Este protocolo utiliza técnicas de análisis y proyección de imagen (3D) tridimensionales para visualizar y cuantificar las mitocondrias del nervio específico. Las técnicas son aplicables a otras situaciones donde una señal fluorescente se utiliza para aislar un subconjunto de los datos de otra señal fluorescente.
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Artículo de método
Proyección de imagen tridimensional y análisis de las mitocondrias en las fibras de nervio humano Intraepidermal
En este artículo
Resumen
Resumen
El objetivo de este protocolo es estudiar las mitocondrias dentro de las fibras nerviosas intraepidermal. Por lo tanto, se desarrollaron técnicas de análisis y proyección de imagen 3D para aislar mitocondrias nerviosas específicas y evaluar alteraciones inducidas por la enfermedad de las mitocondrias en el extremo distal de los nervios sensitivos. El protocolo combina fluorescencia inmunohistoquímica, microscopia confocal y técnicas de análisis de imagen en 3D para visualizar y cuantificar las mitocondrias del nervio específico. Parámetros detallados se definen a través de los procedimientos con el fin de ofrecer un ejemplo concreto de cómo utilizar estas técnicas para aislar mitocondrias del nervio específico. Anticuerpos se utilizaron para etiqueta del nervio y señales mitocondriales dentro de secciones del tejido de la piel del sacador biopsias, que fue seguido por inmunofluorescencia indirecta para visualizar los nervios y las mitocondrias con una señal fluorescente verde y roja respectivamente. Se adquirieron imágenes de serie Z con microscopia confocal y análisis 3D fue utilizado para procesar y analizar las señales. No es necesario seguir los parámetros exactos descritos dentro, pero es importante ser coherentes con los elegidos a lo largo de la tinción, adquisición y análisis de los pasos. La fuerza de este protocolo es que es aplicable a una variedad amplia de circunstancias donde una señal fluorescente se utiliza para aislar otro tipo de señales que de otro modo sería imposible estudiar solos.
Introducción
Las mitocondrias sirven funciones celulares vitales que incluyen la producción de energía celular, buffer de calcio y regulación necrosis y apoptosis celular muerte1,2,3. El sistema nervioso tiene una tasa metabólica alta en comparación con el cuerpo4 , lo que sugiere que las neuronas generan un alto grado de energía celular en forma de trifosfato de adenosina (ATP) a través de la respiración mitocondrial. Muchos documentos de evidencia que las funciones neuronales dependen de ATP5, especialmente en las sinapsis
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Protocolo
las biopsias del sacador de la piel fueron obtenidas de sujetos que fueron reclutados de una red de gran atención primaria comunitaria en el centro de Diabetes de la Universidad de Utah (Salt Lake City, UT). Este estudio fue aprobado por la Junta de revisión institucional de la Universidad de Michigan y el cumplimiento de los principios de la declaración de Helsinki. Se obtuvo consentimiento informado de cada sujeto antes de la prueba por escrito.
1. inmunohistoquímica de fluorescencia
- preparar las biopsias del sacador de intraepidermal fibra nerviosa inmunohistoquímica:
- piel de 3 mm realizar biopsias po....
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Resultados
Visualización y cuantificación de las mitocondrias dentro de IENFs humanos
Inmunohistoquímica de fluorescencia permite la rotulación simultánea de múltiples señales en las biopsias de la piel humana para visualizar los nervios, las mitocondrias y núcleos. Una placa de 96 pocillos es una manera conveniente de organizar los pasos en el procedimiento de inmunohistoquímica. La figura 1 .......
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Discusión
Este protocolo está diseñado para aislar, cuantificar y analizar el tamaño y la distribución de las mitocondrias del nervio específico dentro de IENFs en 3D de las biopsias de la piel humana. Hay varios pasos críticos en el protocolo. La inmunohistoquímica de fluorescencia flotante está diseñado para la mancha y analizar varias señales en cada muestra, proporcionando una metodología más versátil para la investigación exploratoria44,45. Este procedimiento permite .......
