Injerto de Cuentas en desarrollo Miembros de embrión de pollo para identificar señales de transducción Pathways afectan la Expresión Génica

Resumen

Mediante el injerto de perlas empapadas en factores de crecimiento o inhibidores específicos de las vías de señalización en embriones en desarrollo, es posible probar directamente sus efectos in vivo. En este protocolo, las perlas se injertan en la yema de la extremidad para determinar los efectos de estas moléculas en la expresión génica y la transducción de señales.

Resumen

El uso de embriones de pollo es posible probar directamente los efectos de cualquiera de los factores de crecimiento o inhibidores específicos de las vías de señalización sobre la expresión génica y la activación de vías de transducción de señal. Esta técnica permite la entrega de moléculas de señalización en las etapas de desarrollo definidas con precisión para momentos específicos. Después de esto, los embriones pueden ser cosechadas y examinaron la expresión de genes, por ejemplo mediante hibridación in situ, o activación de las vías de transducción de señales observados con la inmunotinción.

En vídeo perlas de heparina empapados en FGF18 o AG perlas 1-X2 empapados en U0126, un inhibidor de MEK, están injertados en el esbozo de la extremidad in ovo. Esto demuestra que FGF18 induce la expresión de MyoD y la fosforilación de ERK y la expresión MyoD tanto endógenas como inducida FGF18 es inhibida por U0126. Cuentas empapados en un antagonista del ácido retinoico pueden potenciar la inducción prematura MyoD por FGF18.

Este enfoque puede ser nosotrosed con una amplia gama de diferentes factores de crecimiento e inhibidores y se adapta fácilmente a otros tejidos en el embrión en desarrollo.

Introducción

Embriones de aves han proporcionado una poderosa herramienta para el estudio del desarrollo durante muchos años ^1. Una de sus características más útiles es que son relativamente fáciles de manipular. Desarrollo externo hace que sea posible abrir el huevo para acceder al embrión y realizar diversas micromanipulaciones incluyendo ejemplos tales como el sistema quimera codorniz-chick clásico para estudiar el destino celular ^2,3, la inyección de los retrovirus para la sobreexpresión en tejidos específicos durante el desarrollo ^4,5 y la cultura explante para identificar las fuentes de señalización de desarrollo ^6. Más recientemente quimeras generada entre hosts sin marcar con injertos de una línea de pollo transgénico que expresa GFP ha demostrado que la combinación de injerto clásica y la modificación genética puede proporcionar importantes conocimientos sobre el desarrollo de ^7,8.

La facilidad con la que el embrión aviar puede ser manipulado ha hecho que sea un modelo excelente para el estudio de las extremidadesdesarrollo ^9. La aplicación de factores de crecimiento específicos para los miembros en desarrollo in vivo ha sido fundamental en los factores que alteran los patrones extremidad ^10,11 y continúa proporcionando conocimientos sobre este proceso ¹² identificación. Este enfoque también se ha utilizado para estudiar los factores que regulan el desarrollo muscular y ha descubierto roles para numerosas señales tales como Wnts ^13, BMPs ¹⁴ y ¹⁵ HGF.

Recientemente, esta técnica se ha utilizado para investigar las señales que controlan la expresión génica en myogenic la yema del miembro y ha demostrado que las interacciones entre FGF18 y el ácido retinoico puede controlar el momento de la expresión de MyoD ^16. Usando una combinación de factores de crecimiento y moléculas pequeñas que se pueden cargar en perlas y luego injertados directamente en los tejidos específicos en las etapas de desarrollo definidas da la oportunidad de intervenir en casi cualquier momento y la región durante el desarrollo. Esto ha sido utilizado para investigate muchos procesos incluyendo somito patrones ^17,18, especificación neural ^19, la migración de la cresta neural ²⁰ y la extensión del eje ^21.

