Method Article

Proyección de imagen tridimensional y análisis de las mitocondrias en las fibras de nervio humano Intraepidermal

DOI:

10.3791/53369

⸱

September 29th, 2017

 ,  ,  , 
1University of Michigan Medical School, 2Department of Neurology, University of Michigan, 3Department of Internal Medicine, University of Michigan

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo utiliza técnicas de análisis y proyección de imagen (3D) tridimensionales para visualizar y cuantificar las mitocondrias del nervio específico. Las técnicas son aplicables a otras situaciones donde una señal fluorescente se utiliza para aislar un subconjunto de los datos de otra señal fluorescente.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El objetivo de este protocolo es estudiar las mitocondrias dentro de las fibras nerviosas intraepidermal. Por lo tanto, se desarrollaron técnicas de análisis y proyección de imagen 3D para aislar mitocondrias nerviosas específicas y evaluar alteraciones inducidas por la enfermedad de las mitocondrias en el extremo distal de los nervios sensitivos. El protocolo combina fluorescencia inmunohistoquímica, microscopia confocal y técnicas de análisis de imagen en 3D para visualizar y cuantificar las mitocondrias del nervio específico. Parámetros detallados se definen a través de los procedimientos con el fin de ofrecer un ejemplo concreto de cómo utilizar estas técnicas para aislar mitocondrias del nervio específico. Anticuerpos se utilizaron para etiqueta del nervio y señales mitocondriales dentro de secciones del tejido de la piel del sacador biopsias, que fue seguido por inmunofluorescencia indirecta para visualizar los nervios y las mitocondrias con una señal fluorescente verde y roja respectivamente. Se adquirieron imágenes de serie Z con microscopia confocal y análisis 3D fue utilizado para procesar y analizar las señales. No es necesario seguir los parámetros exactos descritos dentro, pero es importante ser coherentes con los elegidos a lo largo de la tinción, adquisición y análisis de los pasos. La fuerza de este protocolo es que es aplicable a una variedad amplia de circunstancias donde una señal fluorescente se utiliza para aislar otro tipo de señales que de otro modo sería imposible estudiar solos.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las mitocondrias sirven funciones celulares vitales que incluyen la producción de energía celular, buffer de calcio y regulación necrosis y apoptosis celular muerte1,2,3. El sistema nervioso tiene una tasa metabólica alta en comparación con el cuerpo4 , lo que sugiere que las neuronas generan un alto grado de energía celular en forma de trifosfato de adenosina (ATP) a través de la respiración mitocondrial. Muchos documentos de evidencia que las funciones neuronales dependen de ATP5, especialmente en las sinapsis6. Por lo tanto, es importante la distribución de las mitocondrias dentro de las neuronas.

En los últimos 10 años que una gran cantidad de información ha demostrado que la trata y acoplamiento de las mitocondrias neuronales se regula altamente. Proteínas motoras están implicadas en la distribución de las mitocondrias a compartimentos celulares específicos a lo largo de la neurona. Trata de las mitocondrias es particularmente importante porque las neuronas proyecto axones y las dendritas del soma. Proteínas motoras quinesina dirigen principalmente anterógrada (de soma) trata de mitocondrias a lo largo de los microtúbulos y dineína proteínas motoras directas motilidad retrógrada (hacia el soma)7,8,9 , 10. hay señales celulares tal potencial de membrana mitocondrial y conducción de los impulsos que influyen en la presencia y dirección de mitocondrial tráfico11,12,13.

Además de transportar las mitocondrias, hay proteínas especializadas para localizar las mitocondrias a compartimentos celulares específicos que tienen las demandas de alta energía, tales como nodos de Ranvier y las sinapsis8,14, 17. de hecho, la mayoría de las mitocondrias dentro de axones son no-motile9,13,18. Proteínas especializadas como mitocondrias de anclaje syntaphilin a microtúbulos a lo largo de axones mientras que otras proteínas de anclaje las mitocondrias a la actinia citoesqueleto19–21. Iones como el calcio y factores de crecimiento se han divulgado para apoyar la cesación del movimiento de las mitocondrias para localizar a las regiones donde son necesarios21,22,23.

