidad de 8 ml. Etiquetar los viales para su uso en el campo.
  8. Guarde los viales listos para su uso en la crio-cajas estándar a -20 ° C hasta el momento de recogida de muestras.

2. Recolección de Nasal Wipes desde porcina

  1. Descongele el número adecuado de viales inmediatamente anteriores a la recogida de muestras; Se necesitará un vial por cerdo muestreado. Deshielo en la sala detemperatura tarda aproximadamente 30-45 min. Mantener los viales descongelados fresco en bolsas de hielo hasta su uso.
  2. Don equipo de protección personal adecuado como dictados por la situación (por ejemplo, overoles, cubrebotas, respiradores, tapones para los oídos, etc.).
  3. Entrar en el área de los animales. Si es necesario, limitar el cerdo a un área pequeña pero sin frenar. No despertar descansando animales.
  4. Póngase un par de guantes de examen desechables. Tenga cuidado de no contaminar los guantes por los cerdos que tocan, personas u objetos inanimados.
  5. Utilice una mano enguantada para eliminar unas estériles de 5,08 cm x 5,08 cm (2 pulg. X 2 pulg.) De gasa de algodón de su envoltorio. Gasas estériles deben utilizarse siempre que sea posible. Almohadillas de gasa individualmente envueltos son más convenientes de utilizar que aquellos envuelto con dos almohadillas de gasa por paquete.
  6. Sostenga la almohadilla de gasa de algodón con las yemas de los dedos de una mano la exposición tanto de la almohadilla como sea posible para el muestreo.
  7. Limpie la almohadilla de gasa a través de hocico de cerdo, teniendoun cuidado especial para entrar en los orificios nasales externos si es posible. Recoger las secreciones nasales visibles (aproximadamente 1 ml) con la misma gasa.
  8. Utilizando la misma mano, doblar la almohadilla de gasa sobre sí misma para facilitar la colocación en el vial que contiene el medio de transporte viral.
  9. Utilizando el otro lado, quitar el tapón del vial y colocar la almohadilla de gasa plegada en el vial. Volver a tapar el vial y agitar el vial para asegurar el mezclado de la almohadilla de gasa y medio de transporte viral.
  10. Quítese los guantes y colóquelos en un recipiente apropiado. Cambie los guantes entre cada cerdo.
  11. Compruebe el identificador de vial. Número de registro de identificación de cerdos, la edad, el sexo, los signos clínicos, y otras notas que se consideren necesarias por el investigador.
  12. Enfríe las muestras inmediatamente después de la recolección. Considere hacer alícuotas de la muestra antes de la congelación para evitar múltiples ciclos de congelación-descongelación. Tan pronto como sea posible después de la recolección, colocar las muestras en hielo seco para el transporte al laboratorio. Guarde los viales a -80° C hasta que se inicia la prueba.

3. Detección del Virus de la Influenza Nucleic Acid

  1. Descongele las muestras en un baño de grano seco de 37 ° C durante 5 minutos y luego terminar la descongelación de las muestras en la mesa de trabajo a temperatura ambiente durante 20 a 30 min. La adición simultánea de varios viales a las perlas hará que el baño para calentar; se debe tener precaución para no sobrecalentarse los viales.
  2. Quite 100 l de medio de transporte viral para la extracción de RNA.
    1. Use un alto rendimiento (formato de placa de 96) plataforma de perla magnética para la extracción de ARN a partir de un gran número de muestras. 31
  3. Utilice ensayos de PCR transcriptasa inversa en tiempo real para la detección rápida de la influenza A virus. 31

4. Aislamiento de Virus de la Influenza de nasales Wipes

  1. Descongelar las muestras como se ha descrito anteriormente en la Sección 3.1
  2. Tratar muestras descongeladas con sulfato de gentamicina (1000g / ml), anfotericina B (22,5 g / ml), y sulfato de kanamicina (325 mg / ml).
  3. Inocular en Madin-Darby de riñón canino (MDCK) las células epiteliales como se describió anteriormente. 32

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Resultados

El uso exitoso de este método produce RT-PCR resulta que, acompañado con el uso de un control interno durante la extracción de RNA y RT-PCR, se muestran muestras no contenían inhibidores de PCR de cualquier residuo ambiental recogió durante el muestreo. Después de la inoculación de la muestra, los pozos de aislamiento del virus deben estar libres de escombros ambiental visible de la muestra. Existe un acuerdo razonable entre los resultados de RT-PCR y los resultados de aislamiento de virus con el entendimiento de que la...