Aquí se describe un método para injertar perlas empapadas en cualquiera de los factores de crecimiento o inhibidores en el desarrollo de las extremidades de pollo. Esto ha sido utilizado para determinar los efectos de estas señales en la miogénesis mediante el análisis de la expresión génica específica de músculo con hibridación in situ. Se describen injertos utilizando heparina empapada perlas, que se utilizan para factores de crecimiento, o perlas de AG 1-X2 para las pequeñas moléculas hidrófobas tales como el ácido retinoico o inhibidores de moléculas pequeñas de las vías de señalización específicas. Sin embargo otras perlas están también disponibles que se han utilizado para ofrecer tanto FGFs ²² y ²³ Shh.

Protocolo

Declaración de Ética: Todos estos experimentos siguen el cuidado de los animales y las directrices éticas de la Universidad de Nottingham.

1. Preparación de perlas de heparina para Injerto

1. Lávese las perlas de heparina a fondo en PBS antes de su uso. Nota: los granos se pueden almacenar a 4 ° C como una suspensión en PBS.
   1. Seleccione los granos para el injerto por sacarlos de la población con una pipeta de 20 l en una gota 1 ml de PBS. A continuación, utilice una micropipeta establece en 2 l para transferir perlas en una gota 20 l de PBS en una placa de Petri 3 cm. Elija cuentas basadas en el tamaño y, usando un estéreo microscopio de disección, la transferencia de granos seleccionados con una punta de pipeta P2; los cerca de 100 m de diámetro son ideales.
2. Retire la PBS de las perlas. Retire la mayor parte del líquido con una pipeta de 20 l y el líquido residual por capilaridad con relojeros pinzas finas. Nota: Es importante eliminar tanto como sea posible por lo que el crecimiento de factor no se diluye cuando se añade a las perlas.
3. Pipetear el factor de crecimiento directamente sobre las perlas. Para FGF18 añadir 0,5 l de FGF18 recombinante reconstituido a 0,5 mg / ml en 0,1% de BSA en PBS. Coloque varias gotas de agua alrededor de los bordes del plato para evitar que el líquido se evapore.
4. Se incuban las perlas durante 1 hora a RT. Retire las gotas de agua del plato con una pipeta Pasteur y colocar en hielo listo para el injerto.
5. Si se requiere la transferencia (por bolas transparentes) 4-5 perlas al 2% de fenol rojo antes de injertar para ayudar a visualizar ellos. Enjuague en PBS antes de transferir al embrión.

2. Preparación de Cuentas AG 1-X2 para Injerto

1. Antes de su uso derivatizar perlas con 0,2 N de ácido fórmico.
   1. Para ello use una espátula para transferir cuentas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 1 ml de 0,2 N de ácido fórmico y lavado en una plataforma de agitación durante 1 hora.
   2. A continuación, retire el ácido fórmico con una pipeta p1000 y reemplazar con 1ml de agua. Lave durante 1 hora y repetir seis veces para eliminar el resto de ácido fórmico.
   3. Retire el líquido residual con una pipeta p1000 y almacenar los granos a 4 ° C. Nota: No es necesario eliminar toda el agua residual en esta etapa.
2. Retirar una pequeña pellet de perlas de aproximadamente 5-10 l de volumen de las existencias utilizando una pequeña espátula en una placa Petri 3 cm y añadir 1 ml de DMSO (o cualquier disolvente el fármaco se disuelve en). Nota: Esto debería proporcionar varios cientos de cuentas de las que permite seleccionar las del tamaño adecuado.
3. A continuación, utilice una pipeta P2 se establece en 2 l de transferir cuentas de aproximadamente 100 m de diámetro a una caída de 20 l de disolvente en otra placa de Petri 3 cm.
4. Eliminar el disolvente con una pipeta de 20 l y cualquier disolvente residual con una pipeta de 2 l. Reemplazar con 20 l de la droga que se aplicarán.
   NOTA: Para obtener la consistencia disolver el fármaco a una concentración de 100 mM en DMSO (o que se utiliza cada vez disolvente),alícuota en 20 l y se almacena a -80 ° C, ya que algunos inhibidores de moléculas pequeñas son inestables y es mejor evitar repetida congelación-descongelación. Si es necesario después diluir la droga a la concentración deseada antes de remojo los granos. Las concentraciones eficaces pueden necesitar ser determinado empíricamente para cada fármaco.
5. Incubar durante 1 hora. Proteger de la luz ya que muchas de estas moléculas son sensibles a la luz.
6. Antes de injerto de transferencia 4-5 perlas con una pipeta p2 establece en 2 l en 20 l de 2% de fenol rojo disueltos en agua. Realice este paso usando un microscopio de disección estéreo para visualizar las cuentas. Eliminar un solo grano con relojeros pinzas finas o un asa de alambre y enjuague en PBS antes de ser transferido al embrión. No deje perlas en un 2% de rojo fenol durante más de 15 minutos antes de su uso ya que esto puede causar la pérdida de la actividad.