Tomados en conjunto, la trata y acoplamiento de las mitocondrias son vitales para el funcionamiento correcto de las neuronas. En apoyo de esto, interrupción en el tráfico mitocondrial se ha asociado con varias enfermedades neurológicas como la enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, enfermedad de Huntington, espástica hereditaria paraparesia y atrofia óptica15,24,25,26,27. Estudios recientes se han centrado en la patología y disfunción mitocondrial como un mecanismo potencial para la neuropatía diabética, la pérdida sensorial asociada con diabetes28,29,30,31 ,32,33. La hipótesis es que la diabetes altera la distribución de las mitocondrias dentro de las proyecciones sensoriales del conclusión de nervio cutáneo. Por lo tanto, se desarrolló una técnica para visualizar y cuantificar las mitocondrias dentro de las fibras nerviosas de intraepidermal (IENFs), las extremidades distales de los aferentes sensoriales del ganglio de raíz dorsal. La técnica combina fluorescencia inmunohistoquímica específica mitocondrial y etiquetas fibra de nervio con microscopia confocal de la serie z adquisición de señales con software de análisis de imagen en 3D de gran alcance para medir la distribución del nervio específico mitocondrias de las biopsias del sacador cutáneo humano para lograr este objetivo.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

las biopsias del sacador de la piel fueron obtenidas de sujetos que fueron reclutados de una red de gran atención primaria comunitaria en el centro de Diabetes de la Universidad de Utah (Salt Lake City, UT). Este estudio fue aprobado por la Junta de revisión institucional de la Universidad de Michigan y el cumplimiento de los principios de la declaración de Helsinki. Se obtuvo consentimiento informado de cada sujeto antes de la prueba por escrito.

1. inmunohistoquímica de fluorescencia

  1. preparar las biopsias del sacador de intraepidermal fibra nerviosa inmunohistoquímica:
    1. piel de 3 mm realizar biopsias por médico personal y la biopsia todo en 1.5 mL Zamboni ' s solución de fijación (2% paraformaldehído, 0.3% saturada de ácido pícrico en tampón fosfato salino (PBS), pH 7,4) a 4 ° C durante la noche.
    2. Lavar las muestras con una solución de sacarosa al 30% en PBS a 4 ° C durante 16-24 h o hasta que la muestra se hunde.
    3. Muestras de incrustar en la temperatura óptima de corte compuesto (OCT) utilizando un cryomold. La biopsia de 3 mm todo con la epidermis hacia abajo en el molde y llenar el molde con aproximadamente 2 mL de octubre congelar el molde en hielo seco. Tienda a-80 ° C hasta que esté listo para usar.
    4. Corte de 50 μm de espesor con un criostato cortes transversales y almacena en los pocillos de una placa de 96 pozos utilizando como solución de almacenamiento de información de anticongelante de 180 μl por pocillo (30% de etilenglicol, glicerol 30% en PBS). Las siguientes instrucciones son para 8 pocillos de una placa bien 96. Mancha de las secciones de cada sitio de la biopsia que son 200-300 μm de uno al otro.

día 1:

