Uso Individual sensillum grabación para detectar respuestas olfativo neurona de chinches de cama a Semioquímicos

Resumen

Las chinches dependen de las neuronas receptoras olfativas alojadas en su sensibilidad olfativa antenal para detectar semioquímicos en el medio ambiente. Utilizando el registro de un solo sensillum, demostramos un método para evaluar la respuesta de las chinches a los semioquímicos y exploramos el proceso de codificación involucrado.

Resumen

El sistema olfativo insecto desempeña un papel importante en la detección de semioquímicos en el ambiente. En particular, la sensilla antenal que alojan las neuronas individuales o múltiples en el interior, se consideran para hacer la mayor contribución en la respuesta a los estímulos químicos. Al registrar directamente potencial de acción en el sensillum olfatoria después de la exposición a los estímulos, grabación sensillum sola técnica (SSR) ofrece un enfoque poderoso para investigar las respuestas neurales de los insectos a los estímulos químicos. Para el insecto de la cama, que es un conocido parásito humano, se han caracterizado múltiples tipos de sensillum olfativo. En este estudio, hemos demostrado respuestas neurales de chinches sensilla olfativa a dos estímulos químicos y las respuestas dependientes de la dosis a una de ellas por el método de la RSS. Este enfoque permite a los investigadores para llevar a cabo la detección temprana de los estímulos químicos individuales en el olfativo sensilla chinches, que proporcionarían información valiosa para el desarrollo de nuevos atrayentes o repelentes de chinches y los beneficios de los esfuerzos de control de chinches.

Introducción

La chinche de cama común Cimex lectularius L (Hemiptera: Cimicidae), como un ectoparásito temporal, es un insecto hematófago obligado, lo que significa su supervivencia, desarrollo y reproducción requieren fuentes de sangre de los ejércitos, incluidos los seres humanos y los animales ^1,2. Aunque la transmisión del virus rara vez ha sido reportado por C. lectularius, las molestias morder generada por una infestación afecta gravemente a los ejércitos, tanto física como psicológicamente ^3. La introducción y el uso generalizado de insecticidas químicos, especialmente DDT, bajaron el riesgo de plagas y para el final de las infestaciones de 1950 se encontraban en un nivel tan bajo que ya no eran una grave preocupación pública. Sin embargo, una serie de posibles factores han llevado a resurgimiento en las poblaciones de chinches en todo el mundo, como la reducción del uso de insecticidas, una disminución de la conciencia pública, el aumento de la actividad de los viajes, y el desarrollo de resistencia a los insecticidas ^4-9.

Señales químicas en el medio ambiente son detectados y reconocidos por los insectos a través de órganos olfativos, como antenas y palpos maxilares. El olfativo sensilla en las antenas de insectos juegan un papel crucial en la detección de estas señales químicas. Las moléculas químicas entran en la cutícula antenal través de los poros en la superficie de la cutícula. Odorante proteínas de unión en el enlace linfático antenal a estas moléculas químicas y transportarlos a los receptores de olor ^10. Los receptores de olor y su co-receptor desde el canal iónico de cationes no selectivo en la membrana neuronal, que se despolariza una vez que estas moléculas químicas son reconocidos por los receptores de olor ^11.

Grabación sensillum Individual (SSR) fue desarrollado para detectar el cambio extracelular en el potencial de acción causada por la aplicación de cualquiera de los estímulos químicos o no químicos. Mediante la inserción de un electrodo de registro en la linfa sensillum y un electrodo de referenciaen alguna otra parte del cuerpo del insecto (por lo general, ya sea los ojos compuestos o el abdomen), la tasa de disparo de las neuronas en respuesta a estímulos se puede grabar ^12. Los cambios en el número de espigas representan la sensibilidad del insecto a estímulos específicos. Estímulos químicos de diferentes identidades y concentración provocarán diferentes respuestas neuronales, con diferentes tasas de disparo y las estructuras temporales, y por lo tanto pueden ser utilizados para investigar el proceso de codificación del insecto a los productos químicos específicos.