3. Preparación de tungsteno Agujas

1. Cortar alambre de tungsteno fino en 3-4 cm de longitud. Inserte un trozo de alambre en el extremo deuna pipeta Pasteur de vidrio y se funden en un mechero Bunsen para fijar en su posición. Prepara hasta 10 agujas para asegurarse de que hay piezas de repuesto si están dañados durante el uso.
2. Coloque el extremo del cable en una llama de soplete y mantenerlo allí hasta que el tungsteno se ilumina en blanco y la punta es aguda (unos 2-3 minutos). Nota: Durante el uso de la aguja se puede limpiar y volver a afilarse en el soplete, según sea necesario.
   NOTA: Estas agujas también pueden ser utilizados para hacer bucles para la transferencia de perlas. Toque suavemente la aguja para el banco y que se dobla para formar un bucle.

4. Los embriones Preparación de los injertos del grano

1. Incubar huevos con el extremo romo hacia arriba hasta que alcanzan la etapa deseada (3-5 días para la mayoría de las manipulaciones extremidad Bud). Con unas pinzas contundente golpe en el extremo romo de romper la cáscara y luego usar las pinzas para quitar la cáscara y exponer el embrión. Asegúrese de que la membrana de la cáscara de huevo también se elimina.
   NOTA: 1-2 ml de PBS se puede agregar con una pipeta Pasteur para ayudar conesto si la membrana se adhiere a la yema. Pipeta suavemente la PBS sobre la superficie de la yema, sujete la membrana con las pinzas, teniendo cuidado de no dañar la yema, y ​​tire de él lejos del huevo.
2. Remover hasta 5 ml de albumen del huevo con una jeringa de 10 ml y una aguja de 19 G. Tome sólo tanto como sea necesario para asegurar que el embrión no tiene contacto con la cinta utilizada para sellar el huevo como la eliminación de grandes cantidades puede reducir las tasas de supervivencia de embriones.
3. Para visualizar el embrión añadir unas 5-6 gotas de artistas tinta china 15 ml de PBS que contenía 100 U de penicilina y estreptomicina 0,1 mg / ml. Inyectar 0,5 a 1 ml directamente bajo el embrión con una jeringa de 1 ml y una aguja de 25 G.
4. Añadir 2-3 ml de PBS con 1% de suero de ternera fetal y 100 U de penicilina y estreptomicina 0,1 mg / ml en el huevo para asegurar el embrión no deshidratar. Usando afiladas pinzas de relojero quitar la membrana vitelina y abrir el amnios en los esbozos de los miembros en desarrollo. Asegúrese de que el embrión no se seque y, Si es necesario, agregue más PBS / FCS.
   NOTA: Las yemas de las extremidades se pueden ver claramente como excrecencias emparejados en el flanco del embrión. En estas etapas el embrión se convertirá el lado este derecho es normalmente más alta. Como resultado normalmente es más fácil para injertar cuentas en las extremidades derechas y utilizar las que quedan como controles contralaterales.
5. Use un alambre de tungsteno afilado hacer una incisión en la yema de la extremidad en la que se implanta la perla. Evite cortar todo el camino a través de la yema de la extremidad cuando sea posible, aunque en etapas más jóvenes esto es difícil.
   NOTA: En los embriones de más edad (estadio HH 22 y más) es posible seleccionar regiones específicas de la yema de la extremidad para injertar, pero en etapas más jóvenes esto es más difícil, ya que la extremidad del brote en sí es pequeña. También es importante recordar que el primordio de la extremidad crecerá más allá del talón injertado así, especialmente en las etapas más jóvenes, el cordón se mantendrá en la extremidad proximal.
6. Recoge un grano, ya sea del factor de crecimiento o de drogas utilizando wa extra finotchmakers fórceps o un lazo hecho de una aguja de tungsteno. Si el cordón se ha empapado en DMSO o rojo de fenol, enjuague en PBS antes de aplicar para el embrión. Transferir el talón al embrión con el fórceps / asa de alambre. A continuación, utilice el alambre de tungsteno afilada para insertar el cordón en la incisión.
7. Añadir 1-2 ml de PBS / FCS al huevo asegurar que el embrión se mantiene hidratado pero evite aplicar directamente sobre el propio embrión ya que esto puede dañar los embriones y causar el talón sea desalojado. Sellar el huevo con cinta y volver a la incubadora.