  1. saciar no específicas de etiquetado del corneum del estrato:
    1. placa de etiqueta de 96 pocillos como se muestra en la figura 1.
    2. Pipetear 150 μL de solución de potenciador de señal común para reducir el atascamiento no específico de anticuerpos secundaria 34 , 35 en cada pozo. Transferencia de secciones en la solución de potenciador de señal utilizando un asa de inoculación.
      Nota: tenga cuidado al trabajar con el tejido para evitar daño o desgarro de las secciones de tejido. Mantener en la solución de potenciador de señal durante 30 minutos a temperatura ambiente en un rocker plano.
    3. Preparar enjuague pozos en las filas 2 y 3 de la placa de 96 pocillos añadiendo 150 μL de 1 x de tampón fosfato salino (PBS) en cada pocillo.
    4. Transferir cuidadosamente las secciones en la fila 2 y enjuague de PBS 1 x durante 10 min a temperatura ambiente.
    5. Enjuague una segunda vez en PBS 1 x durante 10 min a temperatura ambiente (fila 3).
  2. Prepare 5% albúmina de suero bovino (BSA) bloqueo de solución:
    1. Prepare 5 bloqueo de solución que contiene 5% de BSA y 0,3% de Triton X 100 (TX-100) en 0.1 M PBS (ver tabla 1) mientras que las secciones están incubando en solución de potenciador de señal. BSA no va en la solución fácilmente. Solución de Vortex hasta que BSA se disuelva completamente.
    2. Preparar bloqueo pozos en fila 4 de la placa de 96 pocillos, agregar 150 μL de BSA 5% bloquea la solución en cada pocillo.
    3. Transferencia de secciones en pocillos individuales de BSA 5% solución de bloqueo e incubar secciones en 5% BSA bloqueo solución para 1-2 h a temperatura ambiente en un rocker plano.
  3. Preparar BSA 1% Enjuague solución y la dilución de anticuerpos primarios:
    1. Prepare 1% solución de enjuague que contiene 1% de BSA y 0.3% TX-100 en 0.1 M PBS (ver tabla 2) mientras que las secciones son Incubar en la solución al bloqueo 5% BSA. BSA no va en la solución fácilmente. Solución de Vortex hasta que BSA se disuelva completamente.
    2. Diluir anticuerpos primarios en solución de enjuague de BSA 1% mientras que las secciones están incubando en solución al bloqueo 5% BSA.
      1. 1.500 μl de solución de anticuerpo primario y añadir a cada uno en fila 5.
      2. Diluir los anticuerpos primarios: Utilice la etiqueta específica del nervio, conejo policlonales anti-proteína gen producto 9.5 (PGP9.5) a 1:1, 000. Use la etiqueta específica de las mitocondrias, el ratón anticuerpos de E2/E3bp monoclonal anti-piruvato deshidrogenasa (PDH) a 1: 100 en 1% de BSA enjuague solución.
  4. Anticuerpo primario preparación:
    1. Pipetear 150 μL de anticuerpo primario en cada bien en la fila 5 de la placa de 96 pozos.
    2. Con la herramienta lazo, transferencia de secciones de la solución de bloqueo (fila 4) en la fila que contiene el anticuerpo primario de 5.
    3. Envolver la placa firmemente con parafilm para evitar que se sequen.
    4. Colocar las muestras en el plano del eje de balancín a temperatura ambiente durante 1 h y luego incubar las muestras a 4 º c en un plano del eje de balancín durante una noche.

día 2:

  1. enjuagar las muestras:
    1. preparar pozos de enjuague en las filas 6, 7 y 8 de la placa de 96 pocillos añadiendo 150 μL de BSA 1% Enjuague solución en cada pocillo.
    2. Transferencia de secciones en la primera solución de enjuague BSA 1% (fila 6) e incubar 1 h a temperatura ambiente. Repita el enjuague dos veces más por incubación de las secciones de BSA 1% solución de enjuague en las filas 7 y 8 de 1 h a temperatura ambiente.
  2. Diluir los anticuerpos secundarios en BSA 1% Enjuague solución:
    1. hacer 1.500 μl de solución de anticuerpo secundario mientras que las secciones están incubando en el último aclarado de BSA 1% Enjuague solución (fila 8).
    2. Diluir anticuerpos secundarios: para PGP9.5 (anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado fluorescente verde, 1: 1000), de la PDH (rojo fluorescente conjugado cabra anti-ratón, 1:1, 000) en el 1% de BSA enjuague solución.
  3. Preparación de anticuerpo secundario:
    1. Pipetear 150 μL del anticuerpo secundario en fila 9 de la placa de 96 pozos.
    2. Suavemente, transferir las secciones de 1% de BSA enjuague solución (fila 8) en los pocillos de anticuerpo secundario (fila 9).
    3. Con parafilm, envolver la placa firmemente para evitar que se sequen. Cubrir con papel de aluminio. Coloque las muestras en el plano del eje de balancín a temperatura ambiente durante 1 h y luego incubar las muestras a 4 ° c en un plano del eje de balancín durante una noche.

día 3:

  1. preparación limpiar 1 x PBS por filtración a través de un filtro de 0,22 μm:
    1. Pipetear 150 μL del filtrado 1 x PBS en fila 10, 11 y 12.
    2. Transferencia de muestras a fila 10 y enjuague de 1 x PBS por 1 h a temperatura ambiente. Cubra la placa de 96 pocillos con papel de aluminio y coloque en un plano del eje de balancín durante el enjuague. Repetir filtrada 1 x enjuague de PBS dos veces más durante 1 h a temperatura ambiente en las filas 11 y 12.
  2. Preparar portaobjetos para el montaje de las secciones de tejido:
    1. depositar 50 μl de filtrado 1 x PBS en una diapositiva.
    2. Sección de transferencia de 1 x PBS (fila 12) en los años 50 μl de la gota. Coloque la sección en la gota de PBS por desplegar el tejido y lo aplana suavemente el portaobjetos de vidrio. Retire el exceso PBS con una pipeta de vidrio para evitar diluir el reactivo de montaje. No toque las secciones con el bulbo de cristal.
    3. Pipeta de 1 - 2 gotas de reactivo de montaje con DAPI directamente encima de la sección de la diapositiva del microscopio usando con cuidado para no perturbar la orientación de la sección. Coloque suavemente un cubreobjetos de vidrio de 50 mm x 24 mm #1.5 microscopio sobre la sección de.
    4. Eliminar cualquier burbuja de aire que se formaron mientras coloca el cubreobjetos y limpie el exceso de líquido fuera de los bordes del cubreobjetos. Preparar una diapositiva nueva y repetir el montaje prOcess para cada sección.
    5. Cura seco los medios de montaje colocando las diapositivas en la oscura noche a temperatura ambiente. Transfiera los portaobjetos a 4 ° C para a corto plazo (1-2 semanas) o a-20 ° C para almacenamiento a largo plazo (más de 2 semanas).
      Nota: Controles negativos omitieron anticuerpos primarios para PGP9.5 o PDH en paso 1.4.2.2 y no muestran distinguible etiquetado de nervios o de las mitocondrias en la epidermis. Se realizan controles positivos para la PDH anticuerpo para probarlo etiquetas todas las mitocondrias (datos no mostrados). Los controles positivos fueron realizados en cultivo primario de ratón raíz dorsal ganglio las neuronas que fueron transduced con un baculovirus a las mitocondrias de la etiqueta con una señal de la proteína fluorescente verde (GFP) fijas y teñidas con el anticuerpo de la PDH y rojo fluorescente anticuerpo secundario. Todas las mitocondrias que fueron expresando GFP se co etiquetadas con la etiqueta roja para PDH immunohistochemistry (datos no mostrados).

2. Proyección de imagen confocal

  1. realizar proyección de imagen confocal:
    1. recoger imágenes utilizando un láser de barrido confocal microscopio con 40 X objetivo de inmersión en aceite (1.25 apertura numérica (N.A.)) en un microscopio invertido.
      1. En cada plano focal secuencialmente adquirir señales fluorescentes:
        núcleos: excitación λ = 405 nm, emisión espectral filtro λ = 420-480 nm
        fibras nerviosas: excitación λ = 488 nm, emisión espectral filtro λ = 505-560 nm
        Mitoch Ondria: excitación λ = 543 nm, emisión espectral filtro λ = 606-670 nm
    2. especifique los siguientes parámetros de análisis en el software del microscopio: frecuencia de barrido de 600 Hz con un promedio de marco 2 y zoom de 2.2; resolución de intensidad 12 bits (4096 gris niveles).
      1. Configure el software del microscopio para optimizado resolución lateral (scan resolución = 1.024 x 1.024) y seccionamiento óptico y resolución axial (abertura confocal = 1 unidad de airy (AU) con tamaño de paso z de 210 nm).
        Nota: La resolución resultante de XYZ es 172.2 nm x 172.2 nm nm x 210 con un tamaño de imagen de 176.1 μm x 176.1 μm x 30 a 50 μm.
    3. Activar un escaneado de la señal del nervio (verde-fluorescencia) y ajuste el control de foco de z para encontrar y para fijar la parte superior e inferior planos focales en el software del microscopio que abarcan la señal del nervio dentro de la sección del tejido. La gama total de z es normalmente 30-50 μm para una sección de tejido de 50 μm.
    4. Gire el campo de análisis con el software del microscopio durante un escaneado para que la epidermis se coloca horizontalmente o verticalmente en la imagen.
    5. Escanear cada señal por separado y ajustar el detector (tubo fotomultiplicador, PMT) tensión y desplazamiento a minimizar o quitar cualquier sobre y debajo de pixeles saturados.
      Nota: Tiempos de la exploración con los parámetros anteriores toman aproximadamente 20-40 minutos dependiendo del número de cortes z.