Para la chinche común, ambas formas sexuales comparten el mismo patrón de sensilla olfativo en las antenas: de nueve ranurado sensilla clavija C, 29-pelo como E (E1 y E2) sensilla, y un par cada uno de Dα, Dβ, Dγ peg suave sensilla ^13,14. Como múltiples neuronas han sido identificados en cada tipo de sensillum, no es fácil distinguir los potenciales de acción de diferentes neuronas alojados en la misma sensillum, por lo que para este experimento la totanúmeros l de potenciales de acción se contaron fuera de línea durante un período mseg 500 antes y después de la estimulación. A continuación, el número de potenciales de acción después de la estimulación se restará de la cantidad de potenciales de acción antes de la estimulación y se multiplica por dos con el fin de cuantificar los cambios en la velocidad de disparo en cada sensillum individual en espigas por segundo ^15.

Protocolo

1. Preparación de Instrumentos, Soluciones de estímulos, y los insectos de cama

1. Preparar una solución de 50% KNO ₂ (w / v) en una botella de 20 ml.
2. Afilar dos microelectrodos de tungsteno en solución KNO ₂ a 5 V por inmersión en repetidas ocasiones los electrodos de tungsteno dentro y fuera de la solución.
   1. Aproximadamente afilar el alambre de tungsteno por inmersión de aproximadamente 10 mm del alambre de tungsteno dentro y fuera de la solución de KNO ₂ a la velocidad de 2 inmersiones / seg durante aproximadamente 5 min, lo que puede consumir en gran medida el extremo frontal del alambre de tungsteno.
   2. Delicadamente afilar el electrodo mediante la inmersión de aproximadamente 1 mm de la punta del alambre dentro y fuera de la solución a la velocidad de 2 inmersiones / seg durante al menos 1 min con el fin de hacer un punto del electrodo fino y agudo. Compruebe el diámetro de la punta del electrodo con el microscopio con frecuencia hasta que llega a 0,2 a 0,5 micras, que debe ser lo suficientemente fina como para perforar la cutícula del insecto de la cama sensillum olfativo.
      Nota: Si bien afilada manualmenteEning el electrodo, la velocidad de inmersión del alambre de tungsteno en la solución de KNO ₂ no es constante todo el tiempo. Con más práctica, es mucho más fácil mantener una velocidad relativamente constante en el afilado del electrodo. La hora de afilar también es incierto en función de cómo bien debe ser el electrodo. Aquí, una punta de electrodo con el diámetro de ~ 0,2 micras es suficiente para perforar a través de la sensillum olfativo.
3. Diluir cada uno de los estímulos químicos en sulfóxido de dimetilo (DMSO) a partir del compuesto ordenado a una concentración inicial de 01:10 v / v como una solución madre. Crear una serie de diluciones decimal dependiendo del número de dosis requeridas en el experimento, de nuevo con DMSO, a partir de cada una de las soluciones madre para cada producto químico. Aquí, utilizar 10% (+) - β-pineno y eucaliptol.
4. Coloca los días sin alimentar o siete después de la alimentación de las chinches adultos (ya sea hombre o mujer) de la Ft. Colonia Dix (un regalo del doctor Haynes en la Universidad de Kentucky) que se utilizará en tque experimentar en una placa de Petri.
   Nota: No hay un número exacto de chinches colocados en la placa de Petri. Puede ser un poco o mucho.

