Detallamos un protocolo para monitorizar el comportamiento de neutrófilos y monocitos en venas mesentéricas en estado estacionario e inflamatorio utilizando microscopía confocal intravital en ratones anestesiados.
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Artículo de método
Imaging neutrófilos y monocitos en mesentérica venas por Microscopia intravital en ratones anestesiados en Tiempo Real
En este artículo
Resumen
Resumen
Respuesta inmune eficiente depende de la rápida movilización de leucocitos de la sangre al sitio de la infección o lesión. La investigación de la migración de leucocitos in vivo es crucial para entender la base molecular de la migración transendotelial de leucocitos y la interacción con el endotelio vascular. Un enfoque poderoso implica microscopía intravital en ratones transgénicos que expresan las proteínas fluorescentes en las células de interés.
Aquí se presenta un protocolo para los monocitos de imágenes y neutrófilos en el CX 3 CR1 gfp / peso iv ratón inyectado con neutrófilos marcado tinte de color naranja con un microscopio confocal invertido. Películas Time-lapse recogidos de 30 minutos a varias horas de imágenes de permitir el análisis del comportamiento de leucocitos en las venas mesentéricas, tanto en condiciones de estado estacionario e inflamatorias. También describe los pasos para inducir localmente inflamación de los vasos de sangre con TLR2 / TLR1 agonista Pam3SK4 y supervisar el subsequent reclutamiento de neutrófilos y monocitos.
La técnica presentada también se puede utilizar para controlar otras poblaciones de leucocitos e investigar moléculas implicadas en el reclutamiento de leucocitos o el tráfico que utilizan otros estímulos o ratones transgénicos.
Introducción
Los neutrófilos y los monocitos son las células del sistema inmune innato que circulan continuamente en la sangre. Tras la lesión o infección, inducen señales inflamatorias diapedesis de leucocitos en los tejidos dañados y infectadas, en el presente documento iniciar una respuesta inmune celular a 1-3. La rapidez de la movilización de leucocitos determina el resultado positivo de las respuestas inmunes. Estos procesos complejos se basan en moléculas específicas (por ejemplo, selectinas, quimiocinas endotelio unida) presentes en el endotelio inflamado que ayudan para el establecimiento de contactos adhesivas entre leucocitos circulantes y el ....
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Protocolo
NOTA: Los procedimientos en animales se realizaron de acuerdo con el Comité de Ética Institucional de Cuidado de Animales en Ginebra, Suiza y la Oficina Veterinaria Cantonal. Número de Autorización de GE / 63/14.
1. Preparación de una suspensión de células individuales a partir de médula ósea
- Sacrificio del ratón (8-12 semanas de edad) por dislocación cervical. Esterilizar patas traseras con etanol al 70%. Retire la piel de las patas traseras.
- Diseccionar fémures y tibias del ratón y eliminar el tejido de las piernas con un bisturí. Enjuague piernas con etanol al 90% y el lugar en una placa de cultivo lleno de PBS.
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Resultados
El manuscrito describe un protocolo optimizado para controlar fácilmente el comportamiento de los monocitos y neutrófilos en las venas mesentéricas de ratones anestesiados en tiempo real. El uso de una cámara termostatizada-C 37 ° es obligatoria para mantener la temperatura del ratón y también debido al movimiento dependiente de la temperatura de los leucocitos. Preparación del ratón se muestra en la Figura 1. La Figura 2 muestra toda la zona visto bajo el microscopio. Luz transmitida p.......
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Discusión
Las metodologías descritas en este manuscrito proporcionan un enfoque coherente para estudiar de manera eficiente los monocitos y el comportamiento de los neutrófilos en las venas mesentéricas bajo condiciones de estado estacionario e inflamatorias.
El paso crucial de la preparación es la inmovilización del intestino con tejidos contacto con el medio PBS. Si se realiza correctamente, los vasos mesentéricos están muy bien expuestos en el cubreobjetos para la adquisición de imágenes. Esto perm.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por EMBO (a Y.E.), Foundation Machaon (a Y.E.) y SNSF (a B.A.I.). Agradecemos al Centro Central de Bioimágenes por la disponibilidad del microscopio Nikon A1r y la asistencia técnica. Agradecemos a la Sra. Clarissa Bartley por la corrección en inglés.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 5 ml de tubos de poliestireno de fondo redondo | Beckton Dickinson | 352058 | |
| 10x CFI Plan Apochromat 0.45 DT: 4mm | Nikon | ||
| 20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT: 1mm | Nikon | ||
| Cell Tracker Naranja CMRA Dye Life | Technologies | C34551 | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Kit de enriquecimiento de neutrófilos | para ratones Stem Cell Technologies | 19762 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| FCS | PAA | A15-042 | |
| Aceite de inmersión Tipo A | Nikon | cualquier aceite viscoso | |
| Sistema de control de temperatura Life | Box Life Imaging | ||
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NH4Cl | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Microscopio confocal Nikon A1R | Nikon | A1R | , platina motorizada x/y/z, software de elementos NIS |
| PBS Life Technologies | D8537 | ||
| de rojo de fenol DMEM/F12 | Life Technologies | 21041-025 | cualquier medio libre de rojo fenol es adecuado |
| PAM3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | reconstituir en PBS |
| células madre | suero de rata | incluidas en el kit de enriquecimiento de neutrófilos de ratón EasySep | |
| Placa de cultivo de tejidos 100 | TPP | 93100 |
Referencias
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Nourshargh, S., Hordijk, P. L., Sixt, M. Breaching multiple barriers....
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Reimpresiones y permisos