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Discusión

La recolección de muestras de cerdos utilizando hisopos nasales de poliéster con punta ha demostrado ser útil en la realización de la vigilancia IAV; Sin embargo, el uso del procedimiento de hisopo nasal dificulta los esfuerzos de vigilancia debido al uso requerido de un lazo a la moderación. Toallitas nasales representan un refinamiento de las técnicas de muestreo porcina actuales para minimizar el estrés en las personas y cerdos durante la recogida de muestras. Mientras que el método ha sido desarrollado y validado pa...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo ha sido financiado en parte con fondos federales de los Centros de Excelencia para la Investigación y Vigilancia de la Influenza (CEIRS), el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas, los Institutos Nacionales de Salud, el Departamento de Salud y Servicios Humanos, bajo el Contrato No. HHSN272201400006C.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
BBL Brain Heart InfusionBecton, Dickinson and Company 211059
Penicilina G Sal de sodioMP Biomedicals, LLC0211945371500 u/mg
Sulfato de estreptomicinaAMRESCO LLC0382
Solución de gentamicinaMediatech, Inc.30-005-CR50 mg/ml
Solución de anfotericina BFisher S24 25 250ug/ml
Sulfato de kanamicinaTeknovaK21055000 ug/ml
TPP Rapid Filtermax SystemTPP Techno Plastic Products AG 99150
Frascos de diagnóstico NalgenThermo Scientific342002-9025HDPE con cierre de PP blanco
Esponja de gasa Dermacea, 8 capasCovidien4412115,08 cm y veces; 5,08 cm (2 pulgadas y veces; 2 pulgadas) 
Guantes de examen de nitriloSaftey Choice19-170-010 (A-D)