2. Cama Bug Preparación Antenas

1. Anestesiar las chinches en el hielo (2-3 min).
2. Fijar tanto las antenas y el cuerpo del insecto en un cubreobjetos de microscopio con cinta de doble cara y retire las piernas con unas tijeras finas.
3. Use una aguja pequeña para tocar suavemente las antenas a fin de que se peguen en la cinta de manera constante.
4. Descansa el cubreobjetos contra una pequeña bola (~ 1 cm de diámetro) de cera dental para facilitar la manipulación y ajustarlo a un ángulo apropiado (~ 90 °) para el electrodo de registro (Figura 1).
5. Una vez asegurado, coloque la chinche de cama bajo un microscopio estéreo, encienda la fuente de luz fría y ajustar la intensidad de la iluminación hasta que la antena se presenta claramente, y el enfoque del microscopio en el segundo flagelo de la antena de chinches a gran aumento (720X) .
   Nota: La intensidad de la iluminación utilizada en el experimento no se cuantifica, lo que realmente depende de cómo los ojos del experimentador sentir la intensidad de la iluminación.

3. Individual sensillum grabación

1. Conectar el preamplificador (10X) con el controlador de adquisición de la señal, que está conectado con el ordenador para la grabación de la señal y visualización. Encienda el ordenador e inicie el software, por ejemplo, AutoSpike32 y haga clic en el modo de "Grabar" en la barra de menú. A continuación, elija la "onda" con el fin de iniciar la grabación de las señales de onda.
   Nota: Una línea plana que va desde la izquierda a la derecha de la pantalla en varias ocasiones ahora debe ser visible. Aquí, la ventana de grabación tiene una duración de 40 seg. Grabación Max onda es 10 seg. Frecuencia de muestreo seleccionada es 96.000 y la tasa de muestreo digital es 240. No es la posición 0% y sin filtrar, sin rectificación de las señales de grabación. Todos estos ajustes de los parámetros en el software pueden ser modificados según sea necesario.
2. Activar el altavoz conectado al preamplificador, que se utiliza para presentar el modo de tono para las respuestas neuronales a partir de sensillum antenal.
3. Inserte el electrodo de referencia en el abdomen del insecto de la cama estabilizado.
   Nota: El electrodo de referencia se llevó a cabo por un soporte del metal se adhiere magnéticamente a la mesa de aire.
4. Después de que el electrodo de referencia se ha conectado al abdomen del insecto de la cama, mover el electrodo de registro, que está conectado al preamplificador y manipulada por un micromanipulador, hacia el extremo posterior de la antena del insecto de la cama.
5. Cuando el electrodo de registro está en contacto con la punta derecha de la antena, encienda el microscopio y localizar el electrodo a bajo aumento.
6. Ajuste el electrodo de registro al tiempo que aumenta gradualmente la magnificación hasta que tanto el electrodo y la sensillum antenal están en el mismo plano y claramente visible bajo el microscopio.
   Nota: En ese momento, el microscopio es habitualmente con el máximo aumento.
7. Inserte el electrodo de registro en el eje del sensillum usando el micromanipulador e ir un poco más si el ruido de fondo es alto en comparación con el potencial de acción.
8. Una vez que los potenciales de acción claras se observan desde el sensillum grabada, llenar una micropipeta con 10% (+) - β-pineno. Utilice la micropipeta para depositar 10 l alícuota de 10% (+) - β-pineno sobre una tira de papel de filtro (~ 3 x 15 mm) colocado dentro de una pipeta Pasteur de vidrio.
   1. Conectar la pipeta cargada a la salida del tubo de flujo de impulsos del controlador de estímulo y coloque la punta de la pipeta en el pequeño orificio en el tubo orientado hacia la antena.
9. Cuando todas estas conexiones se han estabilizado, presione el pedal del controlador de estímulo para entregar un soplo 0,5 seg de estímulo (0,5 L / min) en la corriente de aire humidificado continua. El registro de los potenciales de acción se iniciará simultáneamente cuando el footswitch es deprimido. El proceso de grabación será el último durante 10 segundos a partir del 1 seg antes de la estimulación.
10. Cuente los potenciales de acción fuera de línea durante dos períodos de 500 ms, una antes y otra después de la estimulación. Restar cualquier cambio en la tasa de pico durante el ms post-estimulación 500 de la actividad espontánea registrado durante los 500 ms precedentes y convertir los conteos en la escala convencional de espigas / s multiplicándolos por 2.