3. visualización en 3D y análisis de las mitocondrias dentro de fibras de nervio humano Intraepidermal

  1. aislar la epidermis 3D:
    1. duplicar la imagen original y utilizar la máxima intensidad proyección (ver enfoque extendido) de la imagen para identificar y aislar la epidermis.
    2. Utilizar una región de herramienta de interés para trazar a lo largo de los bordes superiores e inferiores de la epidermis para eliminar áreas no deseadas como la capa córnea y la dermis que están ausentes de las fibras nerviosas intraepidermal. Cultivo para esta selección.
  2. Deconvolución de uso en el nervio y señales fluorescentes mitocondriales:
    Nota: deconvolución ayuda a restaurar la integridad de las señales fluorescentes. La restauración en este protocolo se llama deconvolución ciega porque utiliza las señales fluorescentes en las imágenes para determinar cuánto difundir las señales de su fuente original (extensión de punto de función). El proceso mejora señal resolución reasignando la señal propagación hacia su lugar de origen.
    1. Calcular un punto extendido función (PSF) para la señal del nervio fluorescente verde (verde-fluorescencia) con los parámetros siguientes:
      1. sistema PSF calculada confocal. Establecer índice de refracción medio en apertura numérica y 1.515 a 1.25. Sistema agujero de alfiler del detector a 1 unidad de Airy (A.U.). La longitud de onda de excitación láser set a longitud de onda nm y emisión 488 a 515 nm.
    2. Calcular una PSF para la señal mitocondrial fluorescente rojo (rojo-fluorescencia) con los parámetros siguientes:
      1. conjunto calculado PSF confocal. Establecer índice de refracción medio en apertura numérica y 1.515 a 1.25. Sistema de agujero de alfiler del detector a 1 AU. La longitud de onda de excitación láser set a 543 nm y emisión de longitud de onda de a 617 nm.
    3. Optimizar las señales fluorescentes del nervio y las mitocondrias por deconvolución usando el PSFs correspondientes mencionadas y la característica de restauración iterativo fijan en 100% de confianza y un límite de 10 ciclos de iteración.
  3. Crear superficies específicas del nervio:
    1. uso el " crear superficie " herramienta para hacer una superficie sólida de los nervios de la verde fluorescente deconvolved secundario etiquetado de la PGP9.5 identificado nervios.
    2. Desactive el " suave " cuentan y utilice la función de la intensidad absoluta para fijar el umbral de la señal del nervio ya que es considerablemente más brillante que la fluorescencia del fondo.
    3. Utilizar la función de intensidad absoluta para fijar el umbral de la señal del nervio ya que es considerablemente más brillante que la fluorescencia del fondo. Valor de umbral bajo para identificar con precisión los nervios.
    4. Filtro hacia fuera de superficies pequeñas, no del nervio según tamaño.
      Nota: Si es necesario, editar manualmente a superficies no-nerviosas adicionales dentro de la " edición " ficha por manteniendo pulsada la tecla CONTROL para seleccionar varios objetos y luego eliminarlos con la tecla Supr.
  4. Aislado del nervio específico señal mitocondrial fluorescente:
    1. Seleccione la ficha editar de la superficie del nervio para ver la " propiedades de máscara " característica. La superficie del nervio creada en pasos 3.3 se utiliza para aislar mitocondrias dentro de esos nervios de señales mitocondriales asociadas con los keratinocytes.
    2. Como la " máscara todos ' botón se abre un " canal de máscara " ventana, elija la señal fluorescente rojo deconvolved desde el menú desplegable " selección de canal " para la señal mitocondrial.
    3. Haga clic en el cuadro para poner una marca de verificación el " canal duplicado antes de aplicar la máscara de " opción.