Resultados

En la etapa HH 21 MyoD no se expresa en el desarrollo de las extremidades mioblastos aunque la tinción se puede ver en la miotoma de los somitas en desarrollo (Figura 1A). La Figura 1B muestra la hibridación in situ para MyoD 6 hr después de un injerto de talón FGF18. MyoD se induce en mioblastos cercanos a la perla, mientras que no hay expresión en el miembro contralateral. Co-injerto de un grano empapado en U0126, un inhibidor específico de MEK, bloques FGF18 inducción de Myo...

Discusión

El uso de injertos de cuentas aplicados directamente al desarrollo de tejidos in ovo es una herramienta poderosa para diseccionar el papel de la señalización del factor de crecimiento durante el desarrollo dando un control sin precedentes sobre el estado de desarrollo en que se aplican y la duración de la exposición.

La elección del talón para cada tipo de molécula es importante. Moléculas hidrofóbicas pequeños, tales como los inhibidores aquí descritos y el ácido retinoico, por lo general s...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Perlas acrílicas de heparina	Sigma	H5263	Las perlas acrílicas de heparina utilizadas han sido descontinuadas. Sin embargo, hay un producto de reemplazo disponible, perlas de heparina y agarosa, n.º de gato H6508. Son transparentes, por lo que es más difícil trabajar con ellos, pero se pueden teñir con rojo fenol de la misma manera que las cuentas AG 1-X2,Cuentas
AG 1-X2	Bio-Rad	140-1231
Affi Gel cuentas azules	Bio-Rad	153-7301; 153-7302	Estas perlas se han utilizado con una variedad de factores de crecimiento, incluidos Shh y FGF, y se pueden usar para reemplazar las perlas de heparina
FGF18	Peprotech	100-28	Vuelva a suspender en PBS con 0/1% de BSA, prepare alícuotas de un solo uso de 0.5-1ul y almacene a -80 ° C. Los lotes y los proveedores pueden variar, por lo que se deben probar diferentes concentraciones para determinar una dosis efectiva.
U0126	Señalización celular	9903	Hacer hasta 20mM de stock en DMSO y almacenar en alícuotas de un solo uso a -80°C. Proteger de la luz.
BMS-493	Tocris Biosciences	3509	Resuspender en DMSO y almacenar en alícuotas de un solo uso a -80°C. Proteger de la luz.
Tinta china negra	Windsor y Newton	5012572003384 (30 ml)	Aunque existen alternativas a este producto, se debe tener cuidado ya que algunas tintas son tóxicas para los embriones
Alambre de tungsteno, 0,1 mm de diámetro. 99,95%	Alfa Aesar	10404
Penicilina / estreptomicina	Sigma	P0781	Diluido 100X en PBS/tinta y PBS/FCS