Referencias

  1. Ma, W., Kahn, R. E., Richt, J. A. The pig as a mixing vessel for influenza viruses: Human and veterinary implications. J. Mol. Genet. Med. 3 (1), 158-166 (2008).
  2. Nelson, M. I., Vincent, A. L. Reverse zoonosis of influenza to swine: new perspectives on the human-animal interface. Trends Microbiol. 23, (2015).
  3. Zhou, N. N., et al. Genetic reassortment of avian, swine, and human influenza A viruses in American pigs. J. Virol. 73 (10), 8851-8856 (1999).
  4. Webby, R. J., et al. Evolution of swine H3N2 influenza viruses in the United States. J. Virol. 74 (18), 8243-8251 (2000).
  5. Vincent, A., et al. Review of influenza A virus in swine worldwide: a call for increased surveillance and research. Zoonoses Public Health. 61 (1), 4-17 (2014).
  6. Karasin, A. I., Olsen, C. W., Anderson, G. A. Genetic characterization of an H1N2 influenza virus isolated from a pig in Indiana. J. Clin. Microbiol. 38 (6), 2453-2456 (2000).
  7. Zhou, N. N., et al. Emergence of H3N2 reassortant influenza A viruses in North American pigs. Vet. Microbiol. 74 (1-2), 47-58 (2000).
  8. Corzo, C. A., et al. Active Surveillance for Influenza A Virus among Swine, Midwestern United States, 2009-2011. Emerg. Infect. Dis. 19 (6), 954-960 (2013).
  9. Lorusso, A., et al. Genetic and antigenic characterization of H1 influenza viruses from United States swine from 2008. J. Gen. Virol. 92 (Pt 4), 919-930 (2011).
  10. Loving, C. L., et al. Efficacy in pigs of inactivated and live attenuated influenza virus vaccines against infection and transmission of an emerging H3N2 similar to the 2011-2012 H3N2v. J. Virol. 87 (17), 9895-9903 (2013).
  11. Vincent, A. L., et al. Efficacy of inactivated swine influenza virus vaccines against the 2009 A/H1N1 influenza virus in pigs. Vaccine. 28 (15), 2782-2787 (2010).
  12. Smith, G. J., et al. Origins and evolutionary genomics of the 2009 swine-origin H1N1 influenza A epidemic. Nature. 459 (7250), 1122-1125 (2009).
  13. Vijaykrishna, D., et al. Reassortment of Pandemic H1N1/2009 Influenza A Virus in Swine. Science. 328 (5985), 1529(2010).
  14. Ducatez, M. F., et al. Multiple Reassortment between Pandemic (H1N1) 2009 and Endemic Influenza Viruses in Pigs, United States. Emerg. Infect. Dis. 17 (9), 1624-1629 (2011).
  15. Jhung, M. A., et al. Outbreak of variant influenza A(H3N2) virus in the United States. Clin. Infect. Dis. 57 (12), 1703-1712 (2013).
  16. Vincent, A. L., et al. Characterization of an influenza A virus isolated from pigs during an outbreak of respiratory disease in swine and people during a county fair in the United States. Vet. Microbiol. 137 (1-2), 51-59 (2009).
  17. Killian, M. L., et al. Simultaneous Infection of Pigs and People with Triple-Reassortant Swine Influenza Virus H1N1 at a U.S. County Fair. Zoonoses Public Health. 60 (3), 196-201 (2013).
  18. Wong, K. K., et al. Outbreak of influenza A (H3N2) variant virus infection among attendees of an agricultural fair, Pennsylvania, USA, 2011. Emerg. Infect. Dis. 18 (12), 1937-1944 (2011).
  19. Bowman, A. S., et al. Molecular evidence for interspecies transmission of H3N2pM/H3N2v influenza A viruses at an Ohio agricultural fair, July 2012. Emerg. Microbes. Infect. 1 (10), e33(2012).
  20. Wells, D. L., et al. Swine influenza virus infections. Transmission from ill pigs to humans at a Wisconsin agricultural fair and subsequent probable person-to-person transmission. JAMA. 265 (4), 478-481 (1991).
  21. Bowman, A. S., et al. Swine-to-human transmission of influenza A(H3N2) virus at agricultural fairs, Ohio, USA, 2012. Emerg. Infect. Dis. 20 (9), 1472-1480 (2012).
  22. Bowman, A. S., Nolting, J. M., Nelson, S. W., Slemons, R. D. Subclinical influenza virus A infections in pigs exhibited at agricultural fairs, Ohio, USA, 2009-2011. Emerg. Infect. Dis. 18 (12), 1945-1950 (2012).
  23. Gray, G. C., et al. Influenza A(H1N1)pdm09 Virus among Healthy Show Pigs, United States. Emerg. Infect. Dis. 18 (9), 1519-1521 (2012).
  24. Van Reeth, K., Brown, I. H., Olsen, C. W. Ch. 40, Influenza virus. Diseases of Swine. Zimmerman, J. J. , Wiley-Blackwell. 557-571 (2012).
  25. Culhane, M. R., Detmer, S. E. Ch. 21, Sample types, collection, and transport for influenza A viruses of swine. Methods in Molecular Biology. Spackman, E. Animal Influenza Virus, Methods in Molecular Biology; 1161. 259-263 (2014).
  26. Sheldon, C. C., Sonsthagen, T., Topel, J. A. Animal Restraint for Veterinary Professionals. , Mosby. (2006).
  27. Detmer, S. E., Patnayak, D. P., Jiang, Y., Gramer, M. R., Goyal, S. M. Detection of Influenza A virus in porcine oral fluid samples. J. Vet. Diagn. Invest. 23 (2), 241-247 (2011).
  28. Goodell, C. K., et al. Probability of detecting influenza A virus subtypes H1N1 and H3N2 in individual pig nasal swabs and pen-based oral fluid specimens over time. Vet. Microbiol. 166 (3-4), 3-4 (2013).
  29. Romagosa, A., Gramer, M., Joo, H. S., Torremorell, M. Sensitivity of oral fluids for detecting influenza A virus in populations of vaccinated and non-vaccinated pigs. Influenza Other Respir. Viruses. 6 (2), 110-118 (2012).
  30. Edwards, J. L., et al. Utility of snout wipe samples for influenza A virus surveillance in exhibition swine populations. Influenza Other Respir. Viruses. 8 (5), 574-579 (2014).
  31. Zhang, J., Harmon, K. M. Ch. 23, RNA extraction from swine samples and detection of influenza A virus in swine by real-time RT-PCR. Animal Influenza Virus. Spackman, E. , Methods in Molecular Biology; 1161. 277-293 (2014).
  32. Zhang, J., Gauger, P. C. Ch. 22, Isolation of swine influenza virus in cell cultures and embryonated chicken eggs. Animal Influenza Virus. Spackman, E. , Methods in Molecular Biology; 1161. 265-276 (2014).
  33. Bowman, A. S., et al. The Inability to Screen Exhibition Swine for Influenza A Virus Using Body Temperature. Zoonoses Public Health. , (2015).
  34. Prickett, J. R., Kim, W., Simer, R., Yoon, K. J., Zimmerman, J. Oral-fluid samples for surveillance of commercial growing pigs for porcine reproductive and respiratory syndrome virus and porcine circovirus type 2 infections. J. Swine Health Prod. 16 (2), 86-91 (2008).
  35. Prickett, J., et al. Detection of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in porcine oral fluid samples: a longitudinal study under experimental conditions. J. Vet. Diagn. Invest. 20 (2), 156-163 (2008).
  36. Pepin, B., Liu, F. F., Main, R., Ramirez, A., Zimmerman, J. Collection of oral fluid from individually housed sows. J. Swine Health Prod. 23 (1), 35-37 (2015).

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