      4. Botón
    4. clic en el radio en frente de la " constante interior/exterior " opción de la configuración de máscara y haga clic en el cuadro para poner una marca de verificación en la " Set voxel fuera de la superficie a " opción y tipo en 0.00 para el valor. Botón haga clic en Aceptar para crear el nuevo canal que representa señales mitocondriales dentro de la superficie del nervio.
  5. Crear superficies específicas de las mitocondrias:
    1. uso el " crear superficie " herramienta para hacer una superficie sólida de la mitocondria del recién creado canal fluorescente de las señales mitocondriales específicas del nervio de pasos 3.4.
    2. Desmarcar la " lisa " cuentan y seleccionar el " fondo resta " característica para establecer el umbral. Esta característica utiliza contraste local alrededor de la señal mitocondrial para identificar mitocondrias de fondo.
    3. Conjunto de valor lo suficientemente bajo como para identificar con precisión las mitocondrias. En este ejemplo el umbral inferior fue fijado en 2.000 para una escala de 16 bits (65.536).
    4. Filtro de superficie mitocondrial basado en el tamaño. En este ejemplo que el límite de voxel se estableció en 1,0 vóxeles, que es el más bajo límite posible. Si es necesario, editar de forma manual a las superficies no mitocondrias dentro de la " edición " ficha manteniendo la tecla CONTROL para seleccionar varios objetos y luego eliminarlos con la tecla Supr.
      Nota: En ocasiones, el software creará las superficies que no están asociadas con una señal mitocondrial fluorescente distinguible. En estos casos, es posible quitar con la " editar " ficha
  6. Exportación y calcular los valores morfométricos para el análisis:
    1. exportar valores de nervio y superficies mitocondriales de la " estadísticas " ficha para su posterior análisis con el software de hoja de cálculo electrónica.
    2. Exportar los valores de volumen para el nervio y superficies mitocondriales.
    3. Cuenta el número de fibras nerviosas individuales presentes en cada imagen y registre el valor en la hoja de cálculo electrónica.
    4. Para cada imagen, calcular los siguientes valores posibles para el análisis en la hoja de cálculo electrónica:
      1. Resumen los volúmenes para todas las superficies del nervio.
      2. Filtro hacia fuera las superficies mitocondriales específica del nervio debajo de un volumen de menos de 0,02 μm 3 y bin las superficies por tamaño. Por ejemplo, utilizar recipientes como 0.02 - 0.04 0.04 - 0.08 0.08 - 0.16, 0.16 - 0.32, 0.32 - 0.64, 0.64 - 1.28, 1,28 2,56, superior a 2.56 μm 3.
        Nota: El límite inferior de volumen mitocondrial se estableció en 0.02 μm 3 basado en volúmenes anteriormente publicados de mitonchodria 36 , 37 , 38.
      3. Cuenta el número de superficies mitocondriales del nervio específico dentro de cada compartimiento y el número total de las superficies sobre las papeleras (0.02 - mayor de 2.56 μm 3).
      4. Calcular la proporción de superficies mitocondriales del nervio específico en cada compartimiento. Utilice la cuenta por dividido por el número total de las superficies de las mitocondrias de bin.
      5. Suma de los volúmenes de todas las superficies de nervio específico mitocondriales.
      6. Calcular la proporción del nervio con señal mitocondrial dividiendo el volumen superficial nervio total por la suma de los volúmenes de superficie mitocondriales.
      7. Calcular el número de mitocondrias por volumen del nervio dividiendo el volumen de superficie total del nervio por la cuenta de todas las superficies mitocondriales.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Visualización y cuantificación de las mitocondrias dentro de IENFs humanos