Reemplazo 4. Estímulo en el SSR

1. Una vez que el interruptor de pedal ha sido activado, entregar el 10% de (+) - β-pineno en la pipeta sobre la antenas bug cama y registrar la respuesta a este odorizante específico para 10 seg, después de lo cual se retira la pipeta.
2. Etiquetar otra nueva pipeta con el eucaliptol 0,001% a ensayar. Coloque un pequeño trozo de papel de filtro sobre el que se ha aplicado 10 l de estímulo, en la nueva pipeta.
3. Espere 2-5 minutos hasta que el estímulo es completamente vaporized en la pipeta de vidrio. Coloque la pipeta sobre la salida del tubo de flujo de pulso.
4. Inserte la punta de la pipeta en el pequeño orificio del tubo orientada hacia la antena. Pise el pedal y empezar la grabación de 10 segundos.
5. Desconecte la pipeta y preparar otra pipeta con 0,01% eucaliptol.
6. Prueba de todo el resto de las dosis de eucaliptol (de 0,001% a 10%) en la sensilla antenal para observar las respuestas dependientes de la dosis. Prueba de la más diluida, a las dosis menos diluidas.

Resultados

Grabación individual sensillum es una poderosa técnica de investigación utilizada en los estudios de ecología química de insectos y fisiología neuronal. La investigación de las respuestas neurales de los insectos a los diferentes compuestos volátiles, especialmente los que piensa que es ecológico relacionado con la supervivencia y el desarrollo de los insectos, no sólo nos da una visión muy valiosa en el proceso de olfato de insectos, pero también abre nuevas vías prometedoras que potenc...

Discusión

La técnica individual sensillum grabación ha sido ampliamente utilizado en la prueba de las respuestas neurales de insectos como las moscas de la fruta, mosquitos y chinches a diferentes estímulos químicos en el medio ambiente. Estos estímulos químicos a menudo se disuelven y se diluyen en un disolvente común a fin de preparar diferentes dosis de los tratamientos. Sin embargo, diferentes disolventes pueden producir muy diferentes tasas de liberación de los estímulos. Estudios anteriores sobre algunos insectos estudiados...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Alambre de tungsteno	A-M SYSTEMS	#716500	Se utiliza para preparar el electrodo
KNO2	Sigma	#310484	Se utiliza para afilar el alambre de tungsteno
Fuente de alimentación de CA	BK Precision	1653A	Proporcionar el voltaje en el afilado del alambre de tungsteno
Microscopio Leica Z6 APO	Leica		10447424 Se utiliza para observar la sensibilidad en las antenas
Controlador Simulus		Syntech CS-55	Se utiliza para controlar la aplicación
estímulos Controlador de adquisición USB de 4 canales	Syntech	IDAC-4	Visualización en pantalla en tiempo real de todas las señales antes y durante la grabación Fuente de
luz	SCHOTT	A20500	Proporcionar fuentes de luz para la observación
Micromanupulador	Leica 115378		Se utiliza para movimientos menores de
electrodo Altavoz	Juster	95a	Conectado con el controlador de adquisición IDAC-4 y que proporciona sonido para la señal
Soporte magnético	Narishige	GJ-1	Se utiliza para sujetar el electrodo de referencia, la chinche estabilizada y el tubo de suministro de estímulos
TMC Mesa de aislamiento de vibraciones	TMC	63-500	Se utiliza para aislar la vibración de los equipos
Coverslip	Tedpella	2225-1	Se utiliza para sujetar la chinche
Cinta adhesiva de doble cara	3M	XT6110	Se utiliza para estabilizar la chinches en el clip de cubierta
Cera dental	Dentakit	DK-R012	Se utiliza para sostener el clip de cobertura donde se estabiliza la chinche