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Divulgaciones
No hay conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud subvenciones K08 NS061039-01A2, el programa de investigación de Neurología & descubrimiento y el Instituto A. Alfred Taubman Medical Research en la Universidad de Michigan. Este trabajo utiliza la morfología y la base de análisis de imagen del centro de investigación de la Diabetes de Michigan, financiado por los institutos nacionales de salud beca 5P 90 DK-20572 del Instituto Nacional de Diabetes y digestivo y enfermedades del riñón. Los autores desean agradecer a J. Robinson Singleton y Gordon A. Smith (Universidad de Utah) por su generosa donación de muestras de piel humana.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 2% Suministro de fijador para recién llegados de Zamboni | , Middleton, WI | 1459A | 2% de paraformaldehído, 0,2% de ácido pícrico saturado en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4 |
| 10x solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP399-4 | Para componer 1x PBS |
| Image-iT FX Signal Enhancer | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | I36933 | mejora las señales de colorante Alexa Fluor al reducir la unión no específica |
| Anticuerpo del producto de gen antiproteico 9.5 (policlonal de conejo) | Proteintech Group Inc. Rosemont, IL | 14730-1-AP | abreviado como PGP9.5, sustituye al descontinuado AbD Serotec (Cat. Nº 7863-0504) anticuerpo |
| antipiruvato deshidrogenasa E2/E3bp Anticuerpo (monoclonal de ratón) | abcam, Cambridge, MA | AB110333 | abreviado como PDH |
| Anticuerpo secundario anti-ratón de cabra Alexa Fluor 594 conjugado | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | A-11034 | anticuerpo secundario conjugado fluorescente rojo anti-conejo |
| Anticuerpo secundario Alexa Fluor 488 conjugado | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | A-11032 | anticuerpo secundario fluorescente verde |
| Albúmina, de suero bovino | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A7906-100 | abreviado como BSA |
| Triton X- 100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T9284 | abreviado como TX-100 |
| 0.22 µ m Filtro | EMD Millipore, Billerica MA | MILLEX GP SLGP 033NS | 0.22 µ m Filtro Millipore |
| Parafilm M | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 13-374-10 | Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996) |
| Bucle no calibrado | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 22-032092 | Bucle de inoculación de Decon LeLoop (MP 199-25) |
| Placa de ensayo de 96 pocillos | Corning Incorporated, Corning, NY | 3603 | Placa de fondo plano de 96 pocillos |
| Reactivo antidecoloración Prolong Gold con DAPI | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | P-36931 | DAPI tinción de núcleos |
| Microscopio Cubreobjetos 50 x 24 mm | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12-544E | Cubreobjetos |
| Superfrost Plus Portaobjetos de microscopio | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12-550-15 | Portaobjetos de microscopio |
| Leica SP5 Microscopio confocal de escaneo láser | Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL | SP5 | Microscopio Confocal |
| Volocity x64 Software | Perkin Elmer, Waltham , MA | versión 4.4.0 | El software Volocity se utiliza para los pasos 3.1 y 3.2 en el protocolo para el procesamiento de imágenes |
| Imaris x64 Software de análisis tridimensional | Bitplane, Concord, MA | versión 7.7.1 | software Imaris se utiliza para los pasos 3.3 a 3.5 en el protocolo para el análisis de imágenes |
| Excel | Microsoft, Redmond, WA | versión Office 2013 | El software de hoja de cálculo de Excel se utiliza para el paso 3.6 en el protocolo para resumir las características morfométricas |
| Compuesto de temperatura de corte óptima | Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA | 4583 | abreviado como OCT |
| Leica Cryostat | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL | CM1850 | Criostato para corte 50 y micro; m secciones |
| CellLight Mitocondrias-GFP, BacMam 2.0 | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | C10600 | Se utiliza como control positivo para marcar mitocondrias con una señal fluorescente verde |
Referencias
- Nicholls, D. G., Budd, S. L. Mitochondria and neuronal survival. Physiol Rev. 80 (1), 315-360 (2000).
- Chan, D. C. Mitochondrial fusion and fission in mammals. Ann Rev Cell Dev Biol. 22, 79-99 (2006).
- Ni, H. M., Williams, J. A., Ding, W. X.
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Reimpresiones y permisos