Inmunohistoquímica de fluorescencia permite la rotulación simultánea de múltiples señales en las biopsias de la piel humana para visualizar los nervios, las mitocondrias y núcleos. Una placa de 96 pocillos es una manera conveniente de organizar los pasos en el procedimiento de inmunohistoquímica. La figura 1 ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo está diseñado para aislar, cuantificar y analizar el tamaño y la distribución de las mitocondrias del nervio específico dentro de IENFs en 3D de las biopsias de la piel humana. Hay varios pasos críticos en el protocolo. La inmunohistoquímica de fluorescencia flotante está diseñado para la mancha y analizar varias señales en cada muestra, proporcionando una metodología más versátil para la investigación exploratoria44,45. Este procedimiento permite ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

No hay conflictos de intereses.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud subvenciones K08 NS061039-01A2, el programa de investigación de Neurología & descubrimiento y el Instituto A. Alfred Taubman Medical Research en la Universidad de Michigan. Este trabajo utiliza la morfología y la base de análisis de imagen del centro de investigación de la Diabetes de Michigan, financiado por los institutos nacionales de salud beca 5P 90 DK-20572 del Instituto Nacional de Diabetes y digestivo y enfermedades del riñón. Los autores desean agradecer a J. Robinson Singleton y Gordon A. Smith (Universidad de Utah) por su generosa donación de muestras de piel humana.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2% Suministro de fijador para recién llegados de Zamboni, Middleton, WI 1459A2% de paraformaldehído, 0,2% de ácido pícrico saturado en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4
10x solución salina tamponada con fosfato (PBS) Fisher Scientific, Pittsburgh, PABP399-4Para componer 1x PBS
Image-iT FX Signal EnhancerThermoFisher Scientific, Waltham, MassachusettsI36933mejora las señales de colorante Alexa Fluor al reducir la unión no específica
Anticuerpo del producto de gen antiproteico 9.5 (policlonal de conejo)Proteintech Group Inc. Rosemont, IL14730-1-APabreviado como PGP9.5, sustituye al descontinuado AbD Serotec (Cat. Nº 7863-0504) anticuerpo
antipiruvato deshidrogenasa E2/E3bp Anticuerpo (monoclonal de ratón)abcam, Cambridge, MAAB110333abreviado como PDH
Anticuerpo secundario anti-ratón de cabra Alexa Fluor 594 conjugadoThermoFisher Scientific, Waltham, MassachusettsA-11034anticuerpo secundario conjugado fluorescente rojo anti-conejo
Anticuerpo secundario Alexa Fluor 488 conjugadoThermoFisher Scientific, Waltham, MassachusettsA-11032anticuerpo secundario fluorescente verde
Albúmina, de suero bovinoSigma-Aldrich, St. Louis, MOA7906-100abreviado como BSA
Triton X- 100Sigma-Aldrich, St. Louis, MOT9284abreviado como TX-100
0.22 µ m FiltroEMD Millipore, Billerica
MA		MILLEX GP SLGP 033NS0.22 µ m Filtro Millipore
Parafilm MFisher Scientific, Pittsburgh, PA13-374-10Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)
Bucle no calibradoFisher Scientific, Pittsburgh, PA22-032092Bucle de inoculación de Decon LeLoop (MP 199-25)
Placa de ensayo de 96 pocillosCorning Incorporated, Corning, NY3603Placa de fondo plano de 96 pocillos
Reactivo antidecoloración Prolong Gold con DAPIThermoFisher Scientific, Waltham, MassachusettsP-36931DAPI tinción de núcleos
Microscopio Cubreobjetos 50 x 24 mmFisher Scientific, Pittsburgh, PA12-544ECubreobjetos
Superfrost Plus Portaobjetos de microscopioFisher Scientific, Pittsburgh, PA12-550-15Portaobjetos de microscopio
Leica SP5 Microscopio confocal de escaneo láserLeica Microsystems, Buffalo Grove, ILSP5Microscopio Confocal
Volocity x64 Software Perkin Elmer, Waltham , MAversión 4.4.0El software Volocity se utiliza para los pasos 3.1 y 3.2 en el protocolo para el procesamiento de imágenes
Imaris x64 Software de análisis tridimensionalBitplane, Concord, MAversión 7.7.1software Imaris se utiliza para los pasos 3.3 a 3.5 en el protocolo para el análisis de imágenes
ExcelMicrosoft, Redmond, WAversión Office 2013El software de hoja de cálculo de Excel se utiliza para el paso 3.6 en el protocolo para resumir las características morfométricas
Compuesto de temperatura de corte óptimaSakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA4583abreviado como OCT
Leica CryostatLeica Biosystems, Buffalo Grove, ILCM1850Criostato para corte 50 y micro; m secciones
CellLight Mitocondrias-GFP, BacMam 2.0ThermoFisher Scientific, Waltham, MassachusettsC10600Se utiliza como control positivo para marcar mitocondrias con una señal fluorescente verde
El

